李文鵬，陶 冶，趙素雅，牛秋紅

(南陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061)

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，全國(guó)播種面積約333.3萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量500多萬(wàn)t，經(jīng)濟(jì)總值近400億元[1]。近年來(lái)，棉花黃萎病(Verticilliumwilt)在我國(guó)三大產(chǎn)棉區(qū)呈發(fā)展態(tài)勢(shì)，全國(guó)棉田黃萎病流行約200萬(wàn)hm2，導(dǎo)致棉田常年減產(chǎn)15%～20%，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元，嚴(yán)重危及我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-4]。

棉花黃萎病為土傳性維管束型病害，其致病菌為大麗輪枝菌(VerticillumdahliaeKleb)，具有分布廣、危害重、傳播途徑廣泛的特點(diǎn)。大麗輪枝菌在土壤中通過(guò)根系損傷部位侵入棉花[5]，引起棉花葉片黃化枯萎、維管束褐化、蕾鈴脫落，甚至整株死亡，嚴(yán)重影響棉花的纖維品質(zhì)和產(chǎn)量[6]。目前，生產(chǎn)上主要通過(guò)種植抗(耐)病品種、調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等途徑防控棉花黃萎病。

國(guó)內(nèi)外防治棉花黃萎病的主要方法有抗性育種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治技術(shù)等。近年來(lái)，我國(guó)棉花抗黃萎病新品種的選育取得一定進(jìn)展，但西北內(nèi)陸棉區(qū)的多數(shù)品種仍表現(xiàn)為低耐或感病水平，不能滿足生產(chǎn)需求[7]。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于糧棉爭(zhēng)地、耗時(shí)費(fèi)力等因素，輪作倒茬很難實(shí)施?；瘜W(xué)防治方面，傳統(tǒng)農(nóng)藥溴甲烷等因其對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生威脅，已經(jīng)被逐漸淘汰，而新的化學(xué)農(nóng)藥防治譜不足，且對(duì)環(huán)境仍然存在潛在的不良影響[8]，棉花黃萎病的防控任重而道遠(yuǎn)。生物防治主要是通過(guò)部分微生物及微生物代謝產(chǎn)物的作用，對(duì)農(nóng)作物病蟲(chóng)害進(jìn)行防治的技術(shù)和方法[9-10]，因其具有持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、安全、殘留少等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的重視，被公認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒╗11]。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，部分芽孢桿菌、放線菌和真菌對(duì)植物病原菌具有較好的拮抗作用[12-15]。但生物防治存在生防制劑效果不穩(wěn)定的短板，由于不同地區(qū)的微生物種群不同，生防菌株能否在土壤中或者植株內(nèi)很好地定殖是其發(fā)揮抗病作用的前提[16-17]。劉海洋等[18]從土壤中篩選出1株芽孢桿菌AL7，發(fā)現(xiàn)其不但對(duì)大麗輪枝菌有較好的抑制效果，而且在土壤中也有較強(qiáng)的定殖能力，其極強(qiáng)的定殖和殺菌能力，為該生防菌的普及提供更大的可能性。李社增等[19]研發(fā)的枯草芽孢桿菌NCD-2，對(duì)黃萎病的防效超過(guò)50%。該菌株已被開(kāi)發(fā)為防治棉花黃萎病的微生物農(nóng)藥。

我國(guó)棉花栽培品種以陸地棉為主，雖然其產(chǎn)量可觀但其抗黃萎病能力較差，而海島棉黃萎病抗性突出而持久[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物以及內(nèi)生菌也參與了棉花對(duì)黃萎病的抵抗[22-23]。目前，對(duì)棉花根際黃萎病菌拮抗菌的研究多集中在菌種篩選和防效測(cè)定方面，對(duì)其拮抗機(jī)制以及相應(yīng)基因、蛋白質(zhì)資源挖掘的研究較少。鑒于此，以黃萎病抗性棉(海島棉，海7124)根部土壤為材料篩選黃萎病拮抗菌株，并利用盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其生防效果。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入挖掘拮抗菌株對(duì)黃萎病菌的拮抗機(jī)制，分離出其主要的毒力蛋白并對(duì)其抗菌性能進(jìn)行檢測(cè)，為生防菌防治棉花黃萎病提供理論支持和基因資源，并為下一步開(kāi)發(fā)棉花黃萎病生防工程菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試大麗輪枝菌V991，由河南大學(xué)植物逆境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蔡應(yīng)繁教授惠贈(zèng)。供試棉花品種為感病棉品種TM-1。供試土樣采自南陽(yáng)師范學(xué)院西區(qū)黃萎病抗性棉品種海7124棉田。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集與土壤拮抗菌株的分離 采集黃萎病抗性棉(海7124)根系土壤，自然風(fēng)干，土壤微生物的分離采用梯度稀釋法[24]，稱取5 g土樣置于裝有50 mL無(wú)菌水的三角瓶中，37 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，混合液置于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min[25]，取1 mL混合液依次稀釋，分別取10-4、10-5、10-6、10-7共4個(gè)梯度的稀釋液100 μL涂布LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，挑取形態(tài)、大小、色澤不同的單菌落，經(jīng)多次劃線純化后編號(hào)，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選 采用傳統(tǒng)的對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[26]，在PDA培養(yǎng)基平板中央接種大麗輪枝菌，25 ℃倒置培養(yǎng)3 d備用。待測(cè)菌株37 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h，取100 μL菌液均勻涂布LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，用直徑1 cm的打孔器打出細(xì)菌菌餅，在接種大麗輪枝菌PDA平板兩側(cè)對(duì)稱放置，25 ℃恒溫對(duì)峙培養(yǎng)10 d，測(cè)量抑菌直徑，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，并按照下列公式計(jì)算抑菌率[27]。抑菌率=(對(duì)照組真菌菌落生長(zhǎng)直徑-處理組真菌菌落生長(zhǎng)直徑)/對(duì)照組真菌菌落生長(zhǎng)直徑×100%。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定 將篩選得到的拮抗菌株劃線轉(zhuǎn)接于LB平板中，觀察菌落形態(tài)，利用掃描電子顯微鏡觀察其單細(xì)胞形態(tài)。用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取菌株的基因組DNA，并以通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[28]。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa公司)克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。將得到的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合序列相似性比對(duì)結(jié)果對(duì)拮抗細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4 拮抗菌株對(duì)盆栽棉花黃萎病的防效測(cè)定 接種篩選得到拮抗菌株于LB液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)活化過(guò)夜，按1%的比例轉(zhuǎn)接于150 mL LB中，37 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h。8 000 r/min常溫離心20 min收集菌體，無(wú)菌水重懸菌體，調(diào)節(jié)至1.0×107cfu/mL。按每100 g土壤加10 mL菌液的比例配制試驗(yàn)用土樣，分別在接菌處理(試驗(yàn)組)和未接菌處理(對(duì)照組)的土壤中播種經(jīng)消毒處理的感病棉種子。待棉花兩片子葉完全展開(kāi)后，通過(guò)灌根的方式向試驗(yàn)組每盆澆灌10 mL菌液，對(duì)照組澆灌10 mL無(wú)菌水。待棉花長(zhǎng)至二葉一心后，傷根接種大麗輪枝菌，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察棉花的發(fā)病情況。按以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄黃萎病的發(fā)病級(jí)別，0級(jí)：健康植株；1級(jí)：1片以下或部分子葉變黃或壞死發(fā)??；2級(jí)：2片子葉變黃或壞死；3級(jí)：1片真葉變黃或壞死的現(xiàn)象；4級(jí)：2片或2片以上真葉變黃或壞死，并按照下列公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[29]。

病情指數(shù)=∑(級(jí)值×株數(shù))/(最高級(jí)值×總株數(shù))×100；

防治效果=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0軟件。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有顯著水平定為P<0.05，所有結(jié)果為3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2.5 拮抗菌株發(fā)酵濾液對(duì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響 收集拮抗菌株的發(fā)酵上清液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾制成無(wú)菌發(fā)酵濾液備用。取3 mL無(wú)菌發(fā)酵濾液與3 mL 1.0×106～1.0×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸液混合均勻(試驗(yàn)組)，另取3 mL LB液體培養(yǎng)基與3 mL 1.0×106～1.0×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸液混合均勻(對(duì)照組)，25 ℃、180 r/min振蕩混合培養(yǎng)12 h，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，鏡檢觀察大麗輪枝菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)情況[30]，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%。

1.2.6 拮抗菌胞外代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性檢測(cè) 取拮抗菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液各1 mL置于2支1.5 mL的EP管中，1支置于100 ℃水浴鍋中加熱10 min，另1支置于25 ℃水浴鍋中加熱10 min備用。制備1.0×106～1.0×107cfu/mL的大麗輪枝菌孢子懸液，按5%的比例將孢子懸液加到PDA培養(yǎng)基中混合均勻，制備大麗輪枝菌孢子固體培養(yǎng)基平板，待平板完全冷卻凝固后，在距離培養(yǎng)基邊緣等距處打孔，每孔中分別加200 μL備用的2組無(wú)菌發(fā)酵濾液，并設(shè)置對(duì)照(CK，等量LB液體培養(yǎng)基)，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，觀察真菌孢子萌發(fā)的情況，并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.7 胞外蛋白抑菌活性檢測(cè)及毒力蛋白的確定 收集500 mL拮抗菌株發(fā)酵上清液，設(shè)置300、500、700、900 g/L硫酸銨對(duì)拮抗菌株胞外蛋白進(jìn)行分級(jí)鹽析，溶解收集梯度鹽析粗蛋白溶液，將鹽析的粗蛋白溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。另取200 μL 1.0×106～1.0×107cfu/mL大麗輪枝菌孢子懸液，均勻涂布于PDA平板中，在距離培養(yǎng)基邊緣等距處打孔，每孔中分別加100 μL備用粗蛋白濾液，25 ℃恒溫共培養(yǎng)5 d，觀察大麗輪枝菌孢子萌發(fā)情況，并對(duì)不同梯度鹽析蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)，將潛在的活性蛋白切膠，送至上海顥澤生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定、比對(duì)分析，確定毒力蛋白的種類。

1.2.8 毒力蛋白的基因克隆 采用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取與拮抗菌株同源性較高已有細(xì)菌的毒力蛋白(經(jīng)1.2.7確定)基因序列，根據(jù)基因序列的保守區(qū)用DNAMAN嘗試設(shè)計(jì)引物，對(duì)拮抗菌株毒力蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增。其上游引物P1∶5′-ATGTTTTATCGTATGAAACG-3′,下游引物P2∶5′-TTTTTTTGTATAGCGCACCC-3′。反應(yīng)體系30 μL：基因組1 μL、上下游引物各1 μL、2×Taqplus Master Mix 15 μL、去離子水12 μL。PCR擴(kuò)增條件：97 ℃預(yù)變性5 min，97 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa公司)克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。用含有酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ的上下游引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒。

1.2.9 毒力蛋白的表達(dá)、純化及抗菌活性測(cè)試 用內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對(duì)重組克隆質(zhì)粒和pET-32a(+)質(zhì)粒雙酶切，并構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PET-β，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21，探索最佳的IPTG誘導(dǎo)條件。8 000 r/min常溫離心20 min，收集表達(dá)后菌體，進(jìn)行超聲波破碎，破碎上清進(jìn)行Ni-NTA介質(zhì)金屬螯合親和層析，對(duì)目標(biāo)蛋白梯度洗脫，洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。收集重組毒力蛋白探究其抗菌活性，將重組毒力蛋白與大麗輪枝菌孢子懸液混合培養(yǎng)，探究重組毒力蛋白對(duì)孢子萌發(fā)的影響，利用平板對(duì)峙試驗(yàn)研究重組毒力蛋白對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。并以昆布多糖為底物，采用DNS法對(duì)重組毒力蛋白活性進(jìn)行測(cè)定，以每分鐘反應(yīng)生成相當(dāng)于1 μg葡萄糖的量為1個(gè)酶活單位(U,QB 2583—2003)。

酶活力(U/mL)=葡萄糖生成量(mg)×1 000/時(shí)間(min)×酶液加入量(mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離及篩選

利用稀釋涂布平板法分離得到56株待測(cè)菌株，采用對(duì)峙平板法對(duì)得到的56株待測(cè)菌株進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，其中，編號(hào)為HT-7的菌株對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果較為顯著，抑菌率高達(dá)56%(圖1)，故對(duì)其進(jìn)行更深一步的研究。

圖1 菌株HT-7對(duì)大麗輪枝菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of strain HT-7 against V.dahlia

2.2 拮抗菌株的分類鑒定

經(jīng)革蘭氏染色確定菌株HT-7為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌落形態(tài)呈圓形凸起，表面光滑濕潤(rùn)，掃描電子顯微鏡觀察其單細(xì)胞形態(tài)為無(wú)鞭毛的桿狀細(xì)菌，細(xì)胞大小為(1.2～2.0)μm×(0.5～0.7)μm(圖2)。對(duì)其16S rDNA序列同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株HT-7與BacillusvanilleaXY18T的同源性高達(dá)到99.86%，初步鑒定其為芽孢桿菌屬。

圖2 菌株HT-7的細(xì)胞形態(tài)

2.3 菌株HT-7對(duì)盆栽棉花黃萎病的防效

未經(jīng)菌株HT-7處理的對(duì)照組棉花，傷根接種大麗輪枝菌2周后出現(xiàn)典型的棉花黃萎病發(fā)病性狀，葉片泛黃、葉片邊緣出現(xiàn)燒焦?fàn)罡煽荩仓晡?，部分葉片用手輕觸即掉落。經(jīng)拮抗菌株HT-7處理后的試驗(yàn)組棉花在傷根接種大麗輪枝菌2周后長(zhǎng)勢(shì)較好，未出現(xiàn)染病現(xiàn)象。4周后，對(duì)照組棉花出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，部分棉花植株葉片全部脫落，而試驗(yàn)組棉花僅有少部分出現(xiàn)葉片脫落的現(xiàn)象。采集部分試驗(yàn)組正常棉花的葉片觀察，未發(fā)現(xiàn)葉柄變黑的發(fā)病癥狀(圖3)。

圖3 拮抗菌株HT-7 對(duì)棉花黃萎病的拮抗效果(傷根接種4周后)

分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組棉花的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表1)，經(jīng)菌株HT-7處理的棉花傷根接種大麗輪枝菌后發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組，其發(fā)病率降低58.33%，病情指數(shù)降低82.64%，防治效果高達(dá)82.58%。結(jié)果表明，拮抗菌株HT-7能有效防治大麗輪枝菌對(duì)棉花的侵害。

表1 拮抗菌株HT-7對(duì)棉花黃萎病的拮抗效果

2.4 菌株HT-7發(fā)酵濾液對(duì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響

將菌株HT-7的無(wú)菌發(fā)酵濾液與大麗輪枝菌孢子混合培養(yǎng)12 h后鏡檢觀察，經(jīng)菌株HT-7處理的試驗(yàn)組大麗輪枝菌孢子短粗膨大，且有聚集現(xiàn)象，大部分孢子無(wú)法正常萌發(fā)，菌絲較少。未經(jīng)菌株HT-7處理的對(duì)照組大麗輪枝菌孢子萌發(fā)正常，菌絲生長(zhǎng)旺盛(圖4)。

統(tǒng)計(jì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)情況，結(jié)果表明，與HT-7無(wú)菌發(fā)酵濾液混合培養(yǎng)的大麗輪枝菌孢子(試驗(yàn)組)不能正常萌發(fā)，萌發(fā)率僅為12.1%，遠(yuǎn)低于對(duì)照組(37.9%)，表明菌株HT-7發(fā)酵濾液對(duì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。

圖4 液體環(huán)境中HT-7對(duì)大麗輪枝菌孢子及菌絲的影響

2.5 菌株HT-7拮抗因子熱穩(wěn)定性檢測(cè)

對(duì)分別經(jīng)100 ℃、25 ℃水浴加熱10 min的菌株HT-7發(fā)酵濾液進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，平板共培養(yǎng)5 d后觀察發(fā)現(xiàn)，25 ℃水浴加熱10 min的發(fā)酵濾液對(duì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，在平板中產(chǎn)生明顯的抑菌圈，其抑菌圈直徑達(dá)18 mm，而100 ℃水浴加熱10 min后的發(fā)酵濾液?jiǎn)适б志芰?，在平板中未出現(xiàn)透明圈(圖5)，證明菌株HT-7的主要毒力因子為熱不穩(wěn)定性物質(zhì)。

圖5 HT-7胞外產(chǎn)物對(duì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響

2.6 胞外蛋白的抑菌活性檢測(cè)及毒力蛋白的確定

對(duì)不同質(zhì)量濃度硫酸銨鹽析沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)質(zhì)量濃度硫酸銨鹽析沉淀的蛋白質(zhì)均有抗菌活性，其中500 g/L和700 g/L硫酸銨鹽析蛋白質(zhì)抑菌效果最佳(圖6a)。將各質(zhì)量濃度下鹽析出的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)(圖6b)，對(duì)毒力蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，初步判定其為β-1,3-1,4-葡聚糖酶。

a.不同質(zhì)量濃度硫酸銨鹽析蛋白質(zhì)的抑菌結(jié)果；b.鹽析蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳結(jié)果，其中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 Marker，1、2、3、4分別表示300、500、700、900 g/L硫酸銨鹽析獲得的蛋白質(zhì)條帶a.Bacteriostatic test results of protein obtained by gradient precipitation of ammonium sulfate;b.SDS-APGE results of protein obtained by gradient procipitation of ammonium sulfate,M means protein molecular weight marker,1—4 indicate protein solution obtained by gradient precipitation of 300,500,700,900 g/L ammonium sulfate respectively

2.7 菌株HT-7毒力蛋白β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆

根據(jù)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(圖7)，產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示，該基因片段全長(zhǎng)大小732 bp，編碼243個(gè)氨基酸。將該毒力蛋白氨基酸序列遞交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，該氨基酸序列與B.velezensis的糖基水解酶家族蛋白質(zhì)氨基酸序列(WP-038460387)同源性為99.59%，與B.amyloliq-uefaciens的β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AAO43052)同源性為97.94%，說(shuō)明從菌株HT-7中成功擴(kuò)增得到毒力因子β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因。

M：Marker 5000；1—3：β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因

2.8 菌株HT-7毒力蛋白的表達(dá)、純化及活性檢測(cè)

用內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-β進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠電泳結(jié)果在5 000 bp和750 bp處各出現(xiàn)1條單一明亮條帶(圖8)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主E.coliBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

M：Marker 5000；1—5：質(zhì)粒pET-β的雙酶切結(jié)果

通過(guò)探索，確定轉(zhuǎn)化后的宿主E.coliBL21在0.4 mmol/L IPTG條件下30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h效果最佳。超聲波破碎宿主菌細(xì)胞，上清進(jìn)行Ni-NTA介質(zhì)金屬螯合親和層析并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，在200 μmol/L咪唑下洗脫得到1條單一蛋白質(zhì)條帶(圖9a)。在重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶的平板抑菌試驗(yàn)中，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶有效抑制大麗輪枝菌菌絲的延伸，導(dǎo)致其無(wú)法正常生長(zhǎng)，通過(guò)測(cè)量，抑菌率達(dá)25%(圖9b)。

a.重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶SDS-GAGE電泳結(jié)果,其中，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marber,1表示重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶；b.重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶抑菌檢測(cè)結(jié)果a.SDS-PAGE results of recombinant β-1,3-1,4-glucanase,M means protein molecular weight marker,1 indicates recombinant β-1,3-1,4-glucanase;b.Bacteriostatic test result of recombinant β-1,3-1,4-glucanase

由圖10可見(jiàn)，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶對(duì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)具有顯著的抑制效果，未經(jīng)重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶處理的對(duì)照組孢子萌發(fā)正常且菌絲生長(zhǎng)旺盛，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶處理的試驗(yàn)組孢子萌發(fā)受到顯著抑制，大部分孢子無(wú)法正常萌發(fā)，部分孢子出現(xiàn)孢壁破裂的現(xiàn)象?？梢?jiàn)，β-1,3-1,4-葡聚糖酶是菌株HT-7發(fā)揮生防作用的重要毒力因子，由DNS法測(cè)得純化后的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶活高達(dá)23.5 U/mL。

圖10 重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶對(duì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的影響

3 結(jié)論與討論

棉花黃萎病是典型的土傳維管束病害，病原菌大麗輪枝菌寄宿植物種類繁多[31]，微菌核抗逆性強(qiáng)，能在土壤中長(zhǎng)時(shí)間存活，輪作和倒茬很難降低土壤中微菌核的數(shù)量；再加上大麗輪枝菌的致病能力強(qiáng)、變異性大，一般的抗病棉品種又難以獲得，故很難通過(guò)物理手段來(lái)防治黃萎病[32]。化學(xué)農(nóng)藥對(duì)減輕黃萎病對(duì)棉花的危害雖然有一定的效果，但帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題也日益嚴(yán)重。近年來(lái)，以生物防治為主的綜合防治措施逐漸受到人們的重視，該方法具有綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢(shì)，在黃萎病的防治中具有非常重要的意義[33]。其利用生防菌株的競(jìng)爭(zhēng)作用、拮抗作用和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等機(jī)制發(fā)揮生物防治效果，是防治棉花黃萎病的重要途徑之一。

芽孢桿菌因具有耐受能力強(qiáng)、繁殖速度快、分布范圍廣等多方面優(yōu)點(diǎn)，成為防治棉花黃萎病的重要生防菌。目前發(fā)現(xiàn)多種芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病具有拮抗效果，金利容等[34]從棉花植株內(nèi)分離篩選出了對(duì)棉花黃萎病具有拮抗作用的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)；翟楓[35]從棉花土壤中篩選得到的解淀粉芽孢桿菌對(duì)棉花有一定的促生作用；文雨婷等[36]從土壤中篩選得到多株酵母菌對(duì)棉花黃萎病具有拮抗作用。隨著研究的不斷深入，拮抗芽孢桿菌的部分毒力因子也不斷被發(fā)掘出來(lái)，如徐婷等[37]成功地從貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)中分離到抑制大麗輪枝菌的毒力因子。宗英等[38]在1株貝萊斯芽孢桿菌抑制禾谷鐮刀菌的研究中發(fā)現(xiàn)，其揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原真菌有一定的拮抗作用。袁洪水等[39]從分離的拮抗菌株中均純化得到對(duì)大麗輪枝菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)都有較好抑制作用的毒力蛋白。此外，胡明[40]利用硫酸銨鹽析的方法成功地從棉花黃萎病拮抗細(xì)菌BDT-25的發(fā)酵液中分離純化出抗菌多肽類物質(zhì)，此抗菌多肽能明顯抑制大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)。

由于不同地區(qū)的地理環(huán)境、氣候等差異，導(dǎo)致目前發(fā)現(xiàn)的黃萎病拮抗菌株未能大面積普及并投入應(yīng)用。本研究從黃萎病抗性棉(海7124)根系土壤中分離得到1株對(duì)棉花黃萎病具有良好防治效果的菌株Bacillussp.HT-7，豐富了棉花黃萎病拮抗菌株的資源。通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)，均驗(yàn)證了其對(duì)大麗輪枝菌具有較強(qiáng)的拮抗性能；通過(guò)混合孢子試驗(yàn)、毒力因子的熱穩(wěn)定性檢測(cè)及抗菌蛋白活性跟蹤等試驗(yàn)，最終確定β-1,3-1,4-葡聚糖酶是菌株HT-7發(fā)揮拮抗性能的主要毒力因子，并在重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶抗菌試驗(yàn)中取得了不錯(cuò)的抑菌效果，為棉花黃萎病的生物防治提供了理論依據(jù)。