龍琴，杜美霞，龍俊宏，何永睿，鄒修平，陳善春

轉(zhuǎn)錄因子CsWRKY61對柑橘潰瘍病抗性的影響

龍琴，杜美霞，龍俊宏，何永睿，鄒修平，陳善春

（西南大學(xué)/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家柑桔品種改良中心，重慶 400712）

【背景】柑橘潰瘍?。╟itrus bacterial canker，CBC）是世界柑橘產(chǎn)業(yè)上危害最嚴(yán)重的病害之一，由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種（subsp.，）引起，在國內(nèi)外被列為檢疫對象。由于柑橘分子病理研究相對滯后，導(dǎo)致可供利用的抗性基因資源相對匱乏。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物抵御生物和非生物脅迫反應(yīng)，前期研究發(fā)現(xiàn)柑橘WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能在調(diào)控寄主抗病反應(yīng)中起著重要作用?！灸康摹客ㄟ^對超量表達(dá)、和轉(zhuǎn)基因晚錦橙（）的潰瘍病抗性進行評價，明確這些基因在柑橘響應(yīng)潰瘍病菌侵染中的生物學(xué)功能和抗病育種價值。進一步利用RNA-Seq解析調(diào)控的信號通路。【方法】利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行柑橘遺傳轉(zhuǎn)化，獲得超量表達(dá)、和的晚錦橙；利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的表達(dá)水平以及拷貝數(shù)；以非轉(zhuǎn)基因植株為對照，采用離體針刺接種評價轉(zhuǎn)基因植株對潰瘍病的抗性；通過比較超量表達(dá)和野生型植株的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，探究提高柑橘潰瘍病抗性的內(nèi)在機制?！窘Y(jié)果】分別構(gòu)建了CAMV啟動子控制、和表達(dá)的植物表達(dá)載體，通過組織化學(xué)染色和PCR鑒定分別獲得了6、8和6株轉(zhuǎn)基因晚錦橙。轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的表達(dá)量有不同程度的提高，大部分轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的拷貝數(shù)為1，只有超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病抗性顯著增強，其病斑面積明顯小于野生型植株，而超量表達(dá)和的轉(zhuǎn)基因植株抗病性與野生型相比無明顯差異。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中生物脅迫相關(guān)途徑（包括病原入侵的感知、活性氧爆發(fā)、轉(zhuǎn)錄因子、防御基因、激素、細(xì)胞壁和次生代謝等）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑（主要是激酶受體）均被顯著激活?！窘Y(jié)論】超量表達(dá)能夠激活與生物脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的途徑，增強柑橘對潰瘍病的抗性；在柑橘抗病育種中存在潛在的應(yīng)用價值。

柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種；柑橘潰瘍病；CsWRKY61；超量表達(dá)；抗病性；轉(zhuǎn)錄組測序

0 引言

【研究意義】柑橘潰瘍病（citrus bacterial canker，CBC）是一種柑橘檢疫性細(xì)菌病害，由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種（subsp.，）引起[1]。其病原菌幾乎能夠危害柑橘的所有組織，嚴(yán)重時會造成落葉和落果，進一步發(fā)展將會導(dǎo)致枝梢枯死和幼樹死亡等，嚴(yán)重威脅世界柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2-3]。目前，只能通過化學(xué)農(nóng)藥或集中銷毀苗木進行防控，但其勞動力和經(jīng)濟成本較高。培育抗病栽培品種是解決該問題的根本途徑[4]。隨著CRISPR/Cas9等現(xiàn)代分子育種技術(shù)的興起，利用分子技術(shù)定向快速改良柑橘抗病性，創(chuàng)制新型抗性品種成為可能。然而，由于柑橘分子病理研究相對滯后，導(dǎo)致可供利用的抗性基因資源相對匱乏，目前柑橘抗病分子育種進展依然緩慢。因此，迫切需要挖掘柑橘源潛在的抗病基因，通過基因工程技術(shù)獲得抗?jié)儾〉姆N質(zhì)，為育種提供材料。【前人研究進展】WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，是調(diào)控植物多方面過程的信號網(wǎng)絡(luò)的組成部分[5]，含有一個或兩個WRKY結(jié)構(gòu)域是其最顯著的特征。WRKY結(jié)構(gòu)域大約由60個氨基酸殘基組成，其N端是絕對保守的，氨基酸序列為WRKYGQK，在C端則含有一個C2H2或C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的類型，可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3個家族。Ⅰ類含兩個WRKY結(jié)構(gòu)域；Ⅱ類和Ⅲ類含一個WRKY結(jié)構(gòu)域。其中Ⅰ類和Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子均為C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)：C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H；Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鋅指結(jié)構(gòu)基序跟前兩類有所不同，為C2HC型：C-X7-C-X23-H-X1-C。此外，第Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子又可進一步分為5個亞類：Ⅱ（a）、Ⅱ（b）、Ⅱ（c）、Ⅱ（d）、Ⅱ（e）[6]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在擬南芥中有74個成員[7]，水稻中有109個成員[8]，毛白楊中有100個WRKY基因[9]，在辣椒的基因組中有71個WRKY成員[10]，在蘋果中鑒定出了116個WRKY基因[11]。在甜橙基因組中成功注釋了348個WRKY基因或片段。WRKY轉(zhuǎn)錄因子特異性識別并結(jié)合W-box“TTGACC/T”順式作用元件，通過調(diào)控下游基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)植物的衰老、形態(tài)建成、生物和非生物脅迫響應(yīng)等多方面的進程[12-16]。目前，已有大量關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控寄主植物抗病方面的研究，主要集中在擬南芥和水稻中[17-25]。如擬南芥中WRKY31、WRKY22、WRKY50、WRKY72、WRKY70、WRKY18、WRKY40和WRKY60參與寄主多種免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，其中WRKY70是水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）信號途徑相互拮抗的核心調(diào)節(jié)點，在植物抗病、抗蟲、抗逆防御中起著重要作用[26-28]。在柑橘中，一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子（WRKY22、WRKY45和WRKY31等）在調(diào)控寄主抗病反應(yīng)中的可能功能已有報道，比如可能是柑橘潰瘍病效應(yīng)子flg22的一個靶標(biāo)基因，參與柑橘的抗病反應(yīng)[29]。然而，更多的研究是關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與激素或非生物脅迫的調(diào)節(jié)[30-32]。【本研究切入點】WRKY家族基因在植物抗病育種中具有廣泛的應(yīng)用前景，但在柑橘中鮮有研究。前期在高抗品種四季橘（）和高感品種紐荷爾甜橙（）的比較研究中發(fā)現(xiàn)，3個WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因、和與柑橘潰瘍病抗性相關(guān)。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究以高感品種晚錦橙（）為材料，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)探究、和在柑橘潰瘍病菌侵染中的生物學(xué)功能。【擬解決的關(guān)鍵問題】探明在柑橘中超量表達(dá)、和對柑橘潰瘍病抗性的影響，明確這些基因在柑橘響應(yīng)潰瘍病菌侵染中的生物學(xué)功能和抗病育種價值。

1 材料與方法

試驗于2016年7月至2018年9月在西南大學(xué)/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家柑桔品種改良中心完成。

1.1 試驗材料

柑橘遺傳轉(zhuǎn)化所用的材料為晚錦橙上胚軸，其種子采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家柑桔品種改良中心資源圃，其無菌上胚軸的準(zhǔn)備參考文獻[33]。超量表達(dá)目的基因的植物表達(dá)載體為pLGN（本實驗室改造），含抗性和報告融合基因，以方便轉(zhuǎn)基因植株的篩選，同時含有多克隆位點以利于外源基因的插入。植物遺傳轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌為EHA105菌株（本實驗室凍存）。

植物基本培養(yǎng)基為MS（Murashige and Skoog），購自Phyto Technology Laboratories?；常規(guī)酶制品購自大連TaKaRa公司；質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；植物總DNA和總RNA提取試劑盒購自Aidlab公司；實時熒光染料購自BIORAD公司；PGEM-T克隆載體購自Promega公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

、和的編碼序列參見文獻[34]。設(shè)計引物（表1），利用PCR在目的基因的5′和3′端分別添加合適的酶切位點，T-克隆到PGEM-T上，陽性克隆經(jīng)PCR和測序驗證。然后，通過酶切連接技術(shù)將、、插入pLGN載體中CaMV啟動子的下游，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體p35S:CsWRKY50、p35S:CsWRKY61和p35S:CsWRKY72。將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體通過電激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中用于柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化。

表1 基因克隆和轉(zhuǎn)基因植株鑒定所用引物

1.3 柑橘遺傳轉(zhuǎn)化

晚錦橙上胚軸遺傳轉(zhuǎn)化方法參照王軍政[35]的方法進行。經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后外植體置于共培養(yǎng)基（添加2 mg·L-1BA、0.5 mg·L-1IAA、1 mg·L-12,4-D、100 mg·mL-1AS的MS培養(yǎng)基）培養(yǎng)2—3 d；然后轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基（添加2 mg·L-1BA、0.5 mg·L-1IAA、500 mg·L-1carb，50 mg·L-1km的MS培養(yǎng)基）上進行抗性芽再生和篩選培養(yǎng)。待抗性芽長到一定程度（1 cm以上），取葉片進行組織化學(xué)染色及插入基因的PCR鑒定，篩選陽性植株，將幼芽嫁接到晚錦橙實生苗上，于MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到接穗長至5 cm左右，再嫁接到枳橙實生苗上，于溫室中培養(yǎng)。

1.4 GUS組織化學(xué)染色

參照J(rèn)efferson等[36]的方法進行組織化學(xué)染色。具體操作如下：取抗性芽的葉片，放入已加入5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸（X-Gluc）染色液的試管中，于37℃避光保溫過夜。染色完成后用95%的乙醇脫色，直至非轉(zhuǎn)基因植株葉片的葉綠素完全褪去呈現(xiàn)白色，統(tǒng)計染色情況，并拍照記錄。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定

按照Aidlab公司DNA提取試劑盒（cat.No.DN15）方法提取陽性植株的基因組DNA。為了避免植株內(nèi)源目的基因的干擾，根據(jù)序列和目的基因序列設(shè)計目的基因表達(dá)盒的擴增（圖1、表1），用于目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中整合的鑒定。PCR反應(yīng)體積25 μL，反應(yīng)條件：98℃ 1 min；98℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 20 s，30次循環(huán)；72℃ 5 min。擴增完成后將PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠（1.0%，W/V）中進行電泳分析。

1.6 外源基因拷貝數(shù)的實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

參照許蘭珍等[37]定量PCR方法，分析轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)。以柑橘內(nèi)源單拷貝基因脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因為內(nèi)參基因[38]，以前期確認(rèn)的單拷貝轉(zhuǎn)基因植株GA-5為對照，利用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。按照BIORAD公司的定量PCR試劑盒（cat.No.170-8882AP）說明書進行目的基因的拷貝數(shù)分析。反應(yīng)體積20 μL，反應(yīng)條件：95℃ 3 min；94℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 10 s，40次循環(huán)；72℃10 min。以GA-5植株為對照，采用2-ΔΔCt法計算轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的拷貝數(shù)。

1.7 目的基因表達(dá)水平的實時熒光定量PCR分析

用Aidlab公司的 EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（cat.No.RN09）提取柑橘葉片的總RNA。嚴(yán)格參照BIORAD公司的iScriptTMcDNA合成試劑盒（cat.No.170-8891）說明書合成cDNA第一鏈。使用BIORAD公司的定量PCR試劑盒（cat.No.170- 8882AP）進行目的基因的相對定量分析。所用定量PCR引物見表2[34]，使用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 3 min；94℃ 10 s，56℃ 10 s，72℃ 10 s，共40次循環(huán)；72℃ 10 min。選用柑橘為內(nèi)參基因，以非轉(zhuǎn)基因柑橘植株為對照，采用2-ΔΔCt法計算轉(zhuǎn)基因柑橘植株中目的基因的相對表達(dá)量。

表2 實時熒光定量PCR所用引物序列

1.8 轉(zhuǎn)基因植株的潰瘍病抗性評價

借鑒李云鋒等[39]的方法分離、純化和培養(yǎng)柑橘潰瘍病菌。選取成熟的新葉（每個株系選取6片），洗凈表面灰塵，用75%酒精消毒表面，再用無菌水沖洗3—5遍，于無菌培養(yǎng)皿中保濕備用。將潰瘍病菌培養(yǎng)至OD600為0.5，再用無菌水稀釋1 000倍至濃度為5×105cfu/mL，備用。采用離體針刺法接種[40]，用直徑0.5 mm無菌針頭沿葉片中脈兩邊針刺24孔，每邊12孔。每孔添加1 μL潰瘍病菌菌液，接種后用含有無菌水棉球覆蓋葉柄保濕，石蠟帶封嚴(yán)培養(yǎng)皿，于28℃，16 h·d-1光照培養(yǎng)10 d。每天觀察發(fā)病情況并照相記錄。以野生型（wild-type，WT）為對照，利用ImageJ 2.0軟件計算接種10 d后病斑面積。根據(jù)病斑面積大小，將病情分為6個級別：0級（S＜0.25 mm2）；1級（0.25 mm2≤S＜0.75 mm2）；2級（0.75 mm2≤S＜1.25 mm2）；3級（1.25 mm2≤S＜1.75 mm2）；4級（1.75 mm2≤S＜2.25 mm2）；5級（S≥2.25 mm2）。分別對每級所包含的病斑數(shù)目進行統(tǒng)計，然后計算各株系的病情指數(shù)（disease index，DI），DI=100×Σ（各級病斑數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值）/（病斑總數(shù)×最大級數(shù)）。

1.9 轉(zhuǎn)錄組測序分析

取轉(zhuǎn)基因和野生型植株的葉片，液氮速凍，干冰運輸送上海美吉公司進行轉(zhuǎn)錄組測序和信息學(xué)分析。以甜橙基因組序列（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/ index.php）為參考，利用TopHat2軟件對測序數(shù)據(jù)進行比對分析。使用FPKM計算基因的表達(dá)水平。以非轉(zhuǎn)基因植株為對照，采用DESeq2軟件進行表達(dá)差異的顯著性分析，以錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR＜0.01，差異倍數(shù)|log2fold change|＞1作為差異表達(dá)基因（DEG）的篩選標(biāo)準(zhǔn)。利用非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（non-redundant protein database，Nr）、非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫（NCBI non- redundant nucleotide database，Nt）、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（SwissProt protein database，SwissProt）、蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫（Cluster of Orthologous Groups，COG）、蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫（Protein families database，Pfam）、基因本體論數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO）和東京基因與基金組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對基因進行功能注釋。

為了詳細(xì)分析調(diào)控的代謝途徑和基因，對獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進一步進行MapMan功能注釋（http://mapman.gabipd.org/web/guest/mercator）。以|log2fold change|＞1且-value校正值padj＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)可視化MapMan途徑和功能，并使用Benjamin-Hochberg方法（FDR≤0.05）對MapMan途徑和功能進行Wilcoxon雙尾檢測，篩選顯著富集的途徑、功能和基因[41]。

1.10 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值，采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理、標(biāo)準(zhǔn)偏差計算及圖表繪制，差異顯著性分析采用SPSS 20.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 超量表達(dá)CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72晚錦橙植株的獲得

用組成型表達(dá)的CaMV啟動子控制、和的表達(dá)，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體p35S:WRKY50（W50）、p35S:WRKY61（W61）、p35S:WRKY72（W72）（圖1），利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行晚錦橙的遺傳轉(zhuǎn)化。首先通過組織化學(xué)染色及外源的PCR擴增對卡那霉素抗性植株進行篩選（圖2-A、2-B）。然后通過對目的基因的PCR擴增進一步鑒定陽性植株（圖2-C）。為了避免內(nèi)源目的基因的干擾，PCR擴增的上下游引物分別設(shè)計在啟動子和目的基因上（表1、圖1）。經(jīng)鑒定共獲得W50、W61和W72轉(zhuǎn)基因植株各6、8和6株，具體見圖2-A。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)及目的基因表達(dá)水平

以為內(nèi)參基因，轉(zhuǎn)基因植株GA-5為對照，對組織化學(xué)染色和PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株進行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，W50-1、W50-3，W61-1、W61-3、W61-5、W61-6、W61-7、W61-9、W61-11、W61-12和W72-5、W72-7、W72-10株系為單拷貝；W50-5和W72-1、W72-2株系為雙拷貝（表3）。

以野生型植株為對照，利用qRT-PCR分析、、在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，所有W50轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)水平均顯著高于野生型，其中W50-3和W50-5表達(dá)水平相對較高；同樣，所有W61轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)水平均顯著高于野生型，其中W61-5、W61-6、W61-9和W61-11的表達(dá)相對較高；5株W72轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)水平顯著高于野生型，1株W72轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)低于野生型，其中W72-2和W72-5的表達(dá)相對較高（圖3）。結(jié)合外源基因插入的拷貝數(shù)分析結(jié)果，選擇表達(dá)水平相對較高的W50-5，W61-5、W61-9、W61-11和W72-5進行重點研究。

表3 轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)實時熒光定量PCR分析

2.3 轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病抗性評價

對目的基因表達(dá)水平顯著提高的轉(zhuǎn)基因株系進行潰瘍病抗性評價。結(jié)果表明，在所獲得的轉(zhuǎn)基因植株中，只有超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)明顯的抗性增強，其病斑明顯小于野生型植株，而超量表達(dá)和的轉(zhuǎn)基因植株病斑大小與野生型相比無明顯差異（圖4-A）。

35S：花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子Cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV 35S)；GUS:NPTII：β-葡萄糖醛酸酶GUS報告基因與卡那霉素NPTII抗性基因的融合基因The fusion gene of β-glucuronidase and neomycin phosphotransferase genes；nos：胭脂堿合酶基因的轉(zhuǎn)錄終止序列The terminator of the nopaline synthase gene。單箭頭表示轉(zhuǎn)基因植株鑒定用引物 Arrow indicates the primer used to determine transgenic plant

A：轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)染色圖GUS histochemical staining of transgenic plants；B：轉(zhuǎn)基因植株NPTII擴增結(jié)果Amplification results of NPTII in transgenic plants；C：部分轉(zhuǎn)基因植株目的基因的PCR擴增PCR amplification of target genes in some transgenic plants。M：DNA marker；P：質(zhì)粒模板plasmid template；+：已鑒定的陽性植株對照Identified positive plant control

采用雙尾t檢驗確定與WT對照相關(guān)的統(tǒng)計學(xué)意義（*：P＜0.05；**：P＜0.01）。圖4同

為了對超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的抗性水平進行定量比較，進一步對其病斑面積和病情指數(shù)進行了統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，針刺接種10 d，W61-3和W61-7株系的病斑面積與野生型無明顯差異，其余株系的病斑面積均顯著小于野生型，其中W61-5、W61-6、W61-9和W61-11株系的病斑面積相對較?。▓D4-B）。此外，病情指數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果顯示，W61-3和W61-7株系的病情指數(shù)與野生型無明顯差異，而其余株系的病情指數(shù)均顯著降低（圖4-C）。結(jié)果表明，與野生型相比轉(zhuǎn)基因植株對潰瘍病的抗性顯著提高，其中W61-5、W61-6、W61-9和W61-11株系的抗性水平相對較高。

2.4 超量表達(dá)CsWRKY61對植株表達(dá)譜的影響

對抗性水平最高的轉(zhuǎn)基因株系W61-5和W61-9進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。聚類熱圖分析表明，W61-5和W61-9株系中基因表達(dá)譜與野生型相比有明顯的差異（圖5-A）。此外，與野生型相比，W61-5和W61-9株系分別有1 671和2 933個差異表達(dá)基因。在W61-5中有1 116個基因上調(diào)表達(dá)，555個基因下調(diào)表達(dá)，在W61-9中有2 010個基因上調(diào)表達(dá)，923個下調(diào)表達(dá)，其中有1 469個差異表達(dá)基因在兩株轉(zhuǎn)基因植株中具有相似的表達(dá)譜（圖5-B、5-C）。MapMan pathway富集分析顯示，兩株轉(zhuǎn)基因植株中生物脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑均被顯著激活，以W61-9株系變化更加明顯（圖5-D）。結(jié)果表明，超量表達(dá)正調(diào)控植物應(yīng)答生物脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

進一步分析W61-9株系中與生物脅迫相關(guān)的差異基因情況。結(jié)果顯示，有85個差異基因直接與生物脅迫相關(guān)，且有75個基因顯著上調(diào)表達(dá)。這些基因包括病原入侵的感知、活性氧爆發(fā)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子和防御基因。另外，許多與脅迫相關(guān)的激素信號、細(xì)胞壁和次生代謝等基因也顯著上調(diào)表達(dá)（圖6、表4）。

對W61-9株系中與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的差異基因情況進一步分析。結(jié)果顯示，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中主要是激酶受體基因受到影響，其中有10類激酶受體基因受到顯著影響，且絕大部分都是上調(diào)表達(dá)，包括富亮氨酸重復(fù)、奇異果甜蛋白、未知功能域（DUF 26）、植物凝集素、葉銹病LRK10 like、S-基因座、胞壁相關(guān)激酶、賴氨酸基序、褶皺樣和受體樣胞漿激酶（圖7-A、表4）。此外，與翻譯后修飾及蛋白質(zhì)降解相關(guān)的基因也絕大部分上調(diào)表達(dá)（圖7-B、表4）。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的潰瘍病抗性評價

A：差異基因表達(dá)分析聚類熱圖。紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào)Cluster heat map for differential gene expression analysis. Red and blue indicate up-regulated and down-regulated, respectively。B：差異基因表達(dá)分析火山圖。紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)Volcano map of differential gene expression analysis. Red and green indicate up-regulated and down-regulated, respectively。C：差異基因表達(dá)分析維恩圖。中間重疊部分代表共有的差異基因Venn diagram of differential gene expression analysis. The middle overlap represents the shared genes。D：差異表達(dá)基因的MapMan可視化分析。紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào)MapMan visual analysis of differential genes. Red and blue indicate up-regulated and down-regulated, respectively

表4 轉(zhuǎn)基因植株中生物脅迫相關(guān)的差異基因情況

該圖為MapMan注釋的轉(zhuǎn)基因株系W61-9中與生物脅迫相關(guān)的差異基因情況。每個方塊表示一個基因，紅色表示上調(diào)表達(dá)，綠色表示下調(diào)表達(dá)The figure shows the differential genes involved in biotic stress of W61-9 transgenic line by MapMan. Each square represents one gene. Red and green indicate up-regulated expression and down-regulated expression, respectively

A：W61-9中受體樣激酶相關(guān)基因的表達(dá)情況Differential expression of receptor-like kinase-related genes of W61-9 line；B：W61-9中蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況Differential expression of genes related to protein metabolism of W61-9 line

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，參與調(diào)節(jié)植物對生物、非生物脅迫的響應(yīng)以及生長發(fā)育等多方面進程[12]。在柑橘中，Ayadi等發(fā)現(xiàn)和在所有非生物脅迫條件下都可能上調(diào)，但是唯一被病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因，表明其在柑橘抗病性方面有潛在價值；此外還發(fā)現(xiàn)可能與黃龍病的防御反應(yīng)相關(guān)[31]。在水稻中，的過表達(dá)增強了水稻對紫外線的耐受性和抗病性[42]；過表達(dá)和增加了水稻對稻瘟病和白葉枯的敏感性，而抑制表達(dá)能夠增強其抗病性[21]。在擬南芥中，超量表達(dá)能夠提高對灰霉病的抗性，敲除該基因增加了對灰霉菌的敏感性[43]；異源表達(dá)來自葡萄的提高了轉(zhuǎn)基因植株對白粉病的抗性[44]。在楊樹中，轉(zhuǎn)的毛白楊對黑斑病的耐受性增強；過表達(dá)的毛果楊對潰瘍病的抗性提高[45]。而在本研究中，過表達(dá)增強了轉(zhuǎn)基因柑橘對潰瘍病的抗性，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病性方面有很大的應(yīng)用價值。

本研究發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)通過激活轉(zhuǎn)基因植株中生物脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑來提高潰瘍病抗性。這些基因主要涉及病原入侵的感知、活性氧爆發(fā)、轉(zhuǎn)錄因子和防御基因，與脅迫相關(guān)的激素信號、細(xì)胞壁和次生代謝等基因，以及受體樣激酶基因。有研究表明，病原菌侵染后感病部位會出現(xiàn)活性氧的急劇上升，從而誘導(dǎo)植物發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，這種“活性氧爆發(fā)”被稱作是細(xì)胞水平上寄主植物對病原菌侵染的最早應(yīng)答之一，對寄主抗病性有積極作用[46-47]。大量研究顯示轉(zhuǎn)錄因子、激素信號、細(xì)胞壁和次生代謝相關(guān)基因在植物抗病性中發(fā)揮重要作用[48-52]。Gao等研究表明對蘿卜皺紋病毒有負(fù)調(diào)控作用，可能參與植物免疫信號通路[53]。在水稻中，被鑒定為稻瘟病抗性基因[54]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)AtWRKY61對多種脅迫都有響應(yīng)，且這種響應(yīng)很可能通過其抑制相關(guān)基因表達(dá)而實現(xiàn)；同時AtWRKY61分別與AtWRKY9和AtWRKY72存在蛋白互作，這種互作可能對其參與調(diào)節(jié)多種脅迫的應(yīng)答反應(yīng)有重要作用[55]。本研究中轉(zhuǎn)錄組測序揭示，有20個WRKY轉(zhuǎn)錄因子受到超量表達(dá)的顯著影響，這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子與CsWRKY61的互作關(guān)系有待深入研究。此外，病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）是寄主植物在受到病原物侵染后誘導(dǎo)表達(dá)豐度最高的一類蛋白，是系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）的分子標(biāo)記。Qiu等[16]研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與PR蛋白存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CsWRKY與CsPR-1相互影響，和的轉(zhuǎn)錄水平在過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因柑橘中明顯上調(diào)[34]。在本研究中，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中絕大部分PR蛋白的表達(dá)顯著提高。這些結(jié)果與超量表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株對潰瘍病的抗性相吻合，但其具體的調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。

Gao等[56]研究表明，可能通過正調(diào)控水楊酸信號途徑，負(fù)調(diào)控茉莉酸信號途徑從而增強對灰霉病的抗性；周鵬飛[34]研究表明，受潰瘍病菌誘導(dǎo)后，的轉(zhuǎn)錄水平在抗病品種四季橘中大幅度提高，而在感病品種紐荷爾臍橙中變化不明顯，表明可能對潰瘍病抗性有積極作用；此外，Bhattarai等[57]發(fā)現(xiàn)WRKY72型轉(zhuǎn)錄因子參與了番茄和擬南芥的基礎(chǔ)免疫以及番茄R基因介導(dǎo)的基因?qū)虻目剐?；Xu等[27]研究表明，接種潰瘍病菌后，隨著接種時間的增加在感病品種紐荷爾臍橙中的表達(dá)量逐漸下降，而在抗病品種四季橘中無明顯變化，推測潰瘍病菌侵染通過下調(diào)的表達(dá)，可能對介導(dǎo)的抗病過程有抑制作用。然而，本研究中抗病性評價結(jié)果顯示超量表達(dá)和的植株病斑面積與野生型對照無明顯差異，推測可能是轉(zhuǎn)基因植株太少未篩選到抗性株系，或者轉(zhuǎn)基因植株通過其他途徑抵消了和發(fā)揮的作用。

4 結(jié)論

能夠激活與生物脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的途徑，是柑橘抗病育種中有潛在應(yīng)用價值的抗性基因。研究結(jié)果為柑橘潰瘍病抗性遺傳改良提供了重要基因資源。

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Effect of Transcription Factor CsWRKY61 on Citrusbacterial Canker Resistance

LONG Qin, Dumeixia, Long JunHong, Heyongrui, Zou XiuPing, Chen ShanChun

(National Center for Citrus Variety Improvement, Citrus Research Institute, Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712)

【Background】Citrus bacterial canker (CBC) caused bysubsp.() is one of the most serious citrus diseases in the world, which is a quarantine disease. Due to the relatively backward research of citrus molecular pathology, the available resistance gene resources are relatively scarce. WRKY transcription factor is involved in plant responses to biotic and abiotic stress. The previous study has found that citrus WRKY transcription factor may play an important role in regulating host disease resistance response.【Objective】The objective of this study is to evaluate the canker resistance of transgenic citrus () with over-expression of,and, clarify the biological function and disease resistance breeding value of these genes in citrus in response to. RNA-seq was further used to analyze the signaling pathway regulated by.【Method】-mediated method was used to obtain transgenic citrus plants with over-expression of,and. Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression level and copy number of the target genes.pinprick inoculation was used to evaluate the resistance of transgenic plants to canker disease. The molecular mechanism ofimproving citrus bacterial canker resistance was investigated by transcriptome sequencing analysis of over-expressionand wild-type (WT) plants.【Result】The plant expression vectors of CAMVpromoter controlling the expression of,andwere constructed, and 6, 8 and 6 transgenic lines were obtained bystaining and PCR identification, respectively. The expression of the target gene in transgenic plants increased in different degrees. The copy number of exogenous genes in most transgenic plants was 1. Only the transgenic plants with over-expression ofhad significantly enhanced canker disease resistance, and the lesion area was significantly smaller than that of WT plants, while over-expression ofandtransgenic plants had no significant difference in disease resistance compared with WT. Transcriptomics analysis showed that biotic stress related pathways (including pathogen recognition, respiratory burst, transcription factors, defense genes, hormones, cell wall and secondary metabolism, etc.) and signal transduction-related pathways (mainly kinase receptors) were significantly activated in over-expression oftransgenic plants. 【Conclusion】Over-expression ofcan activate pathways related to biotic stress and signal transduction, enhance citrus bacterial canker resistance. It is suggested thathas potential application value in citrus disease resistance breeding.

subsp.(); citrus bacterial canker; CsWRKY61; over-expression; disease resistance; transcriptome sequencing

2019-09-26；

2019-11-13

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD1000300）、重慶市自然科學(xué)基金-博士后基金（cstc2019jcyj-bshX0024）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（XDJK2019C027）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-26）

龍琴，E-mail：longlong860923@126.com。通信作者鄒修平，E-mail：zouxiuping@cric.cn。通信作者陳善春，E-mail：scchen@cric.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）