張忠臣 吳麗麗 王國平

結(jié)直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，尤其近年來在青年中發(fā)病率呈增高趨勢(shì)[1]。高遷移率蛋白A2（high mobility group protein A2，HMGA2）是高遷移率蛋白A（因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速度快而得名[2]）家族成員之一，它可通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)或與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，參與多種生物學(xué)過程，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，包括調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。除胚胎早期和未分化組織外，它在正常組織中含量較低。多種研究表明HMGA2異常表達(dá)與乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌及卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)[3-6]，在結(jié)直腸癌的研究中也發(fā)現(xiàn)HMGA2表達(dá)異常，可能與疾病的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)[7]。miRNA（miR）是一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子，它通過抑制mRNA的翻譯或降解mRNA來影響細(xì)胞增殖周期及凋亡。越來越多的證據(jù)表明miR的異常表達(dá)在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[8-11]。生物信息學(xué)分析顯示miR-150與HMGA2的3′-端非翻譯區(qū)（3′-UTR）基因序列具有靶向互補(bǔ)關(guān)系。本研究探討miR-150和HMGA2在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖周期中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（FHC）均購自上海珍妮生物技術(shù)公司；細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI 1640）、減血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）、杜氏培養(yǎng)基（DMEM）、FBS和青鏈霉素均購自以色列生物有限公司；脂質(zhì)體RNA iMAX轉(zhuǎn)染劑購自美國皮爾斯公司；逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green染料均購自日本大阪東洋生物公司；HMGA2小干擾RNA購自上?；蛑扑幱邢薰?；miR核苷酸片段購自廣州瑞博生物有限公司；HMGA2兔抗人抗體購自美國CST公司；小鼠抗細(xì)胞周期蛋白A抗體購自美國圣克魯斯生物科技公司；山羊抗兔抗體IgG（H+L）購自美國劍橋Abcam生物技術(shù)公司；過氧化酶標(biāo)記抗鼠兔二抗購自美國杰克遜免疫研究所；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）購自武漢博士德公司；TRIZOL試劑、人胚腎細(xì)胞（HEK293T）及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；熒光素酶基因載體pLUC購自美國奧斯汀Ambion公司。

1.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和FHC分別分為SW480細(xì)胞組和FHC組。FHC在DMEM中培養(yǎng)，SW480細(xì)胞于添加10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI 1640中培養(yǎng)，SW480細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長期時(shí)，將細(xì)胞鋪至6孔板，貼壁24 h后將SW480細(xì)胞分為miR-150對(duì)照組、miR-150模擬體組、小干擾對(duì)照組、小干擾HMGA2組和miR-150模擬體聯(lián)合小干擾HMGA2組共5組。miR-150模擬體組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-150模擬體；小干擾對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染小分子干擾RNA序列（正鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，負(fù)鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）；小干擾 HMGA2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染HMGA2特異性siRNA序列（正鏈：5′-CAGCCUGAAUAACUUGAACTT-3′，負(fù)鏈：5′-GUUCAAGUUAUUCAGGCUGTT-3′）；miR-150模擬體聯(lián)合小干擾 HMGA2組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-150模擬體及HMGA2特異性siRNA序列。轉(zhuǎn)染時(shí)采用Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋核苷酸片段和脂質(zhì)體RNAiMAX轉(zhuǎn)染劑，在室溫下培養(yǎng)5 min后，將它們混合并添加到細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 SW480細(xì)胞組和FHC組miR-150、HMGA2和周期蛋白A（Cyclin A）表達(dá)水平檢測(cè) 用Trizol試劑提取總RNA并采用RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，所使用的引物如下：miR-150PF:5′-ATAAAGTGCTGACAGTGCAGATAGTG-3′；miR-150PR:5′-TCAAGTACCCACAGTGCGGT-3′；U6PF:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；U6PR:5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；HMGA2PF:5′-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3′；HMGA2PR:5′-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3′；CyclinAPF:5′-ACATGGATGAACTAGAGCAGGG-3′；CyclinAPR:5′-GAGTGTGCCGGTGTCTACTT-3′；β-actinPF:5′-GAACCCTAAGGCCAAC-3′；β-actinPR:5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。RT-PCR反應(yīng)體系包括2×SYBR Green RT-PCR預(yù)混液10 μl，上下游引物（10 μm/l）各 0.8 μl，2 μg 互補(bǔ) DNA和蒸餾水，分別在ABI7500上進(jìn)行95℃15 s、60℃30 s、74℃30 s 40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，然后用凝膠電泳法檢測(cè)SW480細(xì)胞組和FHC組miR-150、HMGA2和Cyclin A的表達(dá)水平。

1.4 miR-150對(duì)照組和miR-150模擬體組HEK293T熒光活性的檢測(cè) 采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)兩組細(xì)胞的熒光活性。生物信息學(xué)分析顯示miR-150與HMGA2的3′-UTR基因序列具有靶向互補(bǔ)關(guān)系，取適量對(duì)數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)HMGA2的編碼序列設(shè)計(jì)含有EcoR1和BamH1限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物序列，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增并回收HMGA2編碼片段，將含有HMGA2-3′-UTR全長片段的PCR產(chǎn)物連接到pLUC質(zhì)粒DNA并將基因轉(zhuǎn)化成DH5α細(xì)胞，質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序確認(rèn)并分別命名為pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型和pLUC-HMGA2-3′-UTR-突變型，再用脂質(zhì)體RNA i-MAX 轉(zhuǎn)染劑將 pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型、pLUCHMGA2-3′-突變型分別和miR-150模擬體共轉(zhuǎn)染HEK293T，培養(yǎng)48 h后，按說明書使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)兩組HEK293T的熒光活性。

1.5 5組轉(zhuǎn)染細(xì)胞G0/G1、G2/M、S期細(xì)胞比例的檢測(cè) 采用碘化丙啶染色法的流式細(xì)胞術(shù)。用酶收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，先以1 000 r/min離心5 min，再將細(xì)胞用70%乙醇固定后4℃下過夜，之后添加50 μg/ml碘化丙啶在37℃避光保存15 min，按上述處理后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品。

1.6 5組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8法。用96孔板細(xì)胞接種，每孔104細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后,每孔添加10 μl CCK-8溶液，4 h后用微平板光掃描儀在450 nm波長處測(cè)定其吸光度（OD），OD值可反映細(xì)胞密度，根據(jù)OD值繪制細(xì)胞細(xì)胞生長曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SW480細(xì)胞組與 FHC組 miR-150、HMGA2和Cyclin A表達(dá)水平比較 SW480細(xì)胞組較FHC組miR-150表達(dá)水平下降，而HMGA2和Cyclin A表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 SW480細(xì)胞組與FHC組miR-150、HMGA2和Cyclin A表達(dá)水平比較

2.2 miR-150對(duì)照組和miR-150模擬體組HEK293T熒光活性的比較 與miR-150對(duì)照組比較，miR-150模擬體組pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型HEK293T熒光活性明顯為低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 5組轉(zhuǎn)染細(xì)胞G0/G1、G2/M、S期細(xì)胞比例的比較 與miR-150對(duì)照組比較，miR-150模擬體組、小干擾HMGA2組和miR-150模擬體聯(lián)合小干擾HMGA2組G0/G1期細(xì)胞比例均明顯為高，而G2/M、S期細(xì)胞比例均明顯為低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表2 miR-150對(duì)照組和miR-150模擬體組人胚腎細(xì)胞熒光活性的比較

表3 5組轉(zhuǎn)染細(xì)胞G0/G1、G2/M、S期細(xì)胞比例的比較

2.4 5組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活力比較 與miR-150對(duì)照組及小干擾對(duì)照組比較，miR-150模擬體組、小干擾HMGA2組、miR-150模擬體組聯(lián)合小干擾HMGA2組的OD值均減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 5組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活力比較

3 討論

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，年發(fā)病率高達(dá)28.2/10萬，病死率為13.61/10萬，每年新發(fā)38.8萬例，病死18.7萬例[12]。此外，結(jié)直腸癌預(yù)后較差，3年生存率約為60%，5年生存率低于40%，因此尋找結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中的分子靶點(diǎn)對(duì)早期診斷和預(yù)后具有重要意義。

HMGA2是一種無轉(zhuǎn)錄活性的非組蛋白染色體蛋白，它可以通過改變?nèi)旧w的空間結(jié)構(gòu)或與蛋白質(zhì)相互作用來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)DNA損傷[13]。Cyclin A是細(xì)胞周期的正向調(diào)控因子，能與細(xì)胞周期素依賴性激酶1、細(xì)胞周期素依賴性激酶2相互作用，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，加速G2/M相變，在細(xì)胞周期中起著至關(guān)重要的作用。Leung等[14]發(fā)現(xiàn)HMGA2的過度表達(dá)常在惡性腫瘤中出現(xiàn)，主要在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的胃腸道腫瘤中過表達(dá)。有研究表明，miR-150表達(dá)降低與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)，并可能影響結(jié)直腸癌進(jìn)展[11]。生物信息學(xué)分析顯示miR-150與HMGA2的3′-UTR具有互補(bǔ)的靶向關(guān)系。因此本研究旨在探討miR-150在調(diào)控HMGA2表達(dá)及對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。

本研究顯示，與FHC組相比，SW480細(xì)胞組HMGA2表達(dá)水平升高，而miR-150表達(dá)水平下降。有研究表明，HMGA2在結(jié)直腸癌組織中異常上調(diào)與腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)[15-16]，本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中HMGA2升高，與其結(jié)果一致。Gattolliat等[17]報(bào)道m(xù)iR-150在結(jié)腸腺瘤或結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常結(jié)腸黏膜，Ma等[18]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中miR-150表達(dá)水平較鄰近正常組織明顯降低，且miR-150表達(dá)水平較低的患者生存率更低，化療敏感性更差。本研究發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞組中miR-150表達(dá)水平下降，與上述結(jié)果一致。與FHC組比較，在SW480細(xì)胞組中miR-150表達(dá)水平明顯下降，而HMGA2和Cyclin A表達(dá)水平升高，這表明下調(diào)miR-150表達(dá)水平可能上調(diào)HMGA2和Cyclin A表達(dá)水平，并進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，加快細(xì)胞周期。本研究進(jìn)一步分析表明，miR-150模擬體和（或）小干擾HMGA2阻滯細(xì)胞周期G0/G1期，抑制SW480細(xì)胞增殖。Wu等[19]研究表明，HMGA2過表達(dá)明顯促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而HMGA2的表達(dá)下調(diào)則表現(xiàn)出相反的作用。本研究也表明HMGA2表達(dá)下調(diào)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性特征。

綜上所述，本研究顯示miR-150可通過抑制HMGA2及Cyclin A的表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。