褚秀玲

（山東省泰安生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東 泰安 271000）

人類(lèi)細(xì)胞中含有超過(guò)1000種轉(zhuǎn)錄因子。它們濃度異常變化與許多疾病緊密相連［1］。例如，NF-κB（存在于人體各種細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子）的異常表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致癌癥、炎癥等嚴(yán)重疾病［2，3］，已經(jīng)用于臨床診斷和開(kāi)發(fā)相關(guān)治療藥物。所以，靈敏、快速檢測(cè)NF-κB的活性具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)，熒光檢測(cè)技術(shù)已被用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子。最常用的是基于構(gòu)象轉(zhuǎn)變的熒光檢測(cè)分析方法。該方法過(guò)程簡(jiǎn)便，但是必須構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜的探針，大大限制了該方法的應(yīng)用范圍。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是一種特殊的二維碳納米材料，具有良好的水溶性、優(yōu)異的機(jī)械及熱性能［4］。GO能夠吸附單鏈DNA，并可以淬滅DNA單鏈上標(biāo)記的熒光，已被用于開(kāi)發(fā)多種生物傳感器［5-8］。本文設(shè)計(jì)一種具有三重功能的G-四鏈體發(fā)夾探針，借助GO對(duì)DNA單鏈的高效率吸附和淬滅熒光性能，建立了一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏的熒光檢測(cè)NF-κB p50方法，獲得了滿意結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

本文用到的探針（DNA）均由上海生工提供，如表1所示。重組 NF-κB p50購(gòu)于美國(guó) Cayman Chemical公司，氧化石墨烯水溶液購(gòu)于南京先豐納米材料科技有限公司，NMM購(gòu)自Frontiersci。其它試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

DNA儲(chǔ)存液（TE）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0。

所用溶液均采用高純水（＞18.25 MΩ）配制。

表1 探針序列Table 1 Details of the DNA sequences of PROBE

表1中粗體為發(fā)夾的莖部（即為目標(biāo)物的識(shí)別序列），下劃線區(qū)域?yàn)榘l(fā)夾的環(huán)部，斜粗體部分為探針末端G-四鏈體。

1.2 DNA的分裝、儲(chǔ)存及工作溶液的配制

將新購(gòu)買(mǎi)的 DNA離心（10000v／min，1min），用TE緩沖液配制成50μmol／L的儲(chǔ)備液，振蕩使其充分溶解后分裝，儲(chǔ)存于-20°C備用。2.5μ mol／L的工作溶液由 10 m mol／L HEPES（50 m mol／L氯化鉀，0.1 m mol／L EDTA，2.5 m mol／L二硫蘇糖醇，10%甘油，pH＝7.4）緩沖溶液稀釋儲(chǔ)備液而成，置于-4°C。

1.3 氧化石墨烯吸附G-四鏈體探針、靶標(biāo)結(jié)合探針、復(fù)合物的解離、插入染料及測(cè)定熒光

氧化石墨烯和G-四鏈體探針依次加入到20 mM HEPES的緩沖體系中，室溫下吸附反應(yīng)進(jìn)行5 min，然后加入靶標(biāo)NF-κB p50，室溫下與識(shí)別探針結(jié)合后形成復(fù)合物，脫離氧化石墨烯，進(jìn)行20 min。最后，加入染料NMM到反應(yīng)體系中，5 min。體系的終體積為50μL，氧化石墨烯、探針和NMM的最終濃度分別為 0.1 mg／mL、50 nmol／L、2.0 μmol／L。測(cè)定熒光參數(shù)：激發(fā)電壓為500 V，激發(fā)波長(zhǎng)：399 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：620 nm，狹縫：5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

檢測(cè)原理如圖1所示。G-四鏈體發(fā)夾探針具有三重功能，環(huán)部用于吸附于氧化石墨烯，莖部用于結(jié)合靶標(biāo)，末端G-四鏈體用作輸出信號(hào)載體。首先，探針通過(guò)π-π堆積作用被快速吸附到氧化石墨烯表面；然后，靶標(biāo)NF-κB p50特異性結(jié)合探針莖部后形成復(fù)合物，復(fù)合物體積較大，與氧化石墨烯表面的相互作用力減弱，導(dǎo)致脫離其表面；最后，插入內(nèi)插染料NMM（插入G-四鏈體后熒光信號(hào)增強(qiáng)）。靶標(biāo)不存在時(shí)，吸附在氧化石墨烯表面的探針無(wú)法自行解離，插入NMM后仍會(huì)被氧化石墨烯淬滅，利用熒光變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的快速、靈敏檢測(cè)。

圖1 氧化石墨烯介導(dǎo)多功能G-四鏈體發(fā)夾探針高靈敏檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子示意圖Fig.1 Scheme of graphene oxide-mediated multifunctional G-quadruplex hairpin probe for rapid and sensitive detection of NF-κB p50

2.2 NF-κB p50分析的熒光光譜表征

檢測(cè)過(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化如圖2所示。染料自身呈現(xiàn)熒光很微弱（a），當(dāng)探針加入到含有染料NMM的體系時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增大（d）。當(dāng)氧化石墨烯加入體系后，熒光強(qiáng)度明顯下降（b），這說(shuō)明插入到探針中的NMM的增強(qiáng)熒光已被氧化石墨烯高效淬滅。當(dāng)體系中加入靶標(biāo)NF-κB p50后，熒光強(qiáng)度又顯著增強(qiáng)（c），這說(shuō)明探針與靶標(biāo)特異結(jié)合成為復(fù)合物，體積變大產(chǎn)生位阻效應(yīng)，與氧化石墨烯親和力變?nèi)?，進(jìn)而脫離從其表面解離，染料NMM的熒光恢復(fù)。

圖2 檢測(cè)過(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化Fig.2 The change of fluorescence intensity

2.3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件

為了獲得最佳檢測(cè)數(shù)據(jù)，需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，包括探針末端G-四鏈體長(zhǎng)度、氧化石墨烯濃度、內(nèi)插染料濃度。

2.3.1 G-四鏈體長(zhǎng)度的優(yōu)化

ΔF（陽(yáng)性熒光強(qiáng)度與陰性熒光強(qiáng)度之差）隨著G-四鏈體序列長(zhǎng)度的增加而增大，當(dāng)序列堿基數(shù)為17時(shí)，ΔF最大，因此，選擇堿基數(shù)為17的G-四鏈體，對(duì)應(yīng)探針4。

2.3.2 氧化石墨烯的濃度優(yōu)化

氧化石墨烯的濃度對(duì)淬滅效率影響重大，氧化石墨烯濃度增大，熒光強(qiáng)度ΔF先增大后又逐漸降低，當(dāng)濃度為0.1 mg／mL時(shí)ΔF最大。

2.3.3 內(nèi)插染料濃度的優(yōu)化

熒光強(qiáng)度隨著NMM濃度的增大而增大，然后又逐漸變小，當(dāng)染料濃度為2.0μmol／L時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。

2.4 檢測(cè)方法性能

通過(guò)測(cè)定不同靶標(biāo)濃度在最佳條件下對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，可以獲得本檢測(cè)方法的線性范圍和靈敏度。熒光強(qiáng)度與目標(biāo)物濃度在0.5～50 nmol／L范圍內(nèi)時(shí)具有線性關(guān)系（R2＝0.993），經(jīng)估算檢測(cè)限為0.25 nmol／L，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的其他方法。

3 結(jié)論

本文通過(guò)設(shè)計(jì)基于氧化石墨烯高效淬滅性能的多功能G-四鏈體識(shí)別探針，成功構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、靈敏、快速的熒光檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p50的靈敏檢測(cè)，LOD分別為0.25 nmol／L。與文獻(xiàn)報(bào)道的其他熒光方法相比較，該檢測(cè)方法具有如下特點(diǎn)：1）首次設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)的三功能識(shí)別探針，并且該設(shè)計(jì)具有通用性，只需要調(diào)整對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列即可實(shí)現(xiàn)其它靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子的高效檢測(cè)。2）該方法不需要昂貴的切割酶，極大地降低了假陽(yáng)性信號(hào)和檢測(cè)成本。