游敏芳，吳 磊，廖朝美，張依裕，劉若余，譚光輝，李杰章

(1.貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué) 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025； 3.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

長順綠殼雞蛋為貴州省長順縣特產(chǎn)，富含多種維生素，還含有大量腦磷脂、卵磷脂、神經(jīng)磷脂和多種微量元素，被譽(yù)為“雞蛋中的人參”[1]。但是隨著現(xiàn)代規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖的加速發(fā)展，人們把選育的重點(diǎn)放在雞的生長速度和產(chǎn)蛋數(shù)量上，忽略了雞蛋品質(zhì)，導(dǎo)致雞蛋品質(zhì)呈現(xiàn)下降趨勢。雞蛋的品質(zhì)與其蛋殼質(zhì)量息息相關(guān)，蛋殼質(zhì)量的下降給雞蛋行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。DOMINGUEZ等[2]的研究結(jié)果表明，蛋殼缺失或部分脫落的雞蛋很容易受到細(xì)菌污染，影響其雞蛋品質(zhì)。ITPR1基因是影響Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的重要基因，鈣是蛋殼的主要組成成分，機(jī)體對鈣的吸收和利用直接決定了蛋殼的形成與質(zhì)量[3-4]。因此，為了使貴州地方雞品種更加特色化和優(yōu)質(zhì)化，通過研究影響Ca2+通道相關(guān)的基因來改善長順綠殼蛋雞的蛋殼品質(zhì)具有重要意義。RYDR-ITPR是肌醇1，4，5-三磷酸受體(ITPRs)的結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域具有影響鈣通道活性的功能。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)功能的最小結(jié)構(gòu)單位，探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域所對應(yīng)的基因序列的單核苷酸突變位點(diǎn)能更精準(zhǔn)、有效地挖掘發(fā)揮功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。ITPRs是細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的重要通道，能夠引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號的啟動和發(fā)生。ITPRs幾乎存在于所有真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在人類、小鼠、果蠅、錐蟲等體內(nèi)對ITPRs均有研究[5-8]。SERYSHEVA等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ITPRs功能異常會導(dǎo)致Ca2+信號異常，與人類的多種疾病相關(guān)，如動脈粥樣硬化、心肌肥厚、亨廷頓病、偏頭痛、高血壓、阿爾茨海默癥等。ITPRs有ITPR1、ITPR2和ITPR3等3種亞型，其中ITPR1主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，參與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)[10-11]。NAN等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ITPR1能夠維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的水平；CASEY等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ITPR1抑制區(qū)的一種新的功能增益突變會導(dǎo)致人類脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)，改變Ca2+信號模式；李杰章等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ITPR1基因的遺傳變異能夠顯著影響三穗鴨的蛋殼品質(zhì)。近年來，有研究顯示，ITPR1對鴨蛋蛋殼品質(zhì)有顯著影響[15]，但I(xiàn)TPR1對長順綠殼蛋雞蛋品質(zhì)的影響尚未見報道。為此，以長順綠殼蛋雞為研究對象，在ITPR1基因的RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域?qū)ふ襍NP位點(diǎn)，研究其多態(tài)性對蛋殼質(zhì)量的影響，以期為進(jìn)一步探明該基因在長順綠殼蛋雞中的生物學(xué)功能和育種價值提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試驗(yàn)動物和蛋殼指標(biāo)

同批出雛、健康無病的70只長順綠殼蛋雞飼養(yǎng)于貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院農(nóng)場，在相同飼養(yǎng)環(huán)境和同等營養(yǎng)水平下飼養(yǎng)至45周齡后，選擇66只健康無病的長順綠殼蛋雞，逐只收集并記錄其產(chǎn)蛋情況，根據(jù)《家禽生產(chǎn)學(xué)》[16]中的方法測定蛋形指數(shù)、蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋質(zhì)量、蛋殼質(zhì)量等蛋殼指標(biāo)。對66只長順綠殼蛋雞進(jìn)行翅靜脈采血1.5 mL，保存于無抗凝劑的生化管中。

1.2 主要試劑和儀器

全血基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖、10×TBE電泳緩沖液、無菌ddH2O均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPCR Master Mix試劑、DL2000 Marker均購自重慶擎科生物科技有限公司。

主要儀器：梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、化學(xué)發(fā)光熒光全自動分析成像儀(上海山富科學(xué)儀器有限公司)、蛋殼強(qiáng)度測定儀和蛋品質(zhì)分析儀(北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司)、核酸濃度檢測儀(美國NanoDrop公司)。

1.3 引物合成及PCR擴(kuò)增

登陸 GenBank 數(shù)據(jù)庫查找雞ITPR1基因序列(NC_006099.5)，運(yùn)用在線軟件Primer Premier 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)擴(kuò)增RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域g.50863—g.51458區(qū)域的1對引物，F(xiàn)：5′-CGCATCACCTTTCTCTTTCCC-3′，R：5′-AGGCATTGACTTACTTCGTTTCA-3′，擴(kuò)增序列長度為596 bp，擴(kuò)增區(qū)域包含部分17內(nèi)含子、18外顯子、18內(nèi)含子、19外顯子和部分19內(nèi)含子，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增體系：RNase-free H2O 7 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸40 s。4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件DNAStar中的EditSeq、MegAlign程序和Chromas軟件，結(jié)合人工校對法對測序結(jié)果進(jìn)行比對、查找 SNP 位點(diǎn)，計(jì)算其基因型頻率、等位基因頻率、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)和χ2值，利用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)SNP位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)鑒定

對測序結(jié)果進(jìn)行比對和查找，共發(fā)現(xiàn)3個SNP位點(diǎn)，位于18內(nèi)含子上的g.18853584 G>T和g.18853600 A>G，位于19外顯子上的g.18853848 C>T(圖1)。3個SNP位點(diǎn)均產(chǎn)生3種基因型，g.18853848 C>T位于CDS區(qū)第1 920位，編碼氨基酸的密碼子由UCU突變?yōu)閁CC，但沒有引起編碼絲氨酸的密碼子發(fā)生改變，屬于同義突變。

圖1 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)的序列比對Fig.1 The sequence alignment of the SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain

2.2 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)遺傳特性

對長順綠殼蛋雞ITPR1基因的測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。由表1可知，g.18853584 G>T的優(yōu)勢基因型為GG，基因型頻率為0.485，優(yōu)勢等位基因?yàn)镚，等位基因頻率為0.682，多態(tài)信息含量(PIC)為0.340；g.18853600 A>G的優(yōu)勢基因型為AA，基因型頻率為0.485，優(yōu)勢等位基因?yàn)锳，等位基因頻率為0.682，PIC為0.340；g.18853848 C>T的優(yōu)勢基因型為CC，基因型頻率為0.561，優(yōu)勢等位基因?yàn)镃，等位基因頻率0.720，PIC為0.323，均為中度多態(tài)。卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，3個突變位點(diǎn)均未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.3 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡、單倍型及雙倍型分析

對長順綠殼蛋雞ITPR1基因的3個SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果見表2和表3。由表2可知，g.18853584 G>T與g.18853600 A>G的D′值為1.000，且R2值為1.000，說明這2個突變位點(diǎn)完全連鎖不平衡； g.18853848 C>T與g.18853584 G>T和g.18853600 A>G之間的D′值均為0.367，且R2值均為0.024，小于0.330，不存在強(qiáng)連鎖不平衡。由表3可知，3個SNP位點(diǎn)存在H1、H2、H3和H4等4種單倍型；共檢測到H1H1、H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H3H3和H3H4等7種雙倍型，其中H1H1頻率最高，為0.242；其次是H1H2和H1H3，均為0.197；H3H3頻率最低，為0.046。

表2 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)間連鎖不平衡分析Tab.2 Analysis of linkage disequilibrium among SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain

表3 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)的單倍型和雙倍型分析Tab.3 Haplotypes and diplotypes analysis of the SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain

2.4 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)與長順綠殼蛋雞蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

長順綠殼蛋雞ITPR1基因3個SNP與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見表4。由表4可知，位于19外顯子上的g.18853848 C>T突變顯著影響蛋殼厚度，其中TT、CC基因型的蛋殼厚度顯著高于TC基因型(P<0.05)，位于18內(nèi)含子上的g.18853584 G>T和g.18853600 A>G突變對蛋殼品質(zhì)的影響均沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

表4 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)與長順綠殼蛋雞蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析Tab.4 Correlation analysis between SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain and eggshell quality in Changshun green-eggshell chicken

3個SNP位點(diǎn)的雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表5。由表5可知，雙倍型H3H3個體的蛋殼厚度和強(qiáng)度均顯著高于其他雙倍型(P<0.05)，其他雙倍型各指標(biāo)間差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，綜合各指標(biāo)，雙倍型H3H3個體的蛋殼指標(biāo)優(yōu)于其他雙倍型。

表5 ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域SNP位點(diǎn)雙倍型與長順綠殼蛋雞蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析Tab.5 Correlation analysis between diplotypes of SNP sites of the ITPR1 gene RYDR-ITPR domain and eggshell quality in Changshun green-eggshell chicken

3 結(jié)論與討論

RYDR-ITPR是IP3Rs鈣通道的結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域具有影響鈣通道活性的功能。本試驗(yàn)在長順綠殼蛋雞ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域中設(shè)計(jì)1對引物進(jìn)行SNP檢測，發(fā)現(xiàn)3個SNP位點(diǎn)，分別是位于18內(nèi)含子上的g.18853584 G>T和g.18853600 A>G，位于19外顯子上的g.18853848 C>T，3個SNP位點(diǎn)均表現(xiàn)為中度多態(tài)，表明ITPR1基因在長順綠殼蛋雞群體中變異較大，在以后的育種工作中具有較大的研究價值。3個SNP位點(diǎn)均未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，說明即使在人工選擇、遷移和遺傳漂變中也存在動態(tài)平衡。3個突變位點(diǎn)共產(chǎn)生4種單倍型和7種雙倍型，理論上應(yīng)有10種雙倍型。另外3種雙倍型沒有檢測到，可能是因?yàn)樵谧匀贿x擇或人工選育過程中被淘汰，也有可能是由于本試驗(yàn)樣本數(shù)不足導(dǎo)致沒有出現(xiàn)另外3種雙倍型。

DUAN等[17]研究結(jié)果表明，在ITPR1基因的外顯子4、44、51、55中找到5個SNP位點(diǎn)，都與蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度顯著相關(guān)。本試驗(yàn)在長順綠殼蛋雞ITPR1基因的外顯子19上有了新的發(fā)現(xiàn)，位于外顯子19上的g.18853848 C>T突變，但沒有引起編碼絲氨酸的密碼子發(fā)生改變，屬于同義突變。但SAUNA等[18]研究發(fā)現(xiàn)，雖然同義突變并不會改變基因編碼氨基酸序列，但是它可以通過影響DNA與調(diào)節(jié)因子的結(jié)合、mRNA穩(wěn)定性、與核糖開關(guān)等相關(guān)專一性配體的相互作用等機(jī)制，導(dǎo)致mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)豐度產(chǎn)生一定差異。LIU等[19]研究結(jié)果也表明，同義突變也能通過改變mRNA的穩(wěn)定性而對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生重要影響。此外，譚光輝等[20]研究發(fā)現(xiàn)，三穗鴨ORAI1基因中3個SNP位點(diǎn)同義突變后，其mRNA二級結(jié)構(gòu)和自由能均發(fā)生了改變，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也會受到影響。本試驗(yàn)中，SNP位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，g.18853848 C>T突變對蛋殼厚度產(chǎn)生了顯著影響，另外，此位點(diǎn)的原序列基因型為CC，突變?yōu)門T基因型之后對蛋殼厚度的影響均高于CC和TC基因型，這有可能是人為選育或自然選擇的結(jié)果，表明g.18853848 C>T突變對長順綠殼雞蛋的蛋殼品質(zhì)的影響是正面的，對之后的長順綠殼蛋雞選育工作中具有參考價值。WEN等[21]在白來航雞GALNT1基因的內(nèi)含子2、ZNF536基因的內(nèi)含子3中，均發(fā)現(xiàn)了與蛋殼質(zhì)量、蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度有關(guān)的突變位點(diǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，位于18內(nèi)含子上的g.18853584 G>T和g.18853600 A>G突變對蛋殼品質(zhì)沒有顯著影響，但其對蛋殼厚度、蛋形指數(shù)、蛋殼強(qiáng)度、蛋質(zhì)量和蛋殼質(zhì)量的影響也是積極的，對綠殼蛋雞的蛋殼品質(zhì)也有一定的參考意義。雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，H3H3雙倍型對蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度都有顯著影響，且從關(guān)聯(lián)分析結(jié)果可以看出，雙倍型對蛋殼品質(zhì)的影響大于單個SNP位點(diǎn)。譚光輝等[22]在研究ATF4基因多態(tài)性與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析中，也揭示了3個SNP位點(diǎn)共同對蛋殼品質(zhì)的影響效應(yīng)大于單個SNP位點(diǎn)。

綜上，長順綠殼蛋雞ITPR1基因RYDR-ITPR結(jié)構(gòu)域中19外顯子上的g.18853848 C>T突變對長順綠殼蛋雞的蛋殼品質(zhì)有顯著影響。此外，H3H3雙倍型對蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度均有顯著影響，可作為改善蛋殼品質(zhì)的潛在遺傳標(biāo)記。