藺俐仲，徐春志，張 海，景書灝，楊 源，劉 艷，劉 霞，李照偉

（1.貴陽市草地站，貴州 貴陽 550081；2.貴陽市動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550081；3.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550081）

FMD（豬口蹄疫）、CSF（豬瘟）、PRRS（豬繁殖與呼吸綜合征）和PR（豬偽狂犬?。┦且?guī)模化養(yǎng)豬場最常見的幾種主要病毒性疫病[1]，也是當前我國開展“規(guī)?；N豬場主要動物疫病凈化創(chuàng)建場”和“規(guī)模化種豬場主要動物疫病凈化示范場”評估認證工作中必檢的疫病。其中，F(xiàn)MD是嚴重危害偶蹄動物的傳染病，主要引起畜體口腔黏膜、舌面、唇、鼻鏡、乳頭及蹄叉等部位形成或發(fā)生水皰，嚴重者可致死亡，嚴重影響畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，并造成巨大經(jīng)濟損失，甚至還會帶來國際政治影響，素有“政治經(jīng)濟病”之稱[2]，使家畜及其產(chǎn)品的國際貿(mào)易受阻[3]。CSF、PRRS和PR是豬群常見的繁殖障礙性疫病，可導致妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、病弱胎或畸形胎，嚴重危害畜牧業(yè)的發(fā)展[4]。因此，做好上述幾種病毒性疫病的檢測評估與凈化對養(yǎng)豬場十分必要[5]。為了掌握某種豬場FMD、CSF、PRRS和PR的免疫抗體水平以及野毒感染情況，以加快貴陽市規(guī)模化養(yǎng)豬場主要動物疫病凈化工作步伐，課題組于2019年6—9月對某種豬場開展了豬群健康狀態(tài)監(jiān)測評估，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清和組織樣本 2019年6—8月采集貴陽市某規(guī)?；N豬場血清和扁桃體組織樣本各362份，其中生產(chǎn)公豬12份，后備母豬166份，經(jīng)產(chǎn)母豬184份。經(jīng)調(diào)查，所采集豬只于2019年4—5月期間分別免疫過豬口蹄疫O型滅活疫苗（新疆天康）、高致病性豬藍耳病弱毒疫苗（新疆天康）、豬瘟傳代細胞苗（哈藥集團）和豬偽狂犬病活疫苗（武漢科前）。具體免疫程序如下：FMD（每4個月免疫1次），CSF（種公豬每年春、秋季各免疫1次；種母豬配種前10 d免疫1次，產(chǎn)后10 d加強免疫1次，以后每次免疫應于產(chǎn)后進行，妊娠期不再免疫），PRRS（種公豬每年春、秋季各免疫1次；后備種豬配種前5～6周和2～3周各免疫1次；生產(chǎn)母豬配種前12 d免疫1次，以后每5個月免疫1次）和PR（種公豬每年春、秋季各免疫1次；后備種豬配種前7 d免疫1次，以后每隔4個月免疫1次）。

1.1.2 檢測試劑盒 豬O型口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒gB蛋白和豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限公司；豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC-ELISA抗體檢測試劑盒購自深圳市康百得生物科技有限公司；口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，豬瘟病毒野毒株實時熒光RT-PCR檢測試劑盒和豬偽狂犬病病毒（gE基因）實時熒光PCR檢測試劑盒均購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血清抗體檢測 采集的血清樣本按照標記順序嚴格按上述6種ELISA抗體檢測試劑盒操作說明分別進行FMD、CSF、PRRS、PR的抗體水平檢測和結(jié)果判定。

1.2.2 實時熒光PCR/RT-PCR檢測 取采集的扁桃體組織樣本置于滅菌的1.5 mL離心管中，按3～5倍體積加入0.9%的生理鹽水后采用手持式研磨器研磨勻漿，反復凍融3次后12 000 r/min高速離心，取上清液作為備檢樣本。按照上述病毒核酸提取試劑盒操作說明對備檢樣本進行病毒核酸提取，并按上述實時熒光PCR/RT-PCR擴增試劑盒操作說明分別進行體系構(gòu)建和目的基因擴增，擴增結(jié)束后觀察擴增曲線和CT值對結(jié)果進行判定。

2 結(jié)果

2.1 FMD、CSF、PRRS和PR免疫抗體檢測結(jié)果

362 份豬血清經(jīng)豬O型口蹄疫病毒（FMDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）gB蛋白ELISA抗體檢測試劑盒檢測，結(jié)果見表1。

表1檢測結(jié)果顯示，豬群FMD、CSF、PRRS和PR的抗體陽性率依次為90.61%、94.75%、88.12%和96.96%。由于該種豬場已免疫過FMD、CSF、PRRS和PR疫苗，且臨床上未觀察到上述4種疫病的癥狀，豬群臨床健康狀況良好，檢測結(jié)果表明4種疫病的整體抗體陽性率較高，均超過了國家規(guī)定標準70%，說明該場的疫苗免疫效果較好。

表1 免疫抗體檢測結(jié)果

2.2 FMD和PR感染抗體檢測結(jié)果

362 份豬血清經(jīng)豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC-ELISA抗體檢測試劑盒和豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒檢測，結(jié)果見表2。

表2檢測結(jié)果顯示，豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白和豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體陽性率分別為1.38%和3.59%。由于豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC-ELISA抗體檢測試劑盒和豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒檢測的均為野毒感染抗體，檢測結(jié)果提示：該種豬場存在FMDV和PRV隱性感染的可能性。

表2 感染抗體檢測結(jié)果

2.3 FMDV、CSFV、PRRSV和 PRV實時熒光 PCR/RT-PCR檢測結(jié)果

362 份豬扁桃體組織樣本經(jīng) FMDV、CSFV、PRRSV和PRV實時熒光PCR/RT-PCR檢測試劑盒檢測，結(jié)果見表3。

表3檢測結(jié)果顯示，362份豬扁桃體組織樣本經(jīng)實時熒光PCR/RT-PCR擴增后，F(xiàn)MD、CSF、PRRS和PR的病毒核酸陽性率依次為 0、0.83%、0和1.38%，檢測結(jié)果說明被檢樣本中有CSF和PR野毒感染情況。

表3 實時熒光PCR/RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

3.1 本試驗采用ELISA和實時熒光PCR/RT-PCR方法對種豬場開展了豬群健康狀態(tài)檢測分析，通過檢測分析充分掌握了該豬場FMD、CSF、PRRS和PR的免疫抗體水平和野毒感染情況。試驗結(jié)果表明：該豬場4種病毒性疫病的免疫抗體水平較高，說明疫苗免疫效果較好；但FMD和PR的野毒感染抗體檢測結(jié)果提示，該豬場存在FMD和PR野毒感染的風險；實時熒光PCR/RT-PCR檢測結(jié)果說明，該豬場存在CSF和PR野毒感染情況。針對上述檢測結(jié)果分析評估，建議該豬場今后應繼續(xù)加強疫苗免疫，并立即對檢出的CSF和PR病毒核酸陽性豬只進行淘汰處理，同時加強對FMD和PR感染抗體陽性豬只的隔離和監(jiān)控。

3.2 經(jīng)調(diào)查，該豬場免疫的FMD和PR疫苗分別為非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC基因和gE蛋白基因缺失苗，課題組為了保證檢測結(jié)果的準確性，對FMD、PR的感染情況檢測采用缺失基因ELISA抗體檢測和實時熒光PCR/RT-PCR相結(jié)合的方法。檢測結(jié)果中PR的野毒感染抗體和實時熒光PCR均出現(xiàn)了陽性，且實時熒光PCR檢出的陽性樣本均顯示野毒感染抗體陽性，進一步說明了該豬場存在PR野毒感染情況；而FMD實時熒光RT-PCR病毒核酸檢出率雖為0，但野毒感染抗體檢測出現(xiàn)了陽性，因此并不能完全排除該場存在FMD野毒感染的可能。經(jīng)查閱相關(guān)資料[6-8]，對FMDV核酸檢測檢出率最高的組織部位為頜下淋巴結(jié)，而PRV檢出率最高的組織部位為三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球和腦，其次為扁桃體和內(nèi)臟。本試驗檢測評估的豬場為臨床健康豬群，未能活體采集到頜下淋巴結(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)和嗅球等組織樣本，只能活體采集扁桃體組織樣本替代，因此不排除實時熒光PCR/RT-PCR出現(xiàn)漏檢的可能。

3.3 FMD、CSF、PRRS和PR是國家開展“規(guī)?；N豬場主要動物疫病凈化創(chuàng)建場”和“規(guī)?；N豬場主要動物疫病凈化示范場”評估認證指定的4個必檢病種，因此做好種豬場FMD、CSF、PRRS和PR的監(jiān)測評估工作十分必要。對照“兩場”評估認證標準，本次所監(jiān)測評估的種豬場豬群健康狀態(tài)達到了申報“規(guī)?；N豬場主要動物疫病凈化創(chuàng)建場”的要求（種豬群或后備豬群CSF免疫抗體合格率≥80%，F(xiàn)MD免疫抗體合格率≥70%，PR gE抗體陽性率≤10%，PRRS無臨床發(fā)病記錄），而要申報“規(guī)模化種豬場主要動物疫病凈化示范場”免疫凈化標準尚需對FMD、CSF和PR的野毒感染進行徹底凈化，同時應進一步提高PRRS的免疫抗體合格率至90%以上。