次 仁，江朝源，朱 玲，3，徐志文，3

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.林芝市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，西藏 林芝 850400；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）

蓋塔病毒（Getah virus,GETV）是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒屬（Alphavirus）成員[1]。1995 年Scherer等首次在馬來(lái)西亞橡膠林中生存的白雪庫(kù)蚊（Culex gelidus）中分離得到該病毒[2]。GETV可感染多種動(dòng)物并引起馬和豬發(fā)病。2017年湖南省暴發(fā)GETV豬群感染導(dǎo)致大量母豬流產(chǎn)和仔豬死亡，同年10月周峰等首次報(bào)道中國(guó)河南省某豬場(chǎng)的豬感染蓋塔病毒[3]，這種病毒對(duì)10日齡內(nèi)仔豬有致病性，其癥狀表現(xiàn)為引起仔豬發(fā)燒、蕁麻樣皮疹和后肢水腫并伴有關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡，同時(shí)也會(huì)造成成年母豬繁殖障礙[1]。

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的以造成成年母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸困難為主要特征的傳染病，各種品種和年齡的豬均可感染，但以妊娠母豬和1月齡的仔豬最易感，在臨床上難以對(duì)兩種病毒進(jìn)行區(qū)分[4]。

本研究對(duì)中國(guó)四川省綿陽(yáng)某豬場(chǎng)送檢的流產(chǎn)胎兒和病死仔豬利用PCR和RT-PCR方法進(jìn)行豬病毒性疫病的病原檢測(cè)，診斷結(jié)果表明該例患病豬為豬蓋塔病毒（GETV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的混合感染。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018年7月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心進(jìn)行。

1.2 材料

1.2.1 病料 病料來(lái)源于四川省綿陽(yáng)某豬場(chǎng)送檢的流產(chǎn)胎兒和病豬。

1.2.2 主要設(shè)備和試劑 RNAiso Plus來(lái)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；DL 2 000 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、2×Taq PCR Master-Mix、Nuceanse-Free water和pMD19-Tsimple載體，來(lái)自大連寶生物工程有限公司；Trizol LSReagent、小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒和小量膠回收試劑盒，于北京博邁德生物技術(shù)有限公司購(gòu)買。大腸桿菌DH5α由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心制備。PCR儀、Gel DocTMEZ imager凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司，恒溫水浴鍋、恒溫?fù)u床購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2.3 檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank上GETV M1株全基因[7]（登錄號(hào)為：EU015061），利用Primer Premiers 5.0軟件針對(duì)Cap部分序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物[由生物工程（上海）公司合成]，藍(lán)耳病采用實(shí)驗(yàn)室建立的高藍(lán)和NADC30雙重RT-PCR檢測(cè)引物進(jìn)行檢測(cè)，具體信息見表1。

表1 試驗(yàn)中使用的引物信息

1.3 方法

1.3.1 病料樣品處理 無(wú)菌采取送檢病料的肺、大腸共約10 g，用PBS按1∶5稀釋，研磨后反復(fù)凍融3次，保存到-20℃。

1.3.2 RNA提取 取300 μL研磨凍融后的病料液按照Trizol RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系（10 μL）：ddH2O 4.5 μL、5×Buffer 2.0 μL、反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL、dNTP 0.5 μL、隨機(jī)引物0.5 μL、模板 2.0 μL。反應(yīng)條件為：35 ℃ 5 s、85 ℃15 min，cDNA模板用于PCR擴(kuò)增。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè) PCR 體系（10 μL）：2×TaqPCR master Mix 5.0 μL、cDNA 1.0 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物0.5 μL、ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表1），72℃延伸 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行凝膠成像觀察。1.3.4 流行特點(diǎn)和病理解剖變化 詢問法了解豬場(chǎng)發(fā)病情況，常規(guī)剖解進(jìn)行大體觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR診斷

電泳結(jié)果顯示送檢病料同時(shí)出現(xiàn)PRRSV 333 bp、GETV 316 bp左右的特異性條帶，其余病原均呈陰性結(jié)果。由此說(shuō)明該樣品中同時(shí)含有PRRSV、GETV（圖 1）。

2.2 流行特點(diǎn)及臨床癥狀

四川省綿陽(yáng)市某豬場(chǎng)共有妊娠母豬120頭，仔豬約400頭，送檢流產(chǎn)胎兒為懷孕前、中、后期均有。患病仔豬初時(shí)出現(xiàn)采食量下降、被毛粗亂、皮膚蒼白、精神沉郁等癥狀，懷孕母豬大量流產(chǎn)。隨后豬只體溫升高達(dá)40～41℃，食欲減少，咳嗽，急喘，耳朵及腹部下皮膚發(fā)紺，漸進(jìn)性消瘦，最后呼吸困難，衰竭而死。

2.3 剖檢病變

隨機(jī)抽取1頭發(fā)病活豬和1頭病死仔豬進(jìn)行剖檢，剖檢病變主要為肺呈橡皮樣，肺臟出血且肺間質(zhì)增寬，腹股溝淋巴結(jié)腫大出血，腎臟出現(xiàn)白色壞色斑，腸系膜淋巴結(jié)腫大，其他臟器無(wú)明顯病變。

3 討論

根據(jù)臨床癥狀、剖檢病變，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等綜合判定，本次豬場(chǎng)發(fā)病豬主要是由藍(lán)耳病病毒（NADC30株）和豬蓋塔病毒引起的混合感染。

PRRSV作為能夠引起呼吸和繁殖方面疾病的病毒，可通過呼吸道傳播，豬的規(guī)?；B(yǎng)殖模式為PRRSV大規(guī)模暴發(fā)提供了潛在條件，疾病一旦暴發(fā)，傳播迅速，導(dǎo)致大量仔豬死亡，會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。GETV屬于人畜共患病病毒，近兩年來(lái)中國(guó)開始報(bào)道分離到豬源的GETV，周峰等[3]于2017年報(bào)道分離到該病毒，并在山西、湖北、河南、安徽四省豬場(chǎng)中檢測(cè)出37份陽(yáng)性樣本，同時(shí)在2017年湖南省豬群中發(fā)生了大規(guī)模GETV的感染，大量仔豬死亡，母豬流產(chǎn)導(dǎo)致了重大經(jīng)濟(jì)損失[5]，于2018年分離到第1株四川省豬源蓋塔病毒[6]。兩種病毒均能導(dǎo)致母豬流產(chǎn)，在臨床上僅通過癥狀難以區(qū)分兩種病毒，同時(shí)近年來(lái)病豬混合感染的比例不斷攀升，其中PRRSV和PCV均屬于免疫缺陷病，袁婧等在報(bào)道中指出，這兩種免疫缺陷病與多種病原混合感染的現(xiàn)象十分普遍[7]，給疾病的防治工作帶來(lái)了困難，多重PCR技術(shù)具有快速診斷、敏感度高的特點(diǎn)，將會(huì)在動(dòng)物疫病的監(jiān)控、診斷、防疫等方面發(fā)揮作用。

GETV作為新出現(xiàn)在人們視野中導(dǎo)致母豬流產(chǎn)的病毒，其與各個(gè)病原混合感染之間的機(jī)制尚不清楚，但在臨床研究中開展流行病學(xué)調(diào)查和建立混合感染檢測(cè)方法，并分析其流行病學(xué)特征十分有必要。