劉文娟 毛洪京 余正和 劉義 楊莉莉 韋又丹 邵瓊琰

失眠與焦慮有顯著關(guān)聯(lián)[1-4]，失眠患者可表現(xiàn)為焦慮，而焦慮患者多有失眠，兩者具有雙向因果關(guān)系。這種關(guān)聯(lián)可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如血清5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素、神經(jīng)肽等有關(guān)[5]。但由于焦慮的復(fù)雜性和異質(zhì)性，使得睡眠剝奪所致的焦慮相關(guān)研究結(jié)果缺乏一致性[6]。本研究應(yīng)用多平臺(tái)水環(huán)境法建立快速眼動(dòng)期（repid eyes movement，REM）睡眠剝奪模型，擬通過量化的行為學(xué)方法觀察REM睡眠剝奪誘導(dǎo)大鼠焦慮相關(guān)自我修飾行為指標(biāo)以及與血清5-HT濃度的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康8周齡Sprague-Dawley雄性SPF級(jí)大鼠24只，均購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動(dòng)物合格編號(hào)：SCXK（浙）2014-0001，體重（210±20）g。將 24只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為睡眠剝奪組和對(duì)照組，每組12只，本研究經(jīng)本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 5-HT試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；視頻跟蹤系統(tǒng)Noldus Information Tech（系統(tǒng)版本Etho Vision XT 8.0）購(gòu)自荷蘭Wageningen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 兩組大鼠購(gòu)回后熟悉環(huán)境1周，飼養(yǎng)室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，晝夜 12 h循環(huán)，動(dòng)物隨意進(jìn)食、飲水，定期清洗消毒。開始造模前使用視頻跟蹤系統(tǒng)對(duì)兩組大鼠均進(jìn)行曠場(chǎng)（open field，OF）試驗(yàn)評(píng)定，每只動(dòng)物記錄1次，觀察兩組大鼠間是否存在組間差異。對(duì)照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不予干擾睡眠。建立一個(gè)改良的多平臺(tái)水環(huán)境，睡眠剝奪組采用72 h REM睡眠剝奪方法誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為[5]：1個(gè)水族箱里放6只同一籠子里的大鼠，水族箱包含10根柱子（平臺(tái)直徑為5 cm，高于水平面2 cm），每根柱子相距7 cm（邊緣到邊緣），在恒溫的室內(nèi)環(huán)境里通過REM睡眠剝奪誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為；食物和水隨意提供，通過覆蓋在水族箱上面的金屬網(wǎng)格獲得；一旦進(jìn)入REM睡眠，大鼠會(huì)因?yàn)槭埩β渌摺２捎脙蓚€(gè)水族箱對(duì)睡眠剝奪組大鼠同步進(jìn)行REM睡眠剝奪，與原飼養(yǎng)的籠子位于相同房間。72 h REM睡眠剝奪結(jié)束造模后取出大鼠，使用視頻跟蹤系統(tǒng)對(duì)兩組大鼠進(jìn)行OF試驗(yàn)、高架O迷宮（elevated zero maze，EOM）試驗(yàn)及自我修飾微觀結(jié)構(gòu)的分析。在行為記錄之前，用柔軟的毛巾輕柔地擦干其毛發(fā)，隨后將大鼠單獨(dú)置于285 mm×178 mm×150 mm的普通鼠籠里，成像裝置掛于鼠籠正上方，記錄大鼠的行為5 min，行為學(xué)評(píng)定在9:00到16:00進(jìn)行。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 OF試驗(yàn) 將直徑90 cm、高60 cm的圓桶，置于攝像頭正下方。圓桶內(nèi)壁為黑色，底部等分為面積相等的24格。每次將1只大鼠置于桶中心，紀(jì)錄水平和垂直得分（記錄時(shí)間5 min）。計(jì)分方式：大鼠3只爪子進(jìn)入1個(gè)格子計(jì)1分（水平得分），大鼠前爪離地或攀附桶壁1次計(jì)1分（垂直得分）；實(shí)驗(yàn)在16:00到19:00且安靜和黑暗的環(huán)境中進(jìn)行，在桶底部放置透明的一次性桌布，撒上木屑（試圖模仿大鼠熟悉的生活環(huán)境），每次試驗(yàn)后清理大鼠排泄物，并使用70%乙醇溶液消除可能留下的味道，每4只大鼠更換1次桌布。水平與垂直得分越高，動(dòng)物興奮性和敏感性越高，對(duì)周圍環(huán)境的不確定性和探究活動(dòng)增加，表明焦慮程度越高[7]。見圖1。

圖1 曠場(chǎng)（OF）試驗(yàn)分析示意圖

1.4.2 EOM試驗(yàn) EOM試驗(yàn)是一種廣泛使用的行為學(xué)測(cè)試，與高架十字迷宮原理相似[8]，具體方法（見圖2）：試驗(yàn)前大鼠先于空曠環(huán)境自由活動(dòng)5 min，試驗(yàn)開始時(shí)，大鼠頭朝開放臂方向放入開放臂與閉合臂的交界處，在5 min內(nèi)觀察行為指標(biāo)：（1）進(jìn)入開放臂次數(shù)（open area entry，OE）：在交界處進(jìn)入開放臂算1次，退出算1次探索結(jié)束；（2）進(jìn)入開放臂的時(shí)間（open area time，OT）：在開放臂內(nèi)停留時(shí)間；（3）進(jìn)入閉合臂次數(shù)（close area entry，CE）：大鼠交界處進(jìn)入閉合臂算一次，退出算一次探索結(jié)束；（4）進(jìn)入閉合臂的時(shí)間（close area time，CT）：閉合臂內(nèi)的停留時(shí)間。計(jì)算開放臂的進(jìn)入次數(shù)比OE%=OE/（OE+CE）×100%，開放臂停留時(shí)間比OT%=OT/（OT+CT）×100%。OE%和OT%與動(dòng)物的焦慮情緒呈負(fù)相關(guān)。每只大鼠在72 h REM睡眠剝奪后立即接受EOM試驗(yàn)。將大鼠放在EOM開臂與閉臂的交界處，單擊計(jì)算機(jī)上的“開始”按鈕，安裝在屋頂上的視頻跟蹤攝像機(jī)自動(dòng)監(jiān)測(cè)，每次每只大鼠所花費(fèi)的時(shí)間為5 min。在實(shí)驗(yàn)的各個(gè)階段，白噪音始終保持在70 dB。每次實(shí)驗(yàn)后用70%的乙醇溶液擦拭實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地[9]，以避免前次大鼠殘留氣味對(duì)當(dāng)前實(shí)驗(yàn)的影響。

圖2 高架O迷宮（EOM）試驗(yàn)示意圖

1.4.3 自我修飾微觀結(jié)構(gòu)分析 在每次行為實(shí)驗(yàn)前，用70%乙醇溶液擦拭實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地。修飾微觀結(jié)構(gòu)的分析參考Kalueff等[10-11]以及Pires等[12]的文獻(xiàn)。自我修飾行為按階段分類如下：0：沒有修飾；1：舔前爪；2：鼻子和臉部修飾（沿著鼻子撫摸）；3：清洗頭部（在頭頂部和耳后的半圓形運(yùn)動(dòng)）；4：身體修飾/抓撓（包括用后爪舔搓身體）；5：舔后腿；6：尾巴/生殖器修飾。觀察每只大鼠5 min的自我修飾行為（攝像錄下），記錄修飾發(fā)生的次數(shù)（the number of grooming bouts，NB）和中斷修飾的次數(shù)（the number of interruptions bouts，NIB）。評(píng)估中斷梳理次數(shù)的百分比IB%=NIB/NB×100%。一個(gè)完整的回合由以下模式序列組成：0-1-2-3-4-5-6-0，所有其他回合被認(rèn)為是不完全的（incomplete bout，ICB）。如果在修飾過程中至少有一個(gè)中斷記錄（中斷時(shí)間超過5 s），那么修飾回合被認(rèn)為是“中斷”的。對(duì)修飾模式之間的轉(zhuǎn)換（translate，T）進(jìn)行評(píng)估，分析階段之間的所有“正確”和“錯(cuò)誤”轉(zhuǎn)換，計(jì)算錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)換次數(shù)（IT）的百分比IT%=IT/T×100%。在修飾階段之間的正確轉(zhuǎn)換包括以下首尾順序：（0-1），（1-2），（2-3），（3-4），（4-5），（5-6），（6-0）；IT 包括：跳過（如 1-4，2-5），反向（如 3-2，4-1），中止（如 3-0，4-0）和不正確地啟動(dòng)（如 0-4，0-5）。

1.4.4 血清5-HT檢測(cè) 待上述實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，將大鼠麻醉，通過頸椎脫位處死大鼠，打開胸腔，用止血鉗固定胸骨，用兩根手指夾住心臟，將針插入心尖部位凹陷處，針尖微向下，抽取血液標(biāo)本。采用ELISA法檢測(cè)血清5-HT濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney test非參數(shù)檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠OF試驗(yàn)結(jié)果比較 造模前，睡眠剝奪組水平和垂直分?jǐn)?shù)與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；造模后睡眠剝奪組水平和垂直分?jǐn)?shù)均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表1。

表1 兩組大鼠曠場(chǎng)（OF）試驗(yàn)結(jié)果比較（分）

2.2 兩組大鼠EOM試驗(yàn)結(jié)果比較 兩組OE、OT、CT、OT%比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；睡眠剝奪組的CE多于對(duì)照組，OE%低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

2.3 兩組大鼠自我修飾分析結(jié)果比較 睡眠剝奪組IT、NIB、IT%和IB%均較對(duì)照組為高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表 3。

2.4 兩組大鼠血清5-HT濃度的比較 對(duì)照組血清5-HT濃度較睡眠剝奪組為高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表 4。

2.5 睡眠剝奪組大鼠IT%與5-HT濃度之間的相關(guān)性 睡眠剝奪組IT%與5-HT濃度之間存在負(fù)向相關(guān)性（P＜0.05），見圖 3。

3 討論

失眠是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，往往伴有焦慮、抑郁、疲勞、消極觀念等。焦慮和失眠具有相當(dāng)大的重疊和共現(xiàn)，并且存在高共病性，且兩者癥狀可能對(duì)同樣的治療有反應(yīng)，有共同神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)可能[12]。但目前對(duì)失眠引發(fā)的焦慮缺乏穩(wěn)定、統(tǒng)一的研究模型和評(píng)估手段，在研究結(jié)果一致性上也存在差異，故本研究通過建立REM睡眠剝奪模型來尋找有效穩(wěn)定的行為學(xué)評(píng)估手段，并觀察其神經(jīng)生物學(xué)的變化。

表2 兩組大鼠EOM試驗(yàn)結(jié)果比較

表3 兩組大鼠自我梳理分析參數(shù)的比較

表4 兩組大鼠血清5-羥色胺（5-HT）濃度的比較（μmol/L）

圖3 睡眠剝奪組大鼠錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)換次數(shù)（IT）%與5-羥色胺（5-HT）濃度之間的相關(guān)性（n=12）

睡眠剝奪是指機(jī)體因環(huán)境需要而部分或全部喪失正常睡眠量的狀態(tài)[13]，其中REM是睡眠的重要階段，既往有研究發(fā)現(xiàn)，REM睡眠剝奪后，機(jī)體不但學(xué)習(xí)能力、記憶力下降，一些焦慮、易激惹等負(fù)面情緒也容易增加[14]。REM睡眠剝奪可能通過改變機(jī)體腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的水平，進(jìn)而影響動(dòng)物的行為[15]。雖然過去已有很多研究顯示了睡眠不足對(duì)情緒的影響[16-17]，但對(duì)于REM睡眠剝奪是否誘導(dǎo)焦慮行為的研究尚少。要獨(dú)立地驗(yàn)證睡眠剝奪對(duì)焦慮樣行為的影響，關(guān)鍵是采用一種嚙齒動(dòng)物內(nèi)在和先天的自我修飾行為進(jìn)行評(píng)估，且該行為與嚙齒類動(dòng)物的壓力表現(xiàn)高度相關(guān)。修飾是嚙齒動(dòng)物對(duì)高和低壓力的第一行為反應(yīng)[10-11]，5-HT參與焦慮和自我修飾、OF、EOM行為的調(diào)節(jié)[18-19]。本研究通過改良多平臺(tái)水環(huán)境72 h REM睡眠剝奪方法誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為，并使用梳理的微觀結(jié)構(gòu)、EOM和OF行為參數(shù)作為焦慮標(biāo)志物。結(jié)果表明，OF試驗(yàn)中，造模后睡眠剝奪組水平和垂直分?jǐn)?shù)均明顯低于對(duì)照組；EOM試驗(yàn)中，睡眠剝奪組的CE多于對(duì)照組，OE%低于對(duì)照組；自我梳理分析中，IT、NIB、IT%和IB%均較對(duì)照組為高，表示睡眠剝奪組存在焦慮樣的行為?？梢哉f自我梳理分析的算法中，IT、NIB、IT%、IB%是作為研究抗焦慮藥物改善焦慮樣行為可靠的標(biāo)記，這同Kalueff等[20]的研究一致，表明修飾微結(jié)構(gòu)的詳細(xì)行為學(xué)分析可以作為焦慮行為藥理學(xué)的有用工具。

此外，本研究在REM睡眠剝奪誘導(dǎo)的焦慮樣行為大鼠神經(jīng)生化指標(biāo)相關(guān)性方面作了進(jìn)一步探索。眾所周知，5-HT主要分布于胃腸、脾、血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可影響機(jī)體多種生物學(xué)及行為學(xué)功能（包括記憶、食欲、情感、情緒調(diào)控、性欲、睡眠及壓力反應(yīng)等），在大腦區(qū)域中的5-HT神經(jīng)遞質(zhì)被認(rèn)為是誘發(fā)抑郁焦慮的重要物質(zhì)，而作為上行激活系統(tǒng)的重要組成部分其在維持覺醒和警覺狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，其與睡眠-覺醒的關(guān)系仍在不斷探索之中。Ding等[21]認(rèn)為5-HT可影響下丘腦-垂體-腎上腺軸功能介導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌，從而誘發(fā)抑郁的發(fā)生，Wang等[22]研究也發(fā)現(xiàn)5-HT缺乏可能與長(zhǎng)期抑郁及焦慮樣行為相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪組IT%與5-HT濃度之間存在負(fù)向相關(guān)性（P＜0.05），血清5-HT濃度越低，IT可能越多，焦慮樣的行為也可能越多，這與目前的相關(guān)研究結(jié)果是一致的[18-19]。

綜上所述，本研究通過OF、EOM試驗(yàn)以及自我修飾行為分析對(duì)REM睡眠剝奪誘導(dǎo)的焦慮樣行為進(jìn)行了行為學(xué)的量化評(píng)定，同時(shí)通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清5-HT濃度與自我修飾行為之間存在相關(guān)性，為今后臨床應(yīng)用抗焦慮藥物治療失眠提供切實(shí)可行的量化的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限，后續(xù)仍需增大樣本量，同時(shí)針對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的研究已涉及到5-HT亞型、5-HT受體以及基因多態(tài)性，后續(xù)在該模型基礎(chǔ)上仍需就最新進(jìn)展及相關(guān)治療作進(jìn)一步展開研究。