閆益波，焦福林，李文剛

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

1 引言

溫度是畜牧業(yè)的生產(chǎn)過程中備受關(guān)注的環(huán)境因子之一，廣泛地影響哺乳動(dòng)物的生理狀態(tài)、生長發(fā)育、繁殖過程和生產(chǎn)性能。Young等[1]通過研究動(dòng)物產(chǎn)熱與環(huán)境溫度之間的關(guān)系，提出了動(dòng)物的“熱中性區(qū)（Thermoneutral Zone,TMZ）或等熱區(qū)（Zones of Thermal Comfort,ZTC）”這一概念，在熱中性區(qū)內(nèi)動(dòng)物機(jī)體可借助行為變化和生理化學(xué)過程維持體溫恒定和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)環(huán)境溫度超出臨界溫度上限時(shí)，常引起動(dòng)物的熱應(yīng)激（Heat Stress,HS）反應(yīng)[2-3]。動(dòng)物的熱應(yīng)激反應(yīng)主要有：產(chǎn)熱量增加、排汗量增多、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性降低等；輕度熱應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)為體溫調(diào)節(jié)、水鹽代謝、心血管系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等功能的改變，但是若熱應(yīng)激過度，則可能出現(xiàn)熱損傷，甚至導(dǎo)致不可恢復(fù)的功能喪失[4]。

豬是一種溫度敏感性（temperature sensitive）動(dòng)物，由于其皮下脂肪較厚，汗腺不發(fā)達(dá)，熱調(diào)節(jié)機(jī)制較差，機(jī)體代謝過程產(chǎn)生的熱量較難通過皮膚蒸發(fā)，因此很不耐熱。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，豬繁殖性狀的遺傳力介于0.1～0.3之間，屬于低遺傳力性狀[4]，遺傳因素影響較小，環(huán)境因素的影響較大。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，季節(jié)性的高溫和集約化養(yǎng)殖方式引起的熱應(yīng)激行為，影響著豬的生產(chǎn)性能和繁殖性能。豬的正常體溫約為38～39.5℃，最適宜的環(huán)境溫度一般為18～24℃，公豬對(duì)環(huán)境溫度尤其敏感[5-6]，高溫對(duì)于其繁殖性能的影響十分顯著，因此全面研究熱應(yīng)激對(duì)種公豬繁殖性能的影響，深入探討其生理機(jī)制和調(diào)控機(jī)制，對(duì)采取合適降溫措施和營養(yǎng)調(diào)控措施，保護(hù)生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有積極的意義。

2 熱應(yīng)激對(duì)種公豬繁殖性能的影響

種公豬的繁殖性能主要由性欲、精液質(zhì)量與肢蹄結(jié)實(shí)度3方面共同決定[7]。在實(shí)際生產(chǎn)中，性欲低下和精液品質(zhì)差是導(dǎo)致種公豬淘汰的兩大主要原因[8]。大量研究已經(jīng)指出，高溫引起的熱應(yīng)激顯著影響了種公豬的性欲和精液品質(zhì)，導(dǎo)致后備母豬的受孕率和胚胎成活率顯著降低。

2.1 熱應(yīng)激導(dǎo)致種公豬性欲低下

種公豬的性欲直接決定著采精的效率，同時(shí)也決定了種公豬的使用年限，制約著生豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。研究結(jié)果表明高溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致公豬性欲降低，當(dāng)外界環(huán)境溫度升高后，公豬性欲明顯降低，但輕度熱應(yīng)激造成的不利影響會(huì)隨著環(huán)境溫度改善而逐漸消失[9]。研究也發(fā)現(xiàn)，夏季季節(jié)性高溫會(huì)導(dǎo)致16%公豬不能采精[10]。

2.2 熱應(yīng)激導(dǎo)致種公豬睪丸退化、精液品質(zhì)變差

種公豬的精液品質(zhì)常用精液量、精子密度、精子活力及精子畸形4個(gè)指標(biāo)衡量[11]。一般而言，公豬每次射精量介于200～300 mL之間，精液中包含10×109～10×1010個(gè)精子[12]。

豬的正常體溫約為38～39.5℃，最適宜的環(huán)境溫度一般為18～24℃。在適宜的溫度范圍內(nèi)豬睪丸內(nèi)動(dòng)脈血的溫度一般低于35℃，靜脈血的溫度低于33℃，使得睪丸內(nèi)的溫度明顯低于核心體溫，為精子正常的發(fā)生過程提供了良好的低溫環(huán)境。高溫引起的睪丸溫度上升是影響種公豬繁殖性能的主要原因，熱應(yīng)激可能導(dǎo)致精子形成過程發(fā)生紊亂，精子形態(tài)發(fā)生變化（近端原生質(zhì)滴未移行脫落、頂體異常、頭部缺失、尾部彎曲等）[13]，精子活力降低，有效精子數(shù)量較少，進(jìn)而影響母豬的受孕率和胚胎的成活率。如表1所示，大量的研究證明季節(jié)性高溫或者人工控制高溫處理過程會(huì)顯著影響種公豬精子正常形成，從而影響種公豬的繁殖性能。

不同程度的熱應(yīng)激引起的變化也不盡相同。當(dāng)環(huán)境溫度高于27℃持續(xù)14 d，公豬精子活力降低，異常精子數(shù)目增加；環(huán)境溫度高于30℃時(shí)，每上升1℃，精子活力下降0.1。刁寧寧等[4]認(rèn)為精母細(xì)胞對(duì)溫度敏感性高，因而熱應(yīng)激引起的不利影響在精子形成期更加明顯。當(dāng)睪丸溫度達(dá)到36℃，持續(xù)2～3周內(nèi)會(huì)出現(xiàn)畸形精子；睪丸溫度達(dá)到40.5℃時(shí)，精子生成嚴(yán)重受損，持續(xù)3 h后精子幾乎全部喪失活力。精子形成期，精母細(xì)胞對(duì)溫度敏感性高，熱應(yīng)激引起的消極影響更加明顯。精子生成后貯存于附睪中呈休眠狀態(tài)，此時(shí)熱應(yīng)激兩周后精液質(zhì)量才明顯下降。

表1 熱應(yīng)激對(duì)種公豬繁殖性能的影響

3 熱應(yīng)激影響公豬繁殖性能的生理機(jī)制

3.1 熱應(yīng)激引起的緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞，影響了種公豬的繁殖性能

睪丸組織中，睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cell,SC）和生精細(xì)胞通過緊密連接形成的“血睪屏障”對(duì)于精子的形成具有重要的作用。一方面，睪丸支持細(xì)胞為發(fā)育中的精子提供必要的物理支持和營養(yǎng)。另一方面，血睪屏障的存在將生精上皮分為基底室和近腔室，為精子的發(fā)育提供了相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，例如血睪屏障有效阻止淋巴液和組織液進(jìn)入近腔室，保證近腔室中精母細(xì)胞的分裂、分化和精子的變態(tài)過程在相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境中進(jìn)行；同時(shí)血睪屏障將各級(jí)精母細(xì)胞和免疫系統(tǒng)隔離開來，阻止機(jī)體免疫反應(yīng)對(duì)精子產(chǎn)生不良的影響。研究發(fā)現(xiàn)，緊密連接形成與3種跨膜蛋白密切相關(guān)，閉鎖蛋白（Occludin）、封閉蛋白（Claudins）、連接 黏 附 分 子 （junction adhesive molecule,JAM）。熱應(yīng)激對(duì)于精子產(chǎn)生的不良影響，可能是通過影響緊密連接蛋白的表達(dá)，影響支持細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)，從而引起精子發(fā)生障礙。

熱應(yīng)激下，支持細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞作用與AMPK通路調(diào)節(jié)相關(guān)。AMP依賴性蛋白激酶[Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]通路是真核細(xì)胞內(nèi)攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、利用葡萄糖和脂肪酸等能量物質(zhì)的主要通路，廣泛參與著細(xì)胞內(nèi)的糖脂代謝、細(xì)胞凋亡、血管再生等諸多生理過程。AMPK的激活過程與細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP的比值、肝臟激酶 B1（Liver Kinase B1,LKB1）和鈣調(diào)蛋白激酶激酶（Calmodulin-dependent protein kinase kinase,CaMKKβ）表達(dá)狀況密切相關(guān)。已有研究指出，在應(yīng)激狀態(tài)（高溫、活性氧增加）下細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值升高，AMPK即被激活。AMPK通路及其調(diào)控因子在熱應(yīng)激的調(diào)控、睪丸支持細(xì)胞緊密連接形成中的重要作用，已經(jīng)在個(gè)體水平[20-21]和細(xì)胞水平[22]上得到了大量的驗(yàn)證。在種公豬的研究[23]中，體外培養(yǎng)的睪丸支持體外細(xì)胞中經(jīng)熱（42℃）處理過程中，其上游信號(hào)分子CaMKKβ表達(dá)量下降，僅為對(duì)照組的46%，ATP水平降低，AMPK活性受到抑制，緊密連接蛋白（occludin和claudin-11）的表達(dá)量顯著下降，體外細(xì)胞發(fā)育受阻，緊密連接結(jié)構(gòu)無法正常形成。

AMPK通路中，熱應(yīng)激也引起了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體（GLUT18）的變化[24]。GLUT1-8負(fù)責(zé)了葡糖糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，是細(xì)胞內(nèi)糖代謝的主要調(diào)節(jié)因子。睪丸組織中，各級(jí)精細(xì)胞需要豐富的營養(yǎng)物質(zhì)供給以順利完成其減數(shù)分裂或有絲分裂過程，保障精子的正常形成。研究表明種公豬睪丸組織中GLUT1、GLUT5、GLUT8均有表達(dá)，熱應(yīng)激（42℃）條件下，這些因子的表達(dá)量顯著增加，生精細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用加快，造成睪丸內(nèi)葡萄糖和糖原水平下降，蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)發(fā)生不可逆損傷，代謝水平改變，精子發(fā)生嚴(yán)重受阻。

3.2 熱應(yīng)激引起的激素分泌紊亂，影響了種公豬的繁殖性能

精子的發(fā)生受下丘腦-垂體-睪丸軸及其相關(guān)激素的調(diào)節(jié)，例如下丘腦分泌促性腺激素釋放激素（GNRH）、黃體生成素（LH）和卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone,FSH）。睪丸溫度過高會(huì)減少雄激素的合成，而雄激素可以刺激精子生成，延長精子在附睪內(nèi)的壽命；同時(shí)睪丸組織合成睪酮能力下降，而睪酮可以刺激生精細(xì)胞的分裂成熟。對(duì)睪丸細(xì)胞進(jìn)行34℃、8 h連續(xù)處理90 d后，其雄激素合成能力明顯降低，血中睪酮濃度明顯下降[10]。

3.3 熱應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡過程，影響了種公豬的繁殖性能

熱應(yīng)激導(dǎo)致凋亡蛋白的高表達(dá)，和精細(xì)胞凋亡過程的加速可能導(dǎo)致了種公豬的無精癥和少精癥[25-26]。細(xì)胞凋亡過程，受到Bcl-2、線粒體細(xì)胞色素C（Cyt-C）、凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Caspase-9）蛋白的共同調(diào)節(jié)。細(xì)胞受到外界刺激后，胞質(zhì)中Bcl-2蛋白表達(dá)量的變化，改變了線粒體的通透性，細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與凋亡誘導(dǎo)因子Apaf-1相互結(jié)合，并激活下游Caspase-9，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激（40～42℃）條件下豬睪丸Apaf-1和Bcl-2在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量升高，而Caspase-9于減數(shù)分裂后的生精細(xì)胞表達(dá)量升高，影響精子發(fā)生，導(dǎo)致精液品質(zhì)下降[24，26]。

高溫引起的熱應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）數(shù)量高于正常水平，也誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡過程，影響精子的正常發(fā)生[27]。正常生理狀態(tài)下，ROS能夠增強(qiáng)精子磷脂酶的活性，促進(jìn)頂體反應(yīng)，調(diào)節(jié)精子對(duì)卵細(xì)胞的黏附過程。然而，過量ROS常與精子活力降低，精子畸形率增加密切相關(guān)，研究指出過量的ROS可能會(huì)破壞細(xì)胞的蛋白質(zhì)和DNA，破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致膜流動(dòng)性下降，誘導(dǎo)生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡等。熱應(yīng)激（42℃，3 h）下種公豬睪丸細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著使睪丸細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)而可能影響睪丸的生殖功能[28]。

4 小結(jié)

熱應(yīng)激會(huì)造成種公豬性欲低下，精液品質(zhì)變差（采精量下降，精子活力降低，精子形態(tài)變化，畸形率增加）等許多消極影響，這些變化與熱應(yīng)激引起的睪丸支持細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，AMPK調(diào)控通路變化，生殖激素分泌紊亂以及細(xì)胞凋亡加劇等多種生理機(jī)制密切相關(guān)。深入研究熱應(yīng)激與種公豬繁殖性能之間的關(guān)系，有助于理解在實(shí)際生產(chǎn)過程中通過營養(yǎng)措施減弱或消除熱應(yīng)激的負(fù)面效應(yīng)的機(jī)制（例如維持電解質(zhì)平衡，添加維生素C等措施很可能與活性氧的調(diào)節(jié)相關(guān)），并輔之以必要的降溫措施，能夠有效改善種公豬的繁殖性能。