趙雪，王鋒，王文靜，劉曉峰，卞士權(quán)，劉艷華，劉新民，杜詠梅，張忠鋒，張洪博

煙草轉(zhuǎn)錄后剪切元件NRSE1與融合表達(dá)后的可變剪切

趙雪1，王鋒2，王文靜1，劉曉峰1，卞士權(quán)1，劉艷華1，劉新民1，杜詠梅1，張忠鋒1，張洪博1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101；2西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716）

【目的】煙草（L.）堿性幾丁質(zhì)酶基因在低煙堿突變體（和）中存在轉(zhuǎn)錄后mRNA可變剪切現(xiàn)象，但其可變剪切的發(fā)生機(jī)制仍不清楚。將的可變剪切元件NRSE1（nicotine- synthesis related splicing element 1）與融合表達(dá)，分析NRSE1元件的獨(dú)立可變剪切特性，以揭示其作用機(jī)制?！痉椒ā坷肞CR擴(kuò)增方法獲得cDNA序列中的NRSE1元件片段，并利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了煙草可變剪切元件NRSE1與的融合表達(dá)載體。將融合表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404后，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法培育了表達(dá)NRSE1與融合子的低煙堿突變體和及野生型煙草轉(zhuǎn)基因植株；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)及GUS染色鑒定出陽(yáng)性植株后，利用RT-PCR分析NRSE1與融合表達(dá)后在低煙堿突變體和野生型煙草中的可變剪切特性；對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的幼苗進(jìn)行乙烯（ET）和茉莉酸（JA）處理，通過(guò)GUS染色方法分析ET和JA處理對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中GUS活性的影響，并通過(guò)RT-PCR方法分析ET和JA處理對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中NRSE1與融合子的可變剪切特性影響，以及對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中NRSE1與融合子表達(dá)水平的影響?！窘Y(jié)果】通過(guò)RT-PCR檢測(cè)及GUS染色鑒定出表達(dá)NRSE1元件與融合子的低煙堿突變體和野生型煙草轉(zhuǎn)基因植株；RT-PCR檢測(cè)及測(cè)序分析證明，NRSE1元件與融合表達(dá)后仍能在低煙堿突變體發(fā)生高水平的可變剪切，剪切修飾區(qū)段的序列變化與煙草中的mRNA可變剪切修飾一致；利用ET和JA處理轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行的GUS染色表明，ET和JA處理對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性有不同程度的影響；但利用ET和JA處理轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行的RT-PCR分析表明，ET和JA處理不改變NRSE1元件原有的誘導(dǎo)剪切特性，也不影響轉(zhuǎn)基因植株中NRSE1元件與融合子的表達(dá)水平?！窘Y(jié)論】的可變剪切元件NRSE1與在煙草中融合表達(dá)后，仍能在低煙堿突變體和中發(fā)生高水平的可變剪切；NRSE1在煙草中的可變剪切不依賴的其他mRNA區(qū)段，是煙草發(fā)生可變剪切的獨(dú)立元件；ET和JA處理對(duì)NRSE1元件與融合表達(dá)植株的GUS活性具有一定影響，可能存在翻譯水平的調(diào)控作用。

煙草；；低煙堿突變體；可變剪切；茉莉酸；乙烯

0 引言

【研究意義】煙草病程相關(guān)基因存在轉(zhuǎn)錄后的可變剪切現(xiàn)象[1-5]，因的可變剪切與煙堿代謝相關(guān)，研究mRNA中可變剪切元件（nicotine- synthesis related splicing element 1，NRSE1）的分子剪切特性，對(duì)揭示低煙堿突變體遺傳位點(diǎn)和對(duì)應(yīng)基因的分子調(diào)控機(jī)制有重要價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】煙堿吡咯烷環(huán)的合成起始于鳥氨酸和精氨酸，由精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）[6-7]、鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）[8]、N-甲基腐胺轉(zhuǎn)移酶（putrescine N-methyltransferase，PMT）[9-11]、N-甲基腐胺氧化酶（N-methylputrescine oxidase，MPO）[12]等催化酶的作用合成；煙堿吡啶環(huán)的合成起始于天冬氨酸，由天冬氨酸氧化酶（aspartate oxidase，AO）、喹啉酸合酶（quinolinate synthase，QS）、喹啉酸核糖轉(zhuǎn)移酶（quinolinate phosphoribosyltransferase，QPT）[13]等催化酶的作用合成[14]。然后，吡咯烷環(huán)和吡啶環(huán)在異黃酮還原酶（isoflavone reductase-like，A622）[15-16]和小檗堿橋接酶家族成員（berberine bridge enzyme- like，BBL）[17]的作用下合成煙堿。對(duì)Burley 21煙草的低煙堿突變體研究表明，低煙堿突變體的煙堿合成由2個(gè)非連鎖遺傳位點(diǎn)和控制[18-19]，這兩個(gè)遺傳位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的突變體分別命名為或，含有這兩個(gè)位點(diǎn)的純合突變體命名為/[20]。煙草植株中的煙堿合成主要在根部進(jìn)行，其合成過(guò)程受到植物激素的調(diào)控。據(jù)報(bào)道，煙堿的生物合成受到茉莉酸（JA）、生長(zhǎng)素（Auxin）和乙烯（ET）等植物激素的調(diào)控，JA能夠誘導(dǎo)煙堿合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)煙堿的合成[21-23]；Auxin和ET能夠抑制煙堿合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制煙堿的合成。乙烯應(yīng)答因子（ERFs）是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物病害抗性、脅迫應(yīng)答[25]、次生代謝等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[26-30]。在植物病害抗性調(diào)控中，ERF轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)結(jié)合病程相關(guān)蛋白（PR）基因啟動(dòng)子區(qū)域的GCC-box順式元件發(fā)揮調(diào)控作用[31-32]。同時(shí)，ERF轉(zhuǎn)錄因子也參與了JA/ET信號(hào)傳導(dǎo)和煙堿合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[24]。研究發(fā)現(xiàn)，煙草位點(diǎn)含有一個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子簇[33]，表明NIC位點(diǎn)可能具有廣泛的調(diào)控功能。Shoji等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Burley 21的煙堿突變體在逆境脅迫和JA/ET誘導(dǎo)的煙堿合成及抗逆相關(guān)基因表達(dá)方面均與野生型存在明顯差異，/突變體中的抗病相關(guān)基因表達(dá)水平比野生型煙草有所下降[34]。這些研究表明煙草抗病相關(guān)基因的表達(dá)與煙堿合成具有重要關(guān)聯(lián)。【本研究切入點(diǎn)】前期研究發(fā)現(xiàn)煙草在和基因座的突變體中存在轉(zhuǎn)錄后可變剪切現(xiàn)象，并導(dǎo)致了65 bp核苷酸的缺失，在的mRNA編碼區(qū)引入了一個(gè)提前終止密碼子，從而改變了PR3b的酶活性[5]，但其mRNA可變剪切元件的作用機(jī)制還未得到深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究構(gòu)建了可變剪切元件NRSE1與的融合表達(dá)載體，并培育了低煙堿突變體和野生型煙草的轉(zhuǎn)基因植株，在鑒定出陽(yáng)性植株后，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)分析了可變剪切元件NRSE1在低煙堿突變體中獨(dú)立于其他mRNA區(qū)段的分子剪切特征，并分析了JA/ET處理對(duì)轉(zhuǎn)基因材料中的GUS活性影響，為分離其可變剪切調(diào)控因子，及進(jìn)一步解析低煙堿突變體遺傳位點(diǎn)的分子調(diào)控機(jī)制提供了重要分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型（WT）和低煙堿突變體（和）煙草（L. cv. Burley 21）材料，在光照周期為14 h光照/10 h黑暗，室溫為25℃的室內(nèi)溫室培養(yǎng)。

大腸桿菌（）菌株DH5α和ccdBr、根癌農(nóng)桿菌（）菌株LBA4404及載體構(gòu)建所需的Gateway克隆載體pENTR-D-TOPO和pBin-attR-GUS由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物功能成分研究中心提供。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa有限公司；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；Gateway克隆所需的LR Clonase Ⅱ酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司

1.2 基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)煙草（NCBI基因序列號(hào)：Z11564）的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（5′-CACCATGGC AGCACCACAATGTCCTTTTC-3′和5′-ATTCCAAAG CATGACACCTC-3′），從含有的cDNA序列載體中擴(kuò)增目的片段，切膠回收后，將片段與pENTR-D- TOPO載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，重組轉(zhuǎn)化子做菌液PCR并測(cè)序鑒定出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒測(cè)序鑒定。隨后，通過(guò)Gateway克隆方法將帶有目的片段的pENTR-D- TOPO載體與pBin-attR-GUS載體在LR Clonase Ⅱ酶催化下進(jìn)行體外重組，重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，用特異性引物（5′-GCATTCTACTTCTATTGCAG-3′和5′-TCAGGAAAAGGACATTGTG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定，獲得由2×35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的融合表達(dá)載體pBin-attR-NRSE1-GUS（圖1）。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將目的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404，于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，進(jìn)行菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性菌株；將陽(yáng)性菌株接種于5 mL YEB液體培養(yǎng)基（含50 mg·L-1Kan + 50 mg·L-1Rif），28℃培養(yǎng)2 d；然后，轉(zhuǎn)接200 μL菌液接種于50 mL YEB液體培養(yǎng)基（含50 mg·L-1Kan + 50 mg·L-1Rif + 50 mg·L-1Str），當(dāng)菌體生長(zhǎng)到OD600值0.8時(shí)，離心收集菌體，用新鮮YEB 液體培養(yǎng)基重懸菌體，用于侵染煙草葉片外植體。所需外植體取自在25℃溫室培養(yǎng)的野生型（WT）和低煙堿突變體材料（和）的無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)中將無(wú)菌苗葉片剪成0.5 cm2的小塊，置于上述菌液中侵染7 min；將侵染后的葉片轉(zhuǎn)移至不含抗生素的MS固體培養(yǎng)基上，于28℃黑暗條件下進(jìn)行2 d共培養(yǎng)，然后，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基（MS +1 mg·L-16-BA + 500 mg·L-1CEF + 50 mg·L-1Kan），在光照為5 000 lux、室溫25℃、光周期為14 h光照/10 h黑暗的室內(nèi)溫室進(jìn)行選擇培養(yǎng)；4—6周后，待再生苗長(zhǎng)到1 cm左右時(shí)，將其切下并轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基（1/2MS + 0.1 mg·L-1NAA + 50 mg·L-1Kan + 500 mg·L-1CEF）上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待生根后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)缽培養(yǎng)，并收獲轉(zhuǎn)基因植株種子。

A：PR3b示意圖以及可變剪切區(qū)65 bp堿基序列，剪切的第1個(gè)與后64個(gè)堿基間有4個(gè)堿基間隔；B：NRSE1元件與GUS的融合表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株的分子鑒定及GUS染色

為鑒定表達(dá)目的融合基因的轉(zhuǎn)基因植株，用篩選培養(yǎng)基（1/2MS + 100 mg·L-1Kan）鑒定轉(zhuǎn)基因植物的抗性幼苗，并用Trizol提取其總RNA，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)目的基因是否正常表達(dá)，并對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。使用pBin-attR-NRSE1-GUS載體的非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)段特異性引物（5′-GCATTCTACTTCTATTG CAG-3′）和NRSE1元件的序列特異性引物（5′-ACAT TAGCACTTGCTTTGGT-3′）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段約300 bp。

在進(jìn)行GUS染色時(shí)，分別剪取轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片材料，放入含X-Gluc染色液（50 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH7.0）、5 mmol·L-1亞鐵氰化鉀、0.1 % Triton X100和1.5 mmol·L-1X-Gluc）的離心管中，置于37℃培養(yǎng)箱染色24 h，隨后，在70%的酒精中脫色后，觀察轉(zhuǎn)基因植株葉片變藍(lán)的情況，并在體視顯微鏡下拍照。

1.5 NRSE1元件在轉(zhuǎn)基因植株中的可變剪切分析

為檢測(cè)NRSE1元件與在煙草中融合表達(dá)后的可變剪切特性，用上述類似方法以篩選培養(yǎng)基（1/2MS + 100 mg·L-1Kan）鑒定轉(zhuǎn)基因植物的抗性幼苗，并用Trizol提取其總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增（NRSE1元件的序列特異引物5′-AGGAGG TGGAATCAGTGGACA-3′和序列的特異引物5′-ATCCAG ACTGAATGCCCACAG-3′）可變剪切區(qū)段，并對(duì)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。煙草內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物為：5′-TGAGGATATTCA GCCACTCG-3′和5′-GCACCGATGGTAATCACTTG -3′。

1.6 乙烯和茉莉酸處理轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性及融合基因表達(dá)分析

取轉(zhuǎn)基因煙草材料的葉片，分別噴施100 μmol·L-1的乙烯利（ET）和100 μmol·L-1的茉莉酸甲酯（MeJA），并置于含浸水濾紙的培養(yǎng)皿中處理24 h。隨后，剪取適宜大小的葉片材料以上述染色方法進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，并在體視顯微鏡下拍照。同時(shí)，提取處理葉片的RNA，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)激素處理對(duì)NRSE1元件的分子剪切影響，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析激素處理對(duì)表達(dá)水平的影響。qRT-PCR使用Go Taq? qPCR Master Mix試劑盒（Promega）擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為5′-GAATGGTGAT TACCGACGAAAACG-3′和5′-CACCACTTGCAAAG TCCCGCTAGT-3′，內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物為：5′-CCACACAGGTGTGATGGTTG-3′和5′-GTGGCTA ACACCATCACCAG-3′。

2 結(jié)果

2.1 PR3b可變剪切元件NRSE1的GUS融合表達(dá)載體構(gòu)建

為分析可變剪切元件NRSE1獨(dú)立于其他mRNA區(qū)段的分子剪切機(jī)制，設(shè)計(jì)圖1所示NRSE1與的融合表達(dá)載體，用于轉(zhuǎn)基因材料培育及可變剪切的分子檢測(cè)。將中包含可變剪切區(qū)（65 bp）的一段300 bp目的基因片段克隆后，構(gòu)建其與的融合表達(dá)雙元載體，并對(duì)目的載體進(jìn)行測(cè)序鑒定，成功獲得了可變剪切元件NRSE1與的融合表達(dá)載體（圖2）。隨后，將構(gòu)建好的目的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，篩選抗性菌落并進(jìn)行菌液PCR鑒定，獲得含目的載體的陽(yáng)性菌株。

隨后，通過(guò)葉盤轉(zhuǎn)化法培育了NRSE1與融合表達(dá)載體的低煙堿突變體（和）和野生型煙草轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)Kan抗性篩選，獲得每個(gè)材料的轉(zhuǎn)基因株系7個(gè)以上。

Marker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定與GUS活性檢測(cè)

獲得NRSE1元件的融合表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株后，對(duì)其T1代種子進(jìn)行了Kan抗性篩選，并進(jìn)行了RT-PCR及GUS活性檢測(cè)，以確定融合基因能夠在T1代植株中穩(wěn)定表達(dá)。圖3-A所示，為代表性陽(yáng)性植株的RT-PCR鑒定結(jié)果，以載體非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)段和NRSE1元件的序列特異引物可以從野生型和低煙堿突變體（和）煙草的轉(zhuǎn)基因材料中擴(kuò)增出約300 bp的目的融合基因表達(dá)片段，進(jìn)一步的測(cè)序分析證明目的融合基因在轉(zhuǎn)基因材料中成功表達(dá)。隨后，利用篩選出的T1代抗性幼苗，對(duì)NRSE1元件的融合表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了GUS活性檢測(cè)。圖3-B所示，為代表性陽(yáng)性植株的GUS活性檢測(cè)結(jié)果，野生型和低煙堿突變體（和）煙草的轉(zhuǎn)基因材料葉片在GUS染色后，可以觀察到X-Gluc反應(yīng)后的藍(lán)色產(chǎn)物，表明獲得了表達(dá)目的融合基因的轉(zhuǎn)基因材料。

A：轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR分子鑒定；B：轉(zhuǎn)基因材料GUS染色鑒定。Ctrl為非轉(zhuǎn)基因野生型煙草對(duì)照；WT+為轉(zhuǎn)基因野生型煙草；nic1和nic2為低煙堿突變體轉(zhuǎn)基因材料。PR3b-GUS表示PR3b的NRSE1元件與GUS融合表達(dá)

2.3 NRSE1元件與GUS融合表達(dá)后的可變剪切分析

分別提取野生型和低煙堿突變體（和）轉(zhuǎn)基因材料的葉片總RNA，以目的融合基因序列為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果表明，野生型煙草的轉(zhuǎn)基因材料中只能擴(kuò)增出1條約300 bp的條帶，而低煙堿突變體（和）的轉(zhuǎn)基因材料中均能擴(kuò)增出2條條帶，一條約300 bp的條帶和一條不足200 bp的條帶（圖4）。將擴(kuò)增條帶切膠回收后，測(cè)序發(fā)現(xiàn)約300 bp的條帶為未剪切的擴(kuò)增片段，而不足200 bp的條帶為剪切后的擴(kuò)增片段，剪切后的序列變化與前期觀察到的結(jié)果一致（圖4）。結(jié)果表明，的可變剪切元件NRSE1在與融合表達(dá)后，仍能進(jìn)行可變剪切，其可變剪切不依賴于其他區(qū)段的mRNA序列，為鑒定其可變剪切調(diào)控因子提供了重要信息。

WT+為野生型轉(zhuǎn)基因煙草，nic1和nic2為低煙堿突變體轉(zhuǎn)基因材料，Ctrl為未轉(zhuǎn)基因野生型煙草對(duì)照。NRSE1-GUS表示PR3b的NRSE1元件與GUS融合表達(dá)。星號(hào)為引物二聚體

2.4 乙烯和茉莉酸處理對(duì)轉(zhuǎn)基因材料GUS活性的影響分析

為分析乙烯和茉莉酸對(duì)融合基因翻譯水平的可能影響，檢測(cè)了NRSE1元件與融合表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在乙烯和茉莉酸處理后的GUS活性。未處理的野生型和低煙堿（和）轉(zhuǎn)基因植株葉片在GUS染色后，均呈現(xiàn)深藍(lán)色，但在乙烯和茉莉酸處理后，其染色程度出現(xiàn)了變化（圖5-A）。乙烯處理后，除野生型轉(zhuǎn)基因材料外，其他材料葉片的染色程度明顯弱于未處理的對(duì)照材料；茉莉酸處理后，所有材料葉片的染色產(chǎn)物近于消失（圖5-A）。隨后，通過(guò)RT-PCR分析了乙烯和茉莉酸處理對(duì)融合基因在野生型和低煙堿（和）材料中的剪切模式影響，結(jié)果表明，乙烯和茉莉酸對(duì)NRSE1元件的轉(zhuǎn)錄后剪切有抑制作用（圖5-B）。此外，還通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了乙烯和茉莉酸處理后融合基因在野生型和低煙堿（和）材料中的表達(dá)情況，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的表達(dá)水平變化（圖5-C）。推測(cè)乙烯和茉莉酸可能對(duì)融合基因的翻譯有一定抑制作用。

A：轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性檢測(cè)；B：融合表達(dá)基因的分子剪切分析，星號(hào)為引物二聚體；C：ET、JA處理后轉(zhuǎn)基因植株的GUS基因相對(duì)表達(dá)量。WT+為轉(zhuǎn)基因野生型煙草，nic1和nic2為轉(zhuǎn)基因低煙堿突變體材料；Mock為未處理材料，ET和JA分別為乙烯和茉莉酸處理材料

3 討論

基因的轉(zhuǎn)錄后剪切調(diào)控是一個(gè)非常有趣的科學(xué)問(wèn)題。前期對(duì)低煙堿突變體和的研究，在抗病相關(guān)基因的mRNA中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與煙堿代謝關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄后可變剪切標(biāo)記。這一剪切在的cDNA序列中引起65個(gè)堿基缺失，并提前引入了終止密碼子，通過(guò)移碼突變導(dǎo)致翻譯提前終止改變了PR3b的酶活性[5]。該現(xiàn)象表明煙堿代謝調(diào)控因子NIC1和NIC2參與了抗病相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，并建立了煙堿代謝與病害抗性調(diào)控間的分子關(guān)聯(lián)。深入研究基因mRNA的分子可變剪切機(jī)制，有助于鑒定其分子剪切調(diào)控蛋白，從而揭示煙堿代謝調(diào)控位點(diǎn)（NIC1和NIC2）與病害抗性間的分子調(diào)控通路。

本研究創(chuàng)制了NRSE1元件與融合表達(dá)的低煙堿突變體（和）和野生型煙草轉(zhuǎn)基因植株。以RT-PCR和GUS染色方法鑒定出陽(yáng)性植株后，通過(guò)RT-PCR試驗(yàn)分析了NRSE1元件與融合表達(dá)后的可變剪切特性。結(jié)果證明，NRSE1元件與融合表達(dá)后，仍能在低煙堿突變體和中發(fā)生與前期發(fā)現(xiàn)一致的可變剪切現(xiàn)象，其在野生型煙草中無(wú)明顯可變剪切發(fā)生。這一結(jié)果表明，NRSE1元件的可變剪切不依賴的其他區(qū)段mRNA序列。這一特性為后期利用可視報(bào)告蛋白（如GUS、LUC或GFP等）進(jìn)行可變剪切調(diào)控因子鑒定提供了關(guān)鍵分子基礎(chǔ)，對(duì)揭示煙堿代謝調(diào)控因子NIC1和NIC2的調(diào)控機(jī)制有重要幫助。

煙草中的mRNA可變剪切受到乙烯和茉莉酸的調(diào)控[5]，這一現(xiàn)象暗示存在一些受乙烯或茉莉酸誘導(dǎo)并與剪切區(qū)段相互作用的調(diào)控因子。本研究進(jìn)一步通過(guò)GUS活性測(cè)定及表達(dá)特性分析，解析了乙烯和茉莉酸對(duì)NRSE1元件可變剪切的其他分子調(diào)控。研究結(jié)果表明，乙烯和茉莉酸處理改變了表達(dá)NRSE1元件與融合基因的野生型和低煙堿（和）材料中的GUS活性。然而，乙烯和茉莉酸處理并不改變NRSE1元件原有的誘導(dǎo)剪切特性，也未對(duì)其與融合基因的表達(dá)水平產(chǎn)生明顯影響。從研究結(jié)果推測(cè)，乙烯和茉莉酸處理可能通過(guò)抑制NRSE1元件與融合基因的翻譯降低了轉(zhuǎn)基因植株中的GUS活性，即存在翻譯水平的調(diào)控作用。這些研究結(jié)果為NRSE1元件可變剪切調(diào)控因子的分離鑒定及作用機(jī)制研究提供了重要參考。

4 結(jié)論

煙草mRNA中NRSE1元件的可變剪切不依賴其他mRNA序列，在與融合表達(dá)后仍能發(fā)生可變剪切，可利用其與報(bào)告基因的融合表達(dá)材料開展可變剪切因子篩選。乙烯和茉莉酸處理會(huì)改變表達(dá)NRSE1元件與融合基因煙草中的GUS活性，但在轉(zhuǎn)錄水平未觀察到明顯變化，可能存在翻譯水平的調(diào)控作用。

[1] JALALI B L, BHARGAVA S, KAMBLE A. Signal transduction and transcriptional regulation of plant defence responses., 2006, 154: 65-74.

[2] 張玉, 楊愛國(guó), 馮全福, 蔣彩虹, 耿銳梅, 羅成剛. 植物病程相關(guān)蛋白及其在煙草中的研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2012(5): 20-24.

ZHANG Y, YANG A G, FENG Q F, JIANG C H, GENG R M, LUO C G. Plant pathogenesis-related proteins and research progress in tobacco., 2012(5): 20-24. (in Chinese)

[3] MARTIN G B, BOGDANOVE A J, SESSA G. Understanding the functions of plant disease resistance proteins., 2003, 54: 23-61.

[4] GLAZEBROOK J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens., 2005, 43: 205-227.

[5] MA H R, WANG F, WANG W J. Alternative splicing of basic chitinase genein the low-otine mutants ofL. cv. Burley 21., 2016, 67: 5799-5809.

[6] Rubén A, Tiburcio A F. Determination of arginine and ornithine decarboxylase activities in plants., 2018, 1694: 117-122.

[7] Patel J, Ariyaratne M, Ahmed S, Ge L, Phuntumart V, Kalinoski A, Morris P F. Dual functioning of plant arginases provides a third route for putrescine synthesis., 2017, 262: 62-73.

[8] SHUNSUKE I, KATSUHITO H, MAKIKO N, HISAE K, YOSHIKATSU M, TAKASHI H, YOUJI S, YASUYUKI Y, KENZO N. Differential induction by methyl jasmonate of genes encoding ornithine decarboxylase and other enzymes involved in nicotine biosynthesis in tobacco cell cultures., 1998, 38(6): 1101-1111.

[9] CHATTOPADHYAY M K, GHOSH B. Molecular analysis of polyamine biosynthesis in higher plants., 1998, 74: 517-522.

[10] Dalton H L, Blomstedt C K, Neale A D, Gleadow R, DeBoer K D, Hamill J D. Effects of down-regulating ornithine decarboxylase upon putrescine-associated metabolism and growth inL.., 2016, 67(11): 3367-3381.

[11] Kajikawa M, Sierro N, Hashimoto T, SHOJI T. A model for evolution and regulation of nicotine biosynthesis regulon in tobacco., 2017, 12(6): e1338225.

[12] NACONSIE M, KATO K, SHOJI T. Molecular evolution of N-methylputrescine oxidase in tobacco., 2014, 55: 436-444.

[13] AKIRA K. Molecular biology of pyridine nucleotide and nicotine biosynthesis., 2004, 9(1-3): 1577-1586.

[14] RALPH E D, XIE J H. Molecular genetics of alkaloid biosynthesis in., 2013, 94: 10-27.

[15] DEBOER K, LYE J, AITKEN C, SU A, HAMILL J. Thegene in(tree tobacco): evidence for a functional role in pyridine alkaloid synthesis., 2009, 69(3): 299-312.

[16] KAJIKAWA M, HIRAI N, HASHIMOTO T. A PIP-family protein is required for biosynthesis of tobacco alkaloids., 2009, 69: 287-298.

[17] KAJIKAWA M, SHOJI T, KATO A. Vacuole-localized berberine bridge enzyme-like proteins are required for a late step of nicotine biosynthesis in tobacco., 2011, 155: 2010-2022.

[18] SHOJI T, HASHIMOTO T. Tobacco MYC2 regulates jasmonate inducible nicotine biosynthesis genes directly and by way of thelocusgenes., 2011, 52(6): 1117-1130.

[19] LEGG P D, CHAPLIN J F, COLLINS G B. Inheritance of percent total alkaloids inL.: Populations derived from crosses of low alkaloid lines with burley and flue-cured varieties., 1969, 60: 213-217.

[20] HIBI N, HIGASHIGUCHI S, HASHIMOTO T, YAMADA Y. Gene expression in tobacco low-nicotine mutants., 1994, 6(5): 723-735.

[21] Wasternack C, Song S. Jasmonates: biosynthesis, metabolism, and signaling by proteins activating and repressing transcription., 2017, 68(6): 1303-1321.

[22] MEMELINK, JOHAN. Regulation of gene expression by jasmonate hormones., 2009, 70(13): 1560-1570.

[23] ZHANG H B, BOKOWIEC M T, RUSHTON P J. Tobacco transcription factors NtMYC2a and NtMYC2b form nuclear complexes with the NtJAZ1 repressor and regulate multiple jasmonate-inducible steps in nicotine biosynthesis., 2012, 5(1): 73-84.

[24] SHOJI T, KAJIKAWA M, HASHIMOTO T. Clustered transcription factor genes regulate nicotine biosynthesis in tobacco.,2010, 22(10): 3390-3409.

[25] 董娜, 張?jiān)銎G, 辛志勇. 病原誘導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)錄因子TaERF1b基因的分離和表達(dá). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(4): 946-953.

DONG N, ZHANG Z Y, XIN Z Y. Isolation and expression analysis of a pathogen-induced ERF gene inL..,2008, 41(4): 946-953. (in Chinese)

[26] BOER K D, TILLEMAN S, PAUWELS L. APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR and basic helix-loop-helix tobacco transcription factors cooperatively mediate jasmonate-elicited nicotine biosynthesis., 2011, 66(6): 1053-1065.

[27] GILMOUR S J, SEBOLT A M, SALAZAR M P. Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation., 2000, 124(4): 1854-1865.

[28] SHARABI S M, SAMACH A, PORAT R. Overexpression of the CBF2transcriptional activator insuppresses the responsiveness of leaf tissue to the stress hormone ethylene., 2010, 12(4): 630-638.

[29] Shoji T, Hashimoto T. Expression of a tobacco nicotine biosynthesis gene depends on the JRE4 transcription factor in heterogenous tomato.,2019, 132(2): 173-180.

[30] 趙云祥, 徐兆師, 陳明, 李連城, 陳耀鋒, 邱志剛, 熊祥進(jìn), 馬有志. 小麥ERF類轉(zhuǎn)錄因子W17的結(jié)合特異性及亞細(xì)胞定位分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(6): 1575-1582.

ZHAO Y X, XU Z S, CHEN M, LI L C, CHEN Y F, QIU Z G, XIONG X J, MA Y Z. Analysis of specific binding and subcellular localization of wheat ERF transcription factor W17., 2008, 41(6): 1575-1582. (in Chinese)

[31] ZHANG H B, ZHANG D B, CHEN J, YANG Y H, HUANG Z J, HUANG D F, WANG X C, HUANG R F. Tomato stress-responsive factor TSRF1 interacts with ethylene responsive element GCC box and regulates pathogen resistance to., 2004, 55(6): 825-834.

[32] CHAKRAVARTHY S, TUORI R P, D'ASCENZO M D, FOBERT P R, DESPRES C, MARTIN G B. The tomato transcription factor Pti4 regulates defense-related gene expression via GCC box and non-GCC boxelements., 2003, 15(12): 3033-3050.

[33] SHOJI T, HASHIMOTO T. Stress-induced expression of- locus genes and their homologs encoding ethylene response factor transcription factors in tobacco., 2015, 113: 41-49.

[34] LEGG P D, COLLINS G B, LITTON C C. Registration of La Burley 21 tobacco germplasm1 registration No. (GP 8)., 1970, 10(2): 212.

Splicing Property Analyses of the NRSE1 Element from TobaccomRNA after Fusion Expression withGene

ZHAO Xue1, WANG Feng2, WANG Wenjing1, LIU Xiaofeng1, bian shiquan1, liu yanhua1, liu Xinmin1, du yongmei1, zhang zhongfeng1, zhang hongbo1

(1tobacco Research institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong;2College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】Previously, a post-transcriptional splicing of tobaccogene was observed in the low-nicotine mutants (,) ofL. cv. Burley 21, yet themechanism underlying this phenomenon is still unclear. In this study, we developed transgenic plants expressing the fusion of the alternative splicing element NRSE1 (nicotine-synthesis related splicing element 1) fromand thegene to investigate the splicing properties of the NRSE1 element after excising frommRNA, in order to reveal its regulatory mechanism. 【Method】The NRSE1 element was amplified fromcDNA by PCR amplification, and the vector for expressing the fusion of NRSE1 element and thegene was constructed by molecular methods. And, the vector was used to develop transgenic plants expressing the fusion of NRSE1 element andgene with wild type tobacco and the low-nicotine mutantsandvia agrobacterium (LBA4404) mediated transformation method. The transgenic plants were identified by RT-PCR and GUS staining, and the splicing of the fusion of NRSE1 element andgene in the transgenic plants of wild type tobacco and low-nicotine mutants were then analyzed by RT-PCR. Seedlings of the transgenic plants were treated with ethylene (ET) and jasmonic acid (JA), respectively. And, the effects of ET and JA treatment on the GUS activity and the splicing of the fusion of NRSE1 element andgene in the transgenic plants were analyzed by GUS staining and RT-PCR, respectively. The effects of ET and JA treatment on the expression level of the fusion of NRSE1 element andgene were analyzed as well. 【Result】A set of transgenic wild type tobacco and low-nicotine mutants expressing the fusion of NRSE1 element andgene were identified by RT-PCR and GUS staining. Further RT-PCR and sequencing analyses showed that the NRSE1 element could be alternatively spliced at higher levels in the low-nicotine mutants after fusion with thegene,in a pattern consistent with its alternative splicing in themRNA as previously report. ET and JA treatments could alter the GUS activity in the transgenic plants, but did not affect the inducible splicing of the NRSE1 element or the expression level of the fusion of NRSE1 element andgene in the transgenic plants. 【Conclusion】 A highly splicing of the NRSE1 element was observed in the low-nicotine mutants after fusion expression withgene. The alternatively splicing of NRSE1 element is independent of the rest regions ofmRNA. ET and JA treatments had an effect on the GUS activities of the transgenic plants expressing the fusion of NRSE1 element andgene, which may result from a translational regulation.

L.;gene;low-nicotine mutant; alternative splicing; jasmonic acid; ethylene

2019-09-05；

2019-12-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（31801279）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院“青年英才計(jì)劃”項(xiàng)目、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）、中國(guó)煙草總公司云南省公司（2019530000241005）和四川省公司項(xiàng)目（SCYC202014）

趙雪，E-mail：zhaoxue1007@163.com。通信作者張洪博，E-mail：zhanghongbo@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）