婁玲，陳長寶，張?jiān)?，萬茜淋，王歡，王淑敏

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117）

麥角甾醇和麥角甾酮是藥用真菌中兩大活性次生代謝產(chǎn)物之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物活性。麥角甾醇廣泛存在于藥用真菌子實(shí)體和發(fā)酵菌絲中，是真菌細(xì)胞膜的重要組分，也是真菌類的特征化合物[1]，以麥角甾醇為代表的甾醇類成分具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和降低膽固醇等多種藥理作用[2-7]。研究已證實(shí)麥角甾酮具有利尿、治療慢性腎臟病、抗癌、抗腫瘤和免疫抑制等多種生物活性[8-9]。

目前，國內(nèi)對葉生小皮傘〔Marasmius epiphyllus（Pers.）Fr.〕的研究較少，主要集中在分類學(xué)[10]與不同發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量測定方面[11]，國外關(guān)于葉生小皮傘的發(fā)酵條件及發(fā)酵產(chǎn)物等相關(guān)研究鮮見報(bào)道。目前對其同屬的藥用真菌安絡(luò)小皮傘的研究較多[12-13]，安絡(luò)小皮傘相關(guān)藥物制劑已上市多年，對于神經(jīng)痛、偏頭痛和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等具有良好的效果[14]，因此葉生小皮傘具有一定的研究價(jià)值。借助婁玲等[15]對葉生小皮傘菌株ME-1的生物學(xué)特性以及液體發(fā)酵工藝的研究，本研究主要探究葉生小皮傘菌株ME-1的活性物質(zhì)含量，豐富了葉生小皮傘的藥用資源，對葉生小皮傘發(fā)酵產(chǎn)物中麥角甾醇和麥角甾酮含量進(jìn)行測定，不僅可為葉生小皮傘質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，也可為其藥用價(jià)值的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；I nertsil ODS-SP島津C18色譜柱（4.6 250 mm，5m）（日本島津公司）；HH6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠）；AUY220萬分之一分析天平（島津國際貿(mào)易上海有限公司）；AU2450紫外分光光度計(jì)（島津國際貿(mào)易上海有限公司）。

1.1.2 試劑甲醇（色譜級(jí)）（美國Fisher公司）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；麥角甾醇（批號(hào)：J26M6K1，純度≥98%）、麥角甾酮（批號(hào)：X22M8L32255，純度≥96%）（上海源葉生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純（北京化工廠）。

1.1.3 試材葉生小皮傘采于吉林省長春市凈月潭國家森林公園，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為葉生小皮傘（Marasmius epiphyllus），并從中分離菌種ME-1，葉生小皮傘菌絲、發(fā)酵液是采用深層液體培養(yǎng)發(fā)酵得到；葉生小皮傘固體發(fā)酵產(chǎn)物為薏米麥麩固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到，于60℃烘干備用。

1.2 樣品的制備

1.2.1 麥角甾醇對照品溶液的制備精密稱取麥角甾醇對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得濃度為0.100 mg/mL的麥角甾醇對照品溶液。

1.2.2 麥角甾酮對照品溶液的制備精密稱取麥角甾酮對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得濃度為0.123 mg/mL的對照品溶液，從中精密吸取1 mL對照品溶液加于另外10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，最終制得濃度為0.0123mg/mL的麥角甾酮對照品溶液。

1.2.3 供試樣品溶液的制備稱取干燥ME-1菌絲體3 g，干燥的固體發(fā)酵產(chǎn)物15 g，分別置于具塞的錐形瓶中，各加三氯甲烷50 mL，稱重，超聲30 min后，冷卻，用甲醇補(bǔ)足失重，濾過，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL容量瓶中，搖勻，即得葉生小皮傘菌絲、固體發(fā)酵產(chǎn)物供試品溶液，用于麥角甾醇含量測定。稱取ME-1菌絲體、固體發(fā)酵產(chǎn)物各10 g，分別置于具塞的錐形瓶中，加三氯甲烷50 mL，蓋上塞子，稱重，超聲30 min，加甲醇補(bǔ)足失重，濾過，蒸干，將殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ?，菌絲定容至5 mL容量瓶中，固體發(fā)酵產(chǎn)物定容至10 mL容量瓶中，用于麥角甾酮含量測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm 250 mm，5m）；流動(dòng)相為甲醇，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10L，檢測波長282 nm，柱溫30℃（此條件下檢測麥角甾醇含量）；流動(dòng)相為甲醇∶水=92∶8，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10L，檢測波長349 nm，柱溫30℃（此條件下檢測麥角甾酮含量）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品和供試品分析

將麥角甾醇對照品溶液、麥角甾酮對照品溶液和供試樣品溶液，分別按照“1.3”項(xiàng)下的色譜條件，利用高效液相色譜儀進(jìn)行分析檢測。結(jié)果顯示，葉生小皮傘液體發(fā)酵菌絲體和固體發(fā)酵產(chǎn)物中均含有麥角甾醇和麥角甾酮。麥角甾醇對照品和麥角甾酮對照品色譜圖如圖1所示；供試樣品色譜圖如圖2和圖3所示。

圖1麥角甾醇對照品（a）和麥角甾酮對照品（b）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of ergosterol reference substance（a）and ergosterone reference substance（b）

圖2菌絲體（a）和固體發(fā)酵產(chǎn)物（b）中麥角甾醇的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of ergosterol in mycelium（a）and solid fermentation product（b）

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 分別取麥角甾醇、麥角甾酮對照品溶液，依次進(jìn)樣1、2、4、8、10L，測定吸收峰面積，以麥角甾醇、麥角甾酮的進(jìn)樣質(zhì)量和色譜峰面積分別作為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得麥角甾醇和麥角甾酮的線性回歸方程分別為Y=215 942 X 51 911（R2=0.999 8）和Y=28 058 X+2 779.8（R2=0.999 6），表明麥角甾醇和麥角甾酮分別在0.1~10.0和0.012 3~0.123 0g線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn)取麥角甾醇、麥角甾酮對照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下的方法測定，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，每次進(jìn)樣10L，分別得到麥角甾醇和麥角甾酮的RSD分別為0.83%和0.55%，RSD均小于2.0%，表明該測量方法精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取ME-1菌絲體和固體發(fā)酵產(chǎn)物供試品溶液，分別在配制后0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算出供試峰面積的RSD，菌絲體和固體發(fā)酵物中的麥角甾醇峰面積RSD分別為1.39%和0.38%；麥角甾酮峰面積RSD分別為1.18%和1.76%，說明葉生小皮傘菌的菌絲體和固體發(fā)酵產(chǎn)物供試溶液中的麥角甾醇、麥角甾酮在24 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)將同一批ME-1液體發(fā)酵菌絲體和固體發(fā)酵產(chǎn)物分別進(jìn)行精密稱取6份，參照“1.2.3”方法進(jìn)行制備，按照“1.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10L，計(jì)算得出發(fā)酵菌絲體和固體發(fā)酵物中麥角甾醇RSD分別為1.03%和1.77%，麥角甾酮RSD分別為1.39%和1.26%，表明該測量方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知麥角甾醇含量的菌絲體樣品3 g、固體發(fā)酵產(chǎn)物的粉末15 g，各6份，分別加入定量的麥角甾醇對照品精準(zhǔn)，由表1~2可知，菌絲體的加樣平均回收率為103.92%，RSD為1.80%；固體發(fā)酵產(chǎn)物的加樣平均回收率為103.93%，RSD為1.22%，表明該測量方法回收率良好。

精密稱取已知麥角甾酮含量的菌絲體、固體發(fā)酵產(chǎn)物粉末各10 g，每樣6份，分別加入定量的麥角甾酮標(biāo)準(zhǔn)品。由表3~4可知，葉生小皮傘菌絲體的加樣平均回收率為100.16%，RSD為1.45%；固體發(fā)酵產(chǎn)物的加樣平均回收率為99.30%，RSD為1.82%，表明該測量方法回收率良好。

2.3 供試樣品麥角甾醇和麥角甾酮含量測定

采用高效液相色譜法對葉生小皮傘菌菌絲體和固體發(fā)酵產(chǎn)物中的麥角甾醇和麥角甾酮進(jìn)行含量測定，得出葉生小皮傘菌絲體中麥角甾醇的平均含量為125.0g/g，固體發(fā)酵物中麥角甾醇的平均含量為37.7g/g；菌絲體中麥角甾酮的平均含量為1.2g/g，固體發(fā)酵物中麥角甾酮的平均含量為4.8g/g。

表1菌絲體中麥角甾醇加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery tests of ergosterol in mycelium

表2固體發(fā)酵物中麥角甾醇加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery tests of ergosterol in solid fermentation products

表3菌絲體中麥角甾酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery tests of ergotsterone in mycelium

表4固體發(fā)酵物中麥角甾醇加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery tests of ergotsterone in solid fermentation products

3 討論與結(jié)論

麥角甾醇為真菌類的特征甾醇，是脂溶性維生素D2的前體，具有多種生物學(xué)活性[9,16]。而轉(zhuǎn)化物維生素D2可以作為飼料添加劑，能增加禽的產(chǎn)蛋率和孵化率。麥角甾醇也可以作為重要的醫(yī)藥化工原科，用于生產(chǎn)“可的松”和“激素黃體酮”等甾醇類藥物[2]。研究表明，麥角甾酮有利尿、抗腫瘤和免疫抑制等多種生物活性。麥角甾醇和麥角甾酮是葉生小皮傘中2種主要的活性成分，存在于菌絲體與固體發(fā)酵物中。本研究利用發(fā)酵技術(shù)獲得其菌絲體和固體發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇在菌絲體中的含量遠(yuǎn)高于固體發(fā)酵物中的含量，而麥角甾酮卻在固體發(fā)酵物中的含量較高。這也說明同一菌株不同的發(fā)酵方式其次生代謝產(chǎn)物的含量也有明顯不同。

本研究首次利用HPLC法測定并比較了葉生小皮傘發(fā)酵產(chǎn)物中麥角甾醇和麥角甾酮的含量，該方法較為穩(wěn)定，準(zhǔn)確性也較高。研究結(jié)果表明，葉生小皮傘ME-1菌絲體中麥角甾醇含量高于固體發(fā)酵產(chǎn)物，而固體發(fā)酵產(chǎn)物中麥角甾酮含量高于其菌絲體，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步對葉生小皮傘進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。