舒楠，石廣麗，張慶田，劉濤，路文鵬※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春130112；2.山東省果樹(shù)研究所，山東 泰安271000；3.集安市人參特產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，吉林 集安134200）

桃（Prunus persica L）屬于薔薇科桃屬，起源于中國(guó)西部，主要分布于歐洲、亞洲、美洲、非洲以及澳洲。桃種質(zhì)資源豐富，種植范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)[1]。目前，桃作為世界上栽培范圍最廣的多年生落葉果樹(shù)之一，已遍布世界各地，位居核果類(lèi)果樹(shù)之首[2]。研究表明，目前我國(guó)搜集保存的桃種質(zhì)資源達(dá)2 000多份[3]，了解不同資源的遺傳背景是對(duì)其利用的前提及基礎(chǔ)[4]。集安市白桃生長(zhǎng)于中朝邊境、鴨綠江畔，該地區(qū)具有獨(dú)特的氣候條件，使得白桃成為當(dāng)?shù)仫L(fēng)味濃郁的特色水果。集安白桃果皮薄且易剝離，果皮具絨毛，果肉呈乳黃色，果核為紫紅色，肉質(zhì)軟嫩多汁，酸甜適口，風(fēng)味獨(dú)特。其果實(shí)含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，其鐵的含量相當(dāng)于蘋(píng)果和梨的4~6倍。集安地區(qū)白桃資源豐富，不同資源間果實(shí)質(zhì)量差異較大，最大的達(dá)229.5 g，而最小的只有58.1 g。目前已篩選出優(yōu)異的白桃品種‘集?！?，但其遺傳背景尚不清楚。桃不同資源可按照品種類(lèi)群、生態(tài)群及形態(tài)學(xué)等進(jìn)行分類(lèi)，但部分品種（系）很難根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分，而形態(tài)學(xué)的標(biāo)記位點(diǎn)少且受環(huán)境因素影響大[5]，所以，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)桃進(jìn)行遺傳分析具有重要意義。

SSR（simple sequence repeat，SSR）又稱(chēng)微衛(wèi)星標(biāo)記，因其重復(fù)性好，多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性高，檢測(cè)方便及具有共顯性等特點(diǎn)，目前已成為育種工作中重要的遺傳標(biāo)記方法之一[6]，且已在蘋(píng)果[7]、葡萄[8]、桃[9]和李[10]等多種果樹(shù)中得到應(yīng)用。Verde等[11]于2013年對(duì)桃不同器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并在NCBI上傳80 797條表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）序列，這為搜索桃SSR分子標(biāo)記提供了大量的數(shù)據(jù)資源。Bouhadida等[12]利用15對(duì)SSR分子標(biāo)記成功鑒別了94份桃資源。張佳俊等[13]選取18對(duì)SSR引物對(duì)‘保佳紅’的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明，‘保佳紅’與‘大久?！挠H緣關(guān)系最近。廖安紅等[14]采用12條ISSR引物對(duì)71份資源進(jìn)行了聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，貴州桃具有豐富的遺傳多樣性。本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)吉林省集安市的白桃桃資源及山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的桃資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為后續(xù)抗寒桃資源的選育及綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取15份桃資源，其中包括吉林省集安市的6份白桃資源及山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的9份桃資源，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 15份桃種質(zhì)資源信息Table 1 Information of 15 accessions of peach

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè)2018年11月采集枝條，并于實(shí)驗(yàn)室水插發(fā)芽，用液氮將幼嫩葉片速凍，于﹣80℃冰箱保存。試驗(yàn)中所有桃資源的基因組DNA均采用改良的CTAB法提取[15]，DNA質(zhì)量及濃度的檢測(cè)利用1%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果不合格的樣品需重新提取至符合試驗(yàn)需求為止。

1.2.2 SSR擴(kuò)增選取參考文獻(xiàn)[1,4,16]中引物共48對(duì)作為試驗(yàn)所用SSR引物，從中篩選多態(tài)性引物24對(duì)用于樣品的遺傳多樣性分析。PRC擴(kuò)增體系為20.0L，其中，包括DNA模板（20~30 ng/L）1.0L，Taq DNA聚合酶0.8L（2.5 U/L），10 buffer 2.0L，正、反向引物各0.8L，dNTP（0.25 mol/L）0.5L，14.1L無(wú)菌去離子水。反應(yīng)程序參考凌士鵬等[1]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物利用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，最后利用銀染染色。試驗(yàn)所用所有試劑均購(gòu)于長(zhǎng)春晶美有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法

電泳檢測(cè)結(jié)果中，每條帶均代表1個(gè)分子標(biāo)記，即1個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)則按照條帶的有無(wú)來(lái)統(tǒng)計(jì)，有條帶的位置計(jì)作1，無(wú)帶計(jì)作0，以此類(lèi)推。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用二元數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)的計(jì)算，利用NTSYS軟件分析數(shù)據(jù)，按照J(rèn)accard公式計(jì)算不同種質(zhì)資源間的相似系數(shù)（genetic similarity，GS），并利用軟件的UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建聚類(lèi)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的多態(tài)性分析

試驗(yàn)共選取48對(duì)引物，從中篩選條帶清晰及多態(tài)性豐富的引物24對(duì)用于遺傳多樣性分析。擴(kuò)增結(jié)果表明，單對(duì)引物能夠擴(kuò)增出5~30條帶，平均每對(duì)引物19.6條。電泳結(jié)果（圖1）顯示，24對(duì)引物共擴(kuò)增出471條帶，所有片段大小均在50~300 bp，多態(tài)性條帶為100%。因此，SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)桃不同資源的遺傳多樣性效率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，同時(shí)也說(shuō)明桃不同資源間具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 15份不同桃資源的遺傳相似系數(shù)及聚類(lèi)分析

基于SSR分析的15份桃資源的遺傳相似系數(shù)見(jiàn)表2。由表2可知，15份桃資源的遺傳相似系數(shù)在0.400~0.889，平均遺傳相似系數(shù)為0.645。試驗(yàn)中所用的6份集安白桃的遺傳相似系數(shù)在0.633~0.889，與山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的9份桃資源的遺傳相似系數(shù)在0.414~0.721，其中，LLT與ZST02的遺相似系數(shù)最大，為0.889，表明二者遺傳組成最為接近。

圖1 AJ826975引物對(duì)15份桃資源擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.1 Primer AJ826975 amplification results of 15 Prunus accessions

15份不同桃資源的聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖2，可以分為三大類(lèi)。第1類(lèi)共包括‘川中島’‘福島桃王’‘蒼方早生’‘超紅’‘中農(nóng)金華’‘瑞光33’和‘萊山蜜’共7份資源，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.787時(shí)，‘超紅’和‘中農(nóng)金華’聚為一類(lèi)，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.688時(shí)，‘川中島’與‘福島桃王’‘蒼方早生’‘超紅’‘中農(nóng)金華’‘瑞光33’和‘萊山蜜’聚為一類(lèi)；第2類(lèi)共包括‘蜜冬雪’‘LLT’‘ZST01’‘MT’‘ZST02’‘LNT’和‘集福’共7份資源，其中‘LLT’和‘ZST02’均為采自吉林省集安的2個(gè)白桃株系，這2份資源的親緣關(guān)系也最近，猜測(cè)2份資源可能存在親本與子代的關(guān)系；第3類(lèi)為‘琿春桃’，‘琿春桃’為白桃的一個(gè)品系，原產(chǎn)地位于吉林省琿春市。從聚類(lèi)分析結(jié)果可以看出，來(lái)自不同地區(qū)的資源大部分聚為一類(lèi)，說(shuō)明其親緣關(guān)系相對(duì)較近，同時(shí)也說(shuō)明SSR標(biāo)記在桃遺傳分析上的可靠性及穩(wěn)定性。

表2基于SSR分析的15份桃資源遺傳相似系數(shù)HunchuntaoTable 2 Genetic similarity coefficient of 15 accessions of by SSR

表2基于SSR分析的15份桃資源遺傳相似系數(shù)HunchuntaoTable 2 Genetic similarity coefficient of 15 accessions of by SSR

桃資源Peach resources集福Jifu LNT ZST02 MT ZST01 LLT琿春桃Hun chun tao萊山蜜Lai shan mi蜜冬雪Mi dong xue瑞光33 Rui guang 33中農(nóng)金華Zhong nong jin hua川中島Chuan zhong dao集福Jifu 1.000 LNT 0.746 1.000 ZST02 0.714 0.772 1.000 MT 0.690 0.678 0.679 1.000 ZST01 0.700 0.787 0.793 0.633 1.000 LLT 0.786 0.772 0.889 0.679 0.793 1.000琿春桃Hunchuntao 0.630 0.655 0.577 0.556 0.643 0.615 1.000萊山蜜Laishanmi 0.525 0.645 0.610 0.590 0.603 0.542 0.561 1.000蜜冬雪Midongxue 0.642 0.667 0.627 0.604 0.582 0.667 0.531 0.536 1.000瑞光33Ruiguang 33 0.533 0.525 0.448 0.567 0.581 0.414 0.643 0.762 0.400 1.000中農(nóng)金華Zhongnongjinhua 0.610 0.633 0.526 0.576 0.656 0.526 0.582 0.645 0.519 0.754 1.000超紅Chaohong 0.633 0.721 0.655 0.567 0.710 0.621 0.571 0.635 0.655 0.548 0.787 1.000倉(cāng)方早生Cangfangzaosheng 0.508 0.600 0.491 0.576 0.623 0.491 0.545 0.742 0.444 0.754 0.667 0.689 1.000福島桃王Fudaotaowang 0.590 0.677 0.576 0.656 0.762 0.576 0.596 0.750 0.500 0.762 0.677 0.698 0.774 1.000川中島Chuanzhongdao 0.645 0.667 0.567 0.581 0.688 0.600 0.621 0.738 0.526 0.719 0.730 0.688 0.762 0.738 1.000超紅Chao hong倉(cāng)方早生Cang fang zao sheng福島桃王Fu dao tao wang

圖2基于SSR結(jié)果的15份桃資源聚類(lèi)分析Fig.2 Clustering analysis of 15 varieties based on SSR results

3 討論

SSR分子標(biāo)記技術(shù)是繼RAPD后基于PCR反應(yīng)的標(biāo)記技術(shù)之一，且重復(fù)性?xún)?yōu)于RAPD[17]。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已成功用于桃的遺傳分析及品種的鑒定[9,16,18-20]。Aranzana等[20]利用16對(duì)SSR引物成功將212個(gè)桃品種的87%區(qū)分開(kāi)，其余的具有相同指紋圖譜的品種包括桃的突變體及來(lái)自于同一個(gè)親本的不同自帶個(gè)體。Badenes等[21]對(duì)西班牙不同類(lèi)型的桃品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，僅利用10對(duì)SSR引物即可將幾乎所有的品種區(qū)分開(kāi)。本研究所選用的24對(duì)SSR引物能夠?qū)?5份資源全部區(qū)分開(kāi)，且所有引物擴(kuò)增出的條帶均為多態(tài)性條帶，表明SSR標(biāo)記的高效性。對(duì)不同白桃資源進(jìn)行遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)0.595處，所有采自于集安的白桃聚在一類(lèi)，表明這些資源的親緣關(guān)系相對(duì)較近，桃種群的形成與其發(fā)源地的氣候條件密切相關(guān)，生態(tài)條件及地理因素是影響物種分化的最直接因素。15份桃資源遺傳多樣性鑒定結(jié)果與各資源的地理起源和系譜相一致，同時(shí)也說(shuō)明了SSR標(biāo)記是進(jìn)行桃遺傳多樣性分析的一種效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的技術(shù)手段。