祁永斌，張禮霞，王林友，宋建，王建軍

利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻香味基因

祁永斌，張禮霞，王林友，宋建，王建軍

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州 310021）

【目的】稻米香味是水稻品質(zhì)改良的一個(gè)重要內(nèi)容，其性狀主要受1個(gè)隱性基因的控制。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將常規(guī)品種中的進(jìn)行編輯，從而獲得發(fā)生突變的基因編輯株系，使香味性狀得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因編輯的原理，在水稻的第2和第7外顯子處設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，通過(guò)Blast分析確定其特異性并構(gòu)建到CRISPR/Cas9表達(dá)載體。以浙江省主要推廣的水稻品種嘉58和秀水134的愈傷組織為受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，通過(guò)潮霉素抗性篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)測(cè)序明確其在的突變類型，經(jīng)PCR分析與鑒定獲得發(fā)生突變并無(wú)轉(zhuǎn)基因標(biāo)記成分的穩(wěn)定株系。利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）檢測(cè)基因編輯株系糙米米粉中2-AP的含量，明確其香味成分與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g的差異?！窘Y(jié)果】在水稻第2和第7外顯子處設(shè)計(jì)靶點(diǎn)構(gòu)建表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因株系的完成了定向突變。共獲得T0代嘉58基因編輯的株系15株，在第2外顯子處發(fā)生突變的有8株5種不同的突變類型，均為不同單堿基插入不同位點(diǎn)；在第7外顯子處發(fā)生突變的有7株5種不同的突變方式，均為堿基或片段缺失。獲得秀水134基因編輯的株系11株，在第2外顯子處共有5株，均為單堿基插入；在第7外顯子處有6株，均為片段缺失。48株T1代秀水134基因編輯株系中，共獲得16株無(wú)轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的基因編輯株系，其中5株在第2外顯子發(fā)生突變，11株在第7外顯子處發(fā)生突變。4個(gè)T2代基因編輯株系的米粉中2-AP平均含量分別為0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g-1，極顯著（<0.01）高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?.046 μg·g-1）?！窘Y(jié)論】利用CRISPR-Cas9技術(shù)可對(duì)水稻香味基因進(jìn)行定向編輯，并且可獲得無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯株系，其香味性狀得到明顯改良。

水稻；CRISPR/Cas9；基因編輯；；香味

0 引言

【研究意義】水稻是中國(guó)重要的糧食作物，香米由于具有獨(dú)特香味，深受消費(fèi)者青睞，生產(chǎn)和市場(chǎng)價(jià)值較高。因此，水稻的香味性狀已成為衡量大米品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，是水稻品質(zhì)改良的重要研究?jī)?nèi)容，發(fā)掘和創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)香稻資源是開展稻米品質(zhì)改良的重要途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從20世紀(jì)70年代起，許多研究者對(duì)香米的香氣成分進(jìn)行了廣泛而深入的研究，Yajima等[1]在1979年報(bào)道香米含有114種揮發(fā)性化合物，Buttery等[2]發(fā)現(xiàn)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）是香米香味的主要組成成分，2-AP在香米品種除根系外的其他各個(gè)組織中均能被檢測(cè)到。目前，研究表明，稻米香味主要受水稻第8染色體上的隱性基因調(diào)控。該基因由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成，其中，第8外顯子編碼一個(gè)VTELGGKSP結(jié)構(gòu)域，第9外顯子編碼一個(gè)28半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，都是2種β-乙醛脫氫酶BAD1和BAD2的保守域，第10外顯子編碼的EGCRLGSVVS也在BAD蛋白中非常保守，在非香型水稻中被發(fā)現(xiàn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在一些香米品種如蘇御糯、泰國(guó)茉莉花型香米和印度巴斯瑪?shù)傩拖忝灼贩N中，由于在的第7外顯子上有8 bp的堿基缺失和3個(gè)SNPs差異導(dǎo)致移碼突變，翻譯提前終止；在中國(guó)的一些香米品種中，發(fā)現(xiàn)第2外顯子上有7 bp的堿基缺失，造成發(fā)生突變，從而產(chǎn)生香味。由于香型水稻中編碼區(qū)的第7或第2外顯子處發(fā)生了移碼突變，導(dǎo)致其編碼的乙醛脫氫酶翻譯提前終止，功能保守的結(jié)構(gòu)域不能翻譯。因此，無(wú)法完成脫氫反應(yīng)，從而造成2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的積累而產(chǎn)生香味[4-9]。張江麗等[10]鑒定了86份具有香味的水稻種質(zhì)資源，其中絕大部分的香味性狀受等位基因控制。因此，是調(diào)控稻米香味的主要基因，通過(guò)人工突變的方式，改變其DNA遺傳信息，可以創(chuàng)制出新的香型種質(zhì)資源。目前，鑒定稻米香味的常規(guī)方法是利用人工嗅覺(jué)直接判斷，或者將需要檢測(cè)的組織在水或KOH溶液中煮沸后根據(jù)氣味再進(jìn)行人工判斷[11]，也可以利用GC-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀通過(guò)成分檢測(cè)確定其香味[12]。這些方法在香味檢測(cè)的過(guò)程中需要花費(fèi)大量的人力、物力和時(shí)間，而且檢測(cè)結(jié)果因個(gè)體差異并不準(zhǔn)確，限制其在育種過(guò)程中的利用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助選擇、轉(zhuǎn)基因抑制表達(dá)、基因編輯等方法可提高育種效率，加快香型水稻的培育。利用香型品種中的分子特征，發(fā)展的SNP標(biāo)記可用于香味基因的分子標(biāo)記輔助選擇，從而提高育種效率[13-15]。利用RNAi技術(shù)降低在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)，從而使2-AP不能被降解[16]；Chen等[17]利用玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)人工microRNA在轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)下調(diào)，其后代籽粒中的2-AP含量顯著提高。近年來(lái)，隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，利用基因編輯技術(shù)改良目標(biāo)性狀基因成為有效的手段之一。轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術(shù)[18]，鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技術(shù)[19]和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）[20]等被視為有效的基因編輯工具?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Shan等[21]利用TALEN 技術(shù)，對(duì)日本晴的進(jìn)行編輯，純合的T1代株系中2-AP含量明顯增加。邵高能等[22]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)中花11的進(jìn)行編輯，在1株純合的基因編輯株系中的轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，香味物質(zhì)大量積累。因此，利用基因編輯技術(shù)改良水稻香味性狀，可加快香稻育種進(jìn)程。但日本晴與中花11均為模式品種，其本身農(nóng)藝性狀與推廣品種相比具有一定的差距，難以在生產(chǎn)上直接利用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以浙江省主要推廣的水稻品種嘉58、秀水134為研究材料，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得不同的轉(zhuǎn)基因株系，通過(guò)測(cè)序及PCR鑒定獲得發(fā)生突變并穩(wěn)定遺傳的無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因純合株系，基因編輯株系的2-AP含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨瑸橄阈退镜睦锰峁┬碌姆N質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江省主要推廣的晚粳稻品種嘉58與秀水134為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，將植物表達(dá)載體T-DNA片段插入水稻基因組。轉(zhuǎn)基因材料于2018年正季種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡試驗(yàn)基地轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)區(qū)，采用常規(guī)種植與田間管理。

1.2 基因編輯載體構(gòu)建

根據(jù)香型水稻在第2和第7外顯子出現(xiàn)堿基缺失突變的特性，利用https://crispr.cos.uni-heidelberg. de/index.html在線分析工具，分別以第2和第7外顯子序列為靶序列設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，其中Oligo-up1和Oligo-lw1為第2外顯子設(shè)計(jì)靶點(diǎn)接頭，Oligo-up2和Oligo-lw2為第7外顯子設(shè)計(jì)靶點(diǎn)接頭。結(jié)合靶點(diǎn)上下游DNA序列通過(guò)Blast分析，確保其特異性。Oligo二聚體制備（20 μL體系），含Buffer Aneal 18 μL、上下游引物各1 μL。95℃加熱3 min后，以0.2℃·s-1緩慢降至20℃。將Oligo二聚體構(gòu)建至CRISPR/Cas9載體（圖1），10 μL體系含CRISPR/Cas9載體2 μL、Oligo二聚體1 μL、Enzyme Mix 1 μL、和H2O 6 μL，20℃反應(yīng)60 min（以上載體試劑盒由杭州百格生物技術(shù)有限公司提供）。構(gòu)建好的Cas9/gRNA-Oligo質(zhì)粒載體通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

LB：載體左邊界；U6：水稻OsU6啟動(dòng)子；SG：向?qū)NA；UBI：UBI啟動(dòng)子；Cas9：Cas9蛋白；Nos Ter：Nos終止子；35S：35S啟動(dòng)子；Hygro：潮霉素基因；Poly A Ter：PolyA終止子；RB：載體右邊界

1.3 基因編輯株系的靶點(diǎn)分析與鑒定

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105中，浸染并轉(zhuǎn)化嘉58與秀水134愈傷組織，通過(guò)潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。水稻葉片基因組DNA由CTAB法提取，利用引物（-F與-R，表1）和引物（-F與-R）通過(guò)PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為2.0×PCR Buffer 10 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA 2 μL和H2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈下拍照。根據(jù)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株靶點(diǎn)特性，分別以exon2和exon7的引物，利用高保真KOD Fx酶擴(kuò)增靶點(diǎn)相鄰序列。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為2.0×Kod Fx buffer 10 μL、dNTP（2 mmol·L-1）2 μL、引物各0.5 μL、Kod Fx 0.5 μL、DNA 2 μL和H2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3min；95℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；68℃ 5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收后測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析轉(zhuǎn)基因T0代植株靶點(diǎn)的突變類型。

表1 本研究所用各種引物及序列

1.4 稻米香味2-AP含量測(cè)定

分別取基因編輯植株和對(duì)照的成熟種子30 g，去殼并將糙米碾磨成米粉后測(cè)定香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量。以2,4,6-三甲基吡啶作為內(nèi)標(biāo)（濃度229.25 ng·ml-1），每次稱取400 mg米粉樣品，重復(fù)3次，置于10 ml細(xì)口玻璃瓶，加入0.8 ml含有內(nèi)標(biāo)的乙醇浸提試劑于80℃烘箱中浸提3 h，取出靜置至室溫，利用0.22 μm的一次性針頭過(guò)濾膜過(guò)濾，取150 μl于內(nèi)襯管中后放入2 ml樣品瓶，使用GC-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）測(cè)定，檢測(cè)數(shù)據(jù)由Excel 2010和SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 基因編輯表達(dá)載體的構(gòu)建

以日本晴DNA序列為模板序列，分別以水稻（）的第2和第7外顯子為靶點(diǎn)，結(jié)合https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index. html在線分析工具，通過(guò)Blast序列比對(duì)，分別設(shè)計(jì)了20和19 bp保守的特異序列，通過(guò)制備Oligo二聚體后，將其構(gòu)建到CRISPR/Cas9表達(dá)載體（圖2）。構(gòu)建好的質(zhì)粒載體利用引物SG-SR3和PUV4-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后確認(rèn)sgRNA序列已構(gòu)建到表達(dá)載體中，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105后進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2 轉(zhuǎn)基因株系Badh2突變特性分析

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因法，轉(zhuǎn)化嘉58和秀水134的愈傷組織，通過(guò)潮霉素選擇分別獲得26株和18株獨(dú)立的轉(zhuǎn)化株系。為鑒定轉(zhuǎn)基因株系在第2和第7外顯子的突變情況，分別以-F和-R引物對(duì)與-F和-R引物對(duì)，利用高保真酶KOD Fx對(duì)的靶點(diǎn)相鄰序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。結(jié)果顯示，26株嘉58轉(zhuǎn)基因株系在第2外顯子處共有10株，其中無(wú)突變2株，8株轉(zhuǎn)基因突變株系有5種不同的突變方式，均為不同單堿基插入不同突變位點(diǎn)；第7外顯子處的轉(zhuǎn)基因株系共有16株，其中9株未發(fā)生突變，7株轉(zhuǎn)基因株系發(fā)生5種突變方式，均為片段或堿基缺失（圖2）。因此，共獲得嘉58基因編輯株系15株。18株秀水134的轉(zhuǎn)基因株系在第2外顯子處共有8株，其中3株無(wú)突變，5株均為單堿基插入；在第7外顯子處有10株，其中4株無(wú)突變，6株均為片段缺失（圖2）。因此，共獲得秀水134基因編輯株系11株。

Start code：起始密碼子；Stop code：終止密碼子；Exon2：第2外顯子；Exon7：第7外顯子；sgRNA target site：sgRNA靶點(diǎn)。方框表示靶標(biāo)序列，紅色下劃線字體表示PAM序列，藍(lán)色字體表示插入堿基，橫線表示缺失堿基，+表示堿基插入，-表示堿基缺失The box represented target sequence. The red words with the underline represented PAM sequence. The blue words indicated the insertion base. The transverse line indicated the deletion sequences. + represented base insertion, -indicated base deletion

2.3 無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因株系鑒定

為獲得無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯株系，選擇秀水134基因編輯的2個(gè)T0代株系Bh57和Bh53開展進(jìn)一步的分析，其中Bh57為單堿基插入造成移碼突變，Badh2蛋白翻譯提前終止；Bh53為片段缺失，其編碼的氨基酸與野生型相比缺少6個(gè)氨基酸。每個(gè)株系種植24株，提取單株基因組DNA并分別利用潮霉素選擇標(biāo)記引物對(duì)與核酸酶引物對(duì)，通過(guò)PCR檢測(cè)分析其在T1代株系中的情況。結(jié)果表明，在Bh57的24個(gè)T1代單株中，共檢測(cè)到5株不含和（圖3），測(cè)序結(jié)果表明其突變特性與T0代一致；同時(shí)，在Bh53的24個(gè)T1代單株中，共檢測(cè)到11株不含和（圖3），測(cè)序結(jié)果表明其突變特性與T0代一致。因此，可以從T1代株系中分離到不含轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯株系，而且這些株系在靶點(diǎn)的突變特性與其T0代一致，基因編輯的這種突變可以穩(wěn)定遺傳到下一代。根據(jù)田間表現(xiàn)，從2個(gè)T1代株系中各選擇2個(gè)單株進(jìn)行繁殖，分別命名為Bh1、Bh2、Bh3和Bh4。

圖3 T1代基因編輯株系中潮霉素Hpt（A）與核酸酶Cas9（B）的PCR檢測(cè)

2.4 基因編輯株系中香味物質(zhì)2-AP的含量檢測(cè)

為檢測(cè)基因編輯株系中香味物質(zhì)2-AP的含量，分別選擇并收獲4個(gè)T2代基因編輯株系Bh1、Bh2、Bh3和Bh4的成熟種子，去殼后碾磨成糙米米粉，利用GC-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定，其中，Bh1與Bh2為單堿基插入后導(dǎo)致移碼突變，Bh3與Bh4為18 bp片段缺失即為缺失突變。2-AP含量檢測(cè)結(jié)果顯示，所有基因編輯株系的2-AP含量均極顯著（<0.01）高于野生型對(duì)照品種（0.046 μg·g-1），其中Bh2的2-AP平均含量最高，達(dá)0.347 μg·g-1，Bh3與Bh1的2-AP平均含量分別為0.332和0.309 μg·g-1，Bh4的2-AP平均含量最低為0.295 μg·g-1，而野生型對(duì)照的2-AP平均含量?jī)H為0.046 μg·g-1（圖4）。因此，利用基因編輯技術(shù)使水稻發(fā)生突變，可獲得香味性狀得到改良的香型材料。

3 討論

香味是影響稻米品質(zhì)的一個(gè)重要性狀，是水稻品質(zhì)改良的主要研究目標(biāo)。香米的種植與選育具有悠久的歷史，國(guó)外有著名的印度巴斯馬蒂型香米、泰國(guó)的茉莉花香型、日本的宮香、美國(guó)的Jasmine85和Della都以其獨(dú)特的香味、優(yōu)良的米質(zhì)享譽(yù)世界[23-24]。中國(guó)的香米種植也具有悠久的歷史，主要有東北的稻花香，云南的螃蟹谷，廣西靖西香糯等香米稻種資源[25]，但是這些品種不僅具有獨(dú)特的地理區(qū)域特性，而且產(chǎn)量、抗倒伏、抗病性等亟需改良[26]。目前，傳統(tǒng)育種仍以雜交、回交等方式將香味性狀導(dǎo)入目標(biāo)品種，但由于香味成分檢測(cè)繁雜，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主觀性較強(qiáng)，準(zhǔn)確性有待提高，難以大規(guī)模利用。因此，利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)改良稻米香味性狀仍然受到各種因素的制約。

不同字母表示不同株系在0.01水平上差異極顯著

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是香味基因的克隆[4]，分子標(biāo)記輔助選擇[13-15]、RNAi[16]、基因編輯[21-22]等技術(shù)的不斷成熟，通過(guò)香味基因的定向改良提高香味品質(zhì)顯得更為高效。前人研究表明，是控制稻米香味的一個(gè)重要基因，通過(guò)生物技術(shù)方法使發(fā)生突變，從而獲得定向改良的香味資源用于育種利用。但是，通過(guò)基因編輯獲得的香型水稻材料均以模式品種日本晴、中花11等為轉(zhuǎn)化受體，其本身農(nóng)藝性狀與推廣品種相比具有一定的差距，難以在生產(chǎn)上直接利用，通過(guò)基因編輯獲得的香型材料仍需通過(guò)雜交、回交等傳統(tǒng)技術(shù)導(dǎo)入推廣品種才能得以在生產(chǎn)上利用。因此，其應(yīng)用受到一定的限制。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以浙江省主要推廣的水稻品種嘉58與秀水134為改良目標(biāo)，通過(guò)的定向編輯，獲得不同類型的轉(zhuǎn)基因突變株系，經(jīng)PCR分析結(jié)合測(cè)序鑒定，可在轉(zhuǎn)基因后代中分離到無(wú)轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的純合株系，而且其突變特性可穩(wěn)定遺傳給后代，2-AP含量的檢測(cè)結(jié)果表明，這些轉(zhuǎn)基因株系的香味成分均顯著高于對(duì)照秀水134，其香味性狀得到明顯改良。同時(shí)，秀水134與嘉58為浙江省主要推廣的粳稻品種，其本身農(nóng)藝性狀優(yōu)良，基因編輯后代株系具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

CRISPR/Cas9技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù)，其Cas9蛋白主要由RECⅠ、RECⅡ、Bridge helix、HNH、RuvC，PAM-Interacting等功能域組成，其中RECⅠ負(fù)責(zé)與向?qū)NA的結(jié)合，HNH和RuvC主要負(fù)責(zé)單鏈DNA的切割[27-28]。隨著Cas9蛋白密碼子的優(yōu)化，編輯效率得到了大幅提升，Cas9核酸酶一般在PAM序列下游第3個(gè)堿基開始切割雙鏈DNA，在切割與修復(fù)的過(guò)程中產(chǎn)生突變[29-30]。本研究利用優(yōu)化的Cas9蛋白將水稻第2和第7外顯子作為靶標(biāo)序列進(jìn)行基因編輯。測(cè)序結(jié)果顯示，不同靶點(diǎn)產(chǎn)生的突變類型各不相同，不僅有單堿基插入，還有堿基缺失，甚至大片段缺失，其在靶點(diǎn)的突變?nèi)跃卟豢深A(yù)測(cè)性。但不管是堿基插入造成的移碼突變還是片段缺失造成的缺失突變，這種突變均能在后代株系中穩(wěn)定遺傳，并且其米粉中的2-AP含量顯著高于對(duì)照，因此，在改良稻米香味性狀方面仍有效。此外，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)仍存在脫靶等缺陷[31-32]，組織培養(yǎng)過(guò)程中也存在自然突變的可能。因此，基因編輯株系在香味性狀得到改良的前提下，其潛在的突變等仍需要做進(jìn)一步的分析，從而為優(yōu)良香型水稻材料的創(chuàng)制提供重要的種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可對(duì)水稻香味基因第2和第7外顯子進(jìn)行定向突變，且這種突變能夠穩(wěn)定遺傳給后代。無(wú)標(biāo)記基因編輯株系稻米中香味成分2-AP含量極顯著高于對(duì)照秀水134，通過(guò)基因編輯可實(shí)現(xiàn)對(duì)稻米香味性狀的定向改良。

[1] Yajima I, Yanai T, Nakamura M, Sakakibara H, Habu T. Volatile flavor components of cooked rice kaorimai (scented rice,.)., 1979, 43: 2425-2429.

[2] Buttery R G, Ling L C, Juliano B O, Turnbaugh J G. Cooked rice aroma and 2-acetyl-1-pyrroline., 1983, 31: 823-826.

[3] Li Q L, Gao X R, Yu X H, Wang X Z, An L J. Molecular cloning and characterization of betaine aldehyde dehydrogenase gene fromand its use in improved tolerance to salinity in transgenic tobacco., 2003, 25(17): 1431-1436.

[4] Chen S, Yang Y, Shi W, Ji Q, He F, Zhang Z, Cheng Z, Liu X, Xu M., encoding betaine aldehyde dehydrogenase, inhibits the biosynthesis of 2-acetyl-1-pyrroline, a major component in rice fragrance., 2008, 20(7): 1850-1861.

[5] Bradbury L M, Fitzgerald T L, Henry R J, Jin Q, Waters D L. The gene for fragrance in rice., 2005, 3(3):363-370.

[6] Sakthivel K, Sundaram R M, Shobha Rani N, Balachandran S M, Neeraja C N. Genetic and molecular basis of fragrance in rice., 2009, 27(4): 468-473.

[7] Okpala N E, Mo Z, Duan M, Tang X. The genetics and biosynthesis of 2-acetyl-1-pyrroline in fragrant rice., 2019, 135: 272-276.

[8] 余亞瑩, 邵高能, 圣忠華, 蔣漢偉, 賀記外, 孫園園, 蔡怡聰, 胡培松,唐紹清. 國(guó)內(nèi)外香稻資源遺傳多樣性研究. 植物分類與資源學(xué)報(bào), 2015, 37(6): 871-880.

YU Y Y, SHAO G N, SHENG Z H, JIANG H W, HE J W, SUN Y Y, CAI Y C, HU P S, TANG S Q. Genetic diversity of global aromatic rice varieties., 2015, 37(6): 871-880. (in Chinese)

[9] Shao G, Tang S, Chen M, Wei X, He J, Luo J, Jiao G, Hu Y, Xie L, Hu P. Haplotype variation at, the gene determining fragrance in rice., 2013, 101(2): 157-162.

[10] 張江麗, 李蘇潔, 李娟, 普世皇, 普玉嬌, 張亮, 譚亞玲, 陳麗娟, 譚學(xué)林, 金壽林, 文建成. 不同來(lái)源水稻種質(zhì)資源香味基因位點(diǎn)的鑒定. 分子植物育種, 2015, 13(4): 727-733.

Zhang J l, Li S j, Li J, Pu S H, Pu Y j, Zhang L, Tan Y l, Chen L j, Tan X l, Jin S l, Wen J c. Identification of the fragrant genelocus in rice germplasm resources original from different area., 2015, 13(4): 727-733. (in Chinese)

[11] Sood B C, Siddiq E A. A rapid technique for scent determination in rice., 38 (1978): 268-271.

[12] Lorieux M, Petrov M, Huang N, Guiderdoni E, Ghesquière A. Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait., 1996, 93(7): 1145-1151.

[13] Jin Q S, Waters D, Cordeiro G M, Henry R J, Reinke R F. A single nucleotide polymorphism (SNP) marker linked to the fragrance gene in rice (L.)., 2003, 165: 359-364.

[14] Masouleh A K, Waters D L, Reinke R F, Henry R J. A high-throughput assay for rapid and simultaneous analysis of perfect markers for important quality and agronomic traits in rice using multiplexed MALDI-TOF mass spectrometry., 2009, 7(4): 355-363.

[15] 陸艷婷, 劉慶龍, 王俊敏, 嚴(yán)文潮, 俞法明, 金慶生. 利用等位基因特異擴(kuò)增快速檢測(cè)水稻香味基因. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34(2): 243-246.

LU Y T, LIU Q L, WANG J M, YAN W C, YU F M, JIN Q S. Detection of rice fragrant gene by allele-specific amplification., 2008, 34(2): 243-246. (in Chinese)

[16] Niu X, Tang W, Huang W, Ren G, Wang Q, Luo D, Xiao Y, Yang S, Wang F, Lu BR, Gao F, Lu T, Liu Y. RNAi-directed downregulation ofresults in aroma (2-acetyl-1-pyrroline) production in rice (L.)., 2008, 8: 100.

[17] Chen M L, Wei X J, Shao G N, Tang S Q, Luo J, Hu P S. Fragrance of the rice grain achieved via artificial microRNA-induced down-regulation of., 2012, 131: 584-590.

[18] Shan Q, Wang Y, Chen K, Liang Z, Li J, Zhang Y, Zhang K, Liu J, Voytas D F, Zheng X, Zhang Y, Gao C. Rapid and efficient gene modification in rice andusing TALENs., 2013, 6: 1365-1368.

[19] Cantos C, Francisco P, Trijatmiko K R, Slamet- Loedin I, Chadha-Mohanty P K. Identification of "safe harbor" loci in indica rice genome by harnessing the property of zinc-finger nucleases to induce DNA damage and repair., 2014, 26; 5: 302.

[20] Liang Z, Zhang K, Chen K, Gao C. Targeted mutagenesis inusing TALENs and the CRISPR/Cas system., 2014, 41: 63-68.

[21] Shan Q, Zhang Y, Chen K, Zhang K, Gao C. Creation of fragrant rice by targeted knockout of thegene using TALEN technology., 2015, 13(6): 791-800.

[22] 邵高能, 謝黎虹, 焦桂愛, 魏祥進(jìn), 圣忠華, 唐紹清, 胡培松. 利用CRISPR/CAS9技術(shù)編輯水稻香味基因. 中國(guó)水稻科學(xué), 2017, 31(2): 216-222.

SHAO G N, XIE L H, JIAO G A, WEI X J, SHENG Z H, TANG S Q, HU P S. CRISPR/CAS9-mediated editing of the fragrant gene, 2017, 31(2): 216-222. (in Chinese)

[23] Jain S, Jain R K, Mccouch S R. Genetic analysis of Indian aromatic and quality rice (L.) germplasm using panels of fluorescently-labeled microsatellite markers., 2004, 109(5): 965-977.

[24] Pachauri V, Singh M K, Singh A K. Origin and genetic diversity of aromatic rice varieties，molecular breeding and chemical and genetic basis of rice aroma., 2010, 19(2): 127-143.

[25] 鄭家團(tuán), 楊德衛(wèi), 董煉飛, 游晴如, 鄭軼, 涂詩(shī)航, 周鵬. 香型水稻的遺傳和育種現(xiàn)狀. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 27(10): 1134-1138.

ZHENG J T, YANG D W, DONG L F, YOU Q R, ZHENG Y, TU S H, ZHOU P. Inheritance and breeding actuality of new quasi-aromatic rice (L.)., 2012, 27(10): 1134-1138. (in Chinese)

[26] 黃庭旭, 江文清, 游晴如, 周仕全, 劉端華, 謝冬容, 邱慧明. 秈型香稻恢復(fù)系大粒香-15的選育與利用. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 21(2): 83-88.

Huang T X, Jiang W Q, You Q R, ZHOU S Q, LIU D H, XIE D R, QIU H M. Breeding and utilization of fragrant restoring line Dalixiang 15 ofhybrid rice., 2006, 21(2): 83-88. (in Chinese)

[27] Friedland A E, Tzur Y B, Esvelt K M, Colaiácovo M P, Church G M, Calarco J A. Heritable genome editing invia a CRISPR-Cas9 system., 2013, 10: 741-743.

[28] Xie K, Zhang J, Yang Y. Genome-wide prediction of highly specific guide RNA spacers for CRISPR-Cas9-mediated genome editing in model plants and major crops., 2014, 7: 923-926.

[29] Feng Z, Mao Y, Xu N, Zhang B, Wei P, Yang D L, Wang Z, Zhang Z, Zheng R, Yang L, Zeng L, Liu X, Zhu J K. Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in., 2014, 111: 4632-4637.

[30] Luo M, Gilbert B, Ayliffe M. Applications of CRISPR/Cas9 technology for targeted mutagenesis, gene replacement and stacking of genes in higher plants., 2016, 35(7): 1439-1450.

[31] Endo M, Mikami M, Toki S. Multigene knockout utilizing off-target mutations of the CRISPR/Cas9 system in rice., 2015, 56: 41-47.

[32] Pattanayak V, Lin S, Guilinger J P, Ma E, Doudna J A, Liu D R. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity., 2013, 31(9): 839-843.

CRISPR/Cas9 Targeted Editing for the Fragrant Gene

Qi YongBin, Zhang LiXia, Wang LinYou, Song Jian, Wang JianJun

(Institute of Crop Science and Nuclear Technology Utilization, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021)

【Objective】Rice fragrance, a very important trait for quality improvement, is mainly controlled by a recessive geneIn this study, CRISPR/Cas9-mediated editing were used to generate the gene-edited rice plants with the fragrant【Method】 The targeted sequences were designed according to the sequence of exon2 and exon7 of theby the principle of CRISPR/Cas9 gene editing. Its specificity of the targeted sequence was determined by Blast analysis, and then constructed into CRISPR/Cas9 expression vector. The callus of Jia58 and Xiushui134 which are widely cultivated in the Zhejiang Province were selected as explants to transform by-mediated genetic transformation, and the positive transgenic plants were obtained by the screening of hygromycin resistance. Sequencing analysis of transgenic lines was used to detect the presence of the mutation type on the loci of. Stable marker-free gene-edited lines carrying the mutation onwere obtained by PCR analysis and identification. The content of 2-AP in the brown rice flour were measured by GC-MS, and the difference between the gene-edited lines and non-transgenic control was determined. 【Result】of the transgenic lines was directionally mutated by the genetic transformation using the expression vector on which the target sequence of the exon2 and exon7 were designed and constructed. A total of 15 T0gene-edited lines were obtained from Jia58. Eight of them were generated mutation on the exon2 with five different mutations types in which different single base was inserted into different position. Seven of them were generated mutations on the exon7 with five different mutation types in which the base or fragment deletion was produced. A total of 11 T0gene-edited lines were obtained from Xiushui134, of which five lines were generated mutations on the exon2 with the single base insertion and six lines on the exon7 with the fragment deletion. A total of 16 marker-free gene-edited lines were obtained from 48 T1Xiushui134, of which five lines were generated mutations on the exon2, and 11 lines on the exon7. The average 2-AP content in brown rice flour of four T2gene-edited lines were 0.309, 0.347, 0.332 and 0.295 μg·g-1respectively, which were significantly higher (<0.01) than that of the non-transgenic control (0.046 μg·g-1). 【Conclusion】 Thewhich controlled the rice fragrance trait was directionally edited by using CRISPR/Cas9-mediated technology, and the marker-free gene-edited lines were obtained, of which the fragrance ofedited lines were significantly improved.

rice; CRISPR/Cas9; gene editing;; fragrance

2019-09-02；

2019-11-30

浙江省科技廳公益技術(shù)研究項(xiàng)目（2017C32007）、浙江省糧食新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02050）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“七大作物育種”重點(diǎn)專項(xiàng)（2017YFD0100302）、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2018R16R08E01）

祁永斌，E-mail：qi_yongbin@hotmail.com。通信作者王建軍，E-mail：wangjj4197@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）