胡 丹 劉元月 盛 蕾

（1.江蘇省第二中醫(yī)院，江蘇南京210017；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023）

卒中后抑郁（PSD）是最常見(jiàn)的卒中后神經(jīng)精神并發(fā)癥，可嚴(yán)重影響功能恢復(fù)并增加死亡風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)外研究顯示，PSD發(fā)病率大約在30%～40%之間[1]，而在新發(fā)急性卒中后第一個(gè)月時(shí)發(fā)病達(dá)到高峰。如何安全高效地治療PSD越來(lái)越引起人們的關(guān)注。中藥在PSD治療領(lǐng)域顯示出優(yōu)勢(shì)，其中柴胡疏肝散具有疏肝活血、健脾理氣之效，臨床研究顯示其具有良好的改善PSD抑郁程度的作用[2-3]。本研究我們采用大腦中動(dòng)脈線栓阻塞法（MCAO）聯(lián)合慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激法（CUMS）建立大鼠PSD模型，進(jìn)一步觀察柴胡疏肝散的干預(yù)作用，并探討可能的機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～210 g，SPF級(jí)，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，批號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010。標(biāo)準(zhǔn)混合飼料飼養(yǎng)，保持室溫25 ℃，相對(duì)濕度45%，晝夜明暗12 h交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 柴胡疏肝散藥物組成為柴胡、白芍、川芎、枳殼、陳皮、甘草、香附，由南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院草藥房提供，各味藥物按6∶4.5∶6∶6∶6∶1.5∶4.5的比例取藥，以8倍量水浸泡1 h，加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并2次藥液，經(jīng)3層紗布過(guò)濾，在60 ℃下減壓濃縮，得到柴胡疏肝散濃縮液。將濃縮液置于冷凍干燥機(jī)中干燥至粉末，保存于-20 ℃冰箱，用時(shí)以生理鹽水稀釋。

1.3 儀器與試劑 主要儀器：蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad）；凝膠成像及分析系統(tǒng)（Tannon）。主要試劑：RIPA裂解液（Beyotime，P0013C）；蛋白酶抑制 劑Cocktail（Cell Signaling，5872S）；蛋 白Marker（Thermo，26625）；一抗，均為兔抗大鼠，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF，SantaCruz，sc-20981），酪氨酸激酶受體B（TrkB，SantaCruz，sc-12）；核因子κB（NF-κB，SantaCruz，sc-1190）；β-tubulin（Epitomics，1799-1）；二抗，羊抗兔（Thermo，A32732）；ECL顯色液（Pierce，3206）。血清白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，20170910，20170805）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和柴胡疏肝散高劑量組、低劑量組，每組10只。除假手術(shù)組以外，其余各組大鼠以大腦中動(dòng)脈線栓阻塞法（MCAO）聯(lián)合慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激法（CUMS）誘導(dǎo)抑郁樣行為建立PSD大鼠模型。所有大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水后采用改良線栓法[4]制備右側(cè)MCAO局灶性腦缺血模型。具體手術(shù)方法：2%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定，備皮，在大鼠頸部做正中切口，鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎大鼠頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，在頸外動(dòng)脈距離頸總動(dòng)脈2～3 mm處打一虛結(jié)，夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈結(jié)扎處和虛結(jié)之間剪一小口，插入栓線，系緊虛結(jié)，松開(kāi)動(dòng)脈夾，無(wú)出血后剪斷頸外動(dòng)脈，將栓線推入頸內(nèi)動(dòng)脈約18 mm，縫合、消毒，90 min后進(jìn)行再灌注。注意維持大鼠在術(shù)中及術(shù)后體溫在37 ℃。術(shù)后腹腔內(nèi)注射0.2萬(wàn)單位青霉素以預(yù)防感染，回籠后常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后若有大鼠死亡，則補(bǔ)以同批次相似體質(zhì)量大鼠。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)前肢彎曲、肩內(nèi)旋和以對(duì)側(cè)上肢為重的癱瘓，前進(jìn)時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈。選用缺血造模成功的大鼠，手術(shù)后第1天開(kāi)始每天不同時(shí)間選取夾尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、束縛5 min、晝夜顛倒24 h、電擊1 min、4 ℃冰水游泳5 min等7種刺激方法中的一種[5]，交替應(yīng)激大鼠，避免機(jī)體對(duì)同種強(qiáng)度的單一應(yīng)激產(chǎn)生耐受性，共刺激3周。假手術(shù)組大鼠無(wú)栓線插入，不給予CUMS刺激。

2.2 給藥 造?；蚴中g(shù)后按人鼠體表面積換算藥物劑量進(jìn)行灌胃給藥，共連續(xù)給藥21 d。各給藥組劑量分別為：柴胡疏肝散高劑量組生藥量11.8 g/kg，柴胡疏肝散低劑量組生藥量5.9 g/kg。取柴胡疏肝散生藥粉用生理鹽水配成所需濃度的混懸液，給藥體積為1 mL/100 g，假手術(shù)組、模型組每天灌胃等體積生理鹽水。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià) 分別于造模前、造模后第1天及治療結(jié)束第1天進(jìn)行測(cè)試。參照BEDERSON等[6]神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)（0分），無(wú)神經(jīng)功能障礙；1級(jí)（1分），提大鼠尾，見(jiàn)癱瘓側(cè)前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2級(jí)（2分），除1級(jí)體征外，向癱瘓側(cè)推時(shí)感阻力較對(duì)側(cè)明顯降低；3級(jí)（3分），除以上體征外，大鼠爬行時(shí)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；4級(jí)（4分），不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

2.3.2 行為學(xué)評(píng)價(jià) 分別于造模前、造模后第1天及治療結(jié)束第1天進(jìn)行測(cè)試。糖水偏好試驗(yàn)：試驗(yàn)前1 d訓(xùn)練大鼠適應(yīng)糖水。禁食24 h后，分別將裝有蒸餾水和1%蔗糖水溶液的水瓶放于鼠籠上，中途交換兩只水瓶的位置。記錄2 h內(nèi)大鼠攝入蒸餾水及糖水的量，計(jì)算糖水偏好率。糖水消耗率（%）=糖水消耗/總液體消耗×100%。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前1 d訓(xùn)練大鼠適應(yīng)性游泳15 min。將大鼠放入水深25 cm的玻璃缸內(nèi)（高26 cm，直徑18 cm），水溫25 ℃。應(yīng)用DepressionScan觀察6 min內(nèi)大鼠的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，記錄入水2 min后大鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面的持續(xù)時(shí)間作為強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠擦干，放回籠中單獨(dú)飼養(yǎng)。

2.3.3 血清IL-6、TNF-α水平 治療結(jié)束后第1天腹腔注射2%戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血置于抗凝采血管內(nèi)，以離心半徑10 cm，3 500 r/min離心10 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中IL-6、TNF-α含量。

2.3.4 海馬組織BDNF、TrkB、NF-κB水平 采用4%多聚甲醛固定大鼠后，依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜取海馬組織，迅速置于液氮中，-80 ℃凍存。用裂解液裂解海馬組織，離心收集蛋白，BCA試劑盒蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉緩沖液室溫?fù)u床震蕩1 h，加一抗（BDNF、TrkB、NF-κB、Tubulin稀釋度均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌3次，加羊抗兔二抗，孵育1 h。ECL顯色，暗室曝光，采用Quantity One圖像分析軟件對(duì)顯色條帶進(jìn)行分析，采集目的蛋白BDNF、TrkB、NF-κB和Tubulin的灰度比值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（）表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，組間比較采用隨機(jī)方差分析，不滿足正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠造模前后與治療后神經(jīng)功能評(píng)分比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較（） 單位：分

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較（） 單位：分

注： 與同時(shí)期假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與同時(shí)期模型組比較，#P＜0.05；與本組造模后比較，*P＜0.05；治療后柴胡疏肝散各劑量組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 造模前 造模后 治療后假手術(shù)組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 0.00±0.00 2.90±0.74△ 2.50±0.53△柴胡疏肝散低劑量組 10 0.00±0.00 2.80±0.79△ 1.60±0.52△#*柴胡疏肝散高劑量組 10 0.00±0.00 3.00±0.67△ 1.40±0.52△#*

3.2 各組大鼠造模前后與治療后糖水消耗率比較 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)糖水消耗率比較（） 單位：%

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)糖水消耗率比較（） 單位：%

注： 與同時(shí)期假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與同時(shí)期模型組比較，#P＜0.05；與同時(shí)期柴胡疏肝散低劑量組比較，▲P＜0.05；與本組造模后比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 造模前 造模后 治療后假手術(shù)組 10 74.54±5.64 74.91±5.65 73.19±6.31模型組 10 78.45±4.91 50.21±5.44△ 52.30±5.93△柴胡疏肝散低劑量組 10 77.31±5.29 49.52±3.58△ 61.36±6.67△#*柴胡疏肝散高劑量組 10 77.91±4.57 47.86±4.07△ 67.86±2.83△#▲*

3.3 各組大鼠造模前后與治療后強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較（） 單位：s

表3 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較（） 單位：s

注： 與同時(shí)期假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與同時(shí)期模型組比較，#P＜0.05；與本組造模后比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 造模前 造模后 治療后假手術(shù)組 10 106.37±11.80 104.83±13.29 100.63±11.18模型組 10 107.82±13.18 164.97±20.03△ 155.77±27.23△柴胡疏肝散低劑量組 10 109.16±14.64 167.55±18.75△ 135.04±14.90△*#柴胡疏肝散高劑量組 10 106.77±20.03 163.32±18.96△ 118.49±14.80△#*

3.4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平及海馬組織BDNF、TrkB、NF-κB表達(dá)比較 見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α及海馬NF-κB、BDNF、TrkB表達(dá)（）

表4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α及海馬NF-κB、BDNF、TrkB表達(dá)（）

注： 與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與柴胡疏肝散低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 IL-6/（pg/mL） TNF-α/（pg/mL） NF-κB/（pg/mL） BDNF（μg/L） TrkB/（ng/mL）假手術(shù)組 10 40.59±4.56 44.17±3.64 0.84±0.05 0.41±0.02 1.21±0.10模型組 10 77.13±6.73△ 80.78±11.64△ 1.37±0.12△ 0.15±0.03△ 0.64±0.05△柴胡疏肝散低劑量組 10 70.22±9.73△ 68.94±10.86△# 1.13±0.13△# 0.23±0.03△# 0.79±0.08△#柴胡疏肝散高劑量組 10 65.83±12.87△# 54.36±5.60△#▲ 0.98±0.07△#▲ 0.32±0.04△#▲ 0.96±0.11△#▲

4 討論

卒中后抑郁屬中醫(yī)學(xué)“郁證”與“中風(fēng)”之共病范疇，與卒中“陰陽(yáng)失調(diào)、氣血逆亂”的基本病機(jī)相關(guān)，乃因風(fēng)、痰、火、瘀交熾郁結(jié)致氣血郁滯不暢、肝失條達(dá)而致，病機(jī)特點(diǎn)主要為“肝氣郁滯，脈絡(luò)瘀阻”?！端貑?wèn)·六元正紀(jì)大論》言“木郁達(dá)之”，《證治匯補(bǔ)·郁證》言“郁病雖多，皆因氣不周流，法當(dāng)順氣為先”，治當(dāng)疏肝開(kāi)郁。柴胡疏肝散出自《景岳全書(shū)》。方中柴胡辛散苦瀉為疏肝之要藥，功擅疏肝理氣，暢達(dá)氣機(jī)；川芎活血行氣、通絡(luò)止痛，香附疏肝理氣、行氣止痛，共助柴胡疏肝解郁活血；芍藥、甘草酸甘化陰，既養(yǎng)血柔肝，又可防柴胡、香附之辛苦傷陰；陳皮、枳殼升降相因，理氣健脾、燥濕化痰，防肝病傳脾；甘草調(diào)和藥性。諸藥相輔相成，使得柴胡疏肝散具有良好的抗抑郁作用。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一員，廣泛存在于中樞與外周，對(duì)神經(jīng)元的增殖、分化和存活至關(guān)重要。BDNF與抑郁癥的關(guān)系早已被反復(fù)證實(shí)[7]，而近幾年其與PSD的關(guān)系也在逐漸被認(rèn)識(shí)[8]?，F(xiàn)有研究顯示嚙齒類動(dòng)物PSD模型中海馬、紋狀體等[9]部位BDNF表達(dá)水平下調(diào)，五羥色胺在攝取抑制劑（SSRI）治療后水平顯著上調(diào)[8]。同時(shí)BDNF置換治療也已開(kāi)始應(yīng)用于神經(jīng)變性疾病諸如亨廷頓病、阿爾茲海默病及抑郁癥的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中[10]。

我們前期臨床研究發(fā)現(xiàn)PSD患者血清BDNF水平顯著下降[2]，給予柴胡疏肝散加味后BDNF水平顯著提升?；贐DNF存在外周與中樞平行變化的特點(diǎn)[11]，我們建立了大鼠大腦中動(dòng)脈線栓阻塞法（MCAO）聯(lián)合慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激法（CUMS）復(fù)合PSD模型以驗(yàn)證柴胡疏肝散的中樞作用機(jī)制。結(jié)果顯示PSD模型大鼠表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損、糖水消耗量減少、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[8]，證實(shí)此模型能成功模擬卒中后的功能缺失，并體現(xiàn)了抑郁的核心癥狀——快感缺失和絕望心境。經(jīng)柴胡疏肝散高低劑量治療21 d后，大鼠神經(jīng)缺損和抑郁程度較治療前均有明顯減輕；同時(shí)柴胡疏肝散高劑量比低劑量更能增加大鼠的糖水消耗率，并縮短強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。進(jìn)一步對(duì)模型組大鼠的海馬組織進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)BDNF表達(dá)水平顯著下降，而TrkB作為BDNF的特異性功能受體，同樣在海馬區(qū)表達(dá)降低。眾多研究表明BDNF與其受體TrkB共同作用可增加突觸可塑性，促進(jìn)軸突及樹(shù)突生長(zhǎng)，增加突觸末端密度。大量基因?qū)W研究證實(shí)，抗抑郁藥主要通過(guò)激活TrkB信號(hào)通路，增加腦內(nèi)BDNF水平，起到改善抑郁行為的作用。而完整的BDNF/TrkB信號(hào)通路不僅是抗抑郁藥促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生，也是其促進(jìn)前額葉皮質(zhì)、杏仁核等關(guān)鍵部位突觸發(fā)生和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）的必要基礎(chǔ)[12]。本實(shí)驗(yàn)給予不同劑量的柴胡疏肝散干預(yù)，PSD大鼠海馬BDNF和TrkB表達(dá)均有顯著上升，而高劑量組表達(dá)水平顯著高于低劑量組，初步認(rèn)為柴胡疏肝散可能通過(guò)BDNF/TrkB信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用，并與劑量相關(guān)。

以活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和表達(dá)上調(diào)的促炎因子為基礎(chǔ)的神經(jīng)炎癥也參與了PSD的發(fā)病過(guò)程[1]。有研究證實(shí)臨床患者血清IL-6、TNF-α等炎性因子水平上升與PSD的發(fā)生有關(guān)[13]。與此報(bào)道一致，本研究結(jié)果顯示PSD模型大鼠的血清IL-6、TNF-α水平和海馬NF-κB表達(dá)顯著升高。NF-κB是炎癥細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性調(diào)控因子，IL-6、TNF-α等均為其靶基因。NF-κB激活后介導(dǎo)下游眾多炎性反應(yīng)介質(zhì)如環(huán)氧化酶2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）以及其他眾多炎性因子，直接導(dǎo)致吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）表達(dá)增加，促使色氨酸代謝為犬尿酸，抑制5-羥色胺（5-HT）合成途徑，造成額葉皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū)等部位5-HT減少，色氨酸有毒產(chǎn)物增加。另一方面促炎因子的增加還會(huì)導(dǎo)致HPA軸功能失調(diào)，增加卒中后神經(jīng)功能惡化和死亡幾率，也增加抑郁發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[14]。而經(jīng)柴胡疏肝散治療后血清TNF-α水平和海馬NF-κB表達(dá)顯著下降，同時(shí)高劑量組上述指標(biāo)下降更明顯，顯示柴胡疏肝散具有抑制神經(jīng)炎癥的潛力。

綜上，柴胡疏肝散治療PSD的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)BDNF/TrkB信號(hào)通路，抑制神經(jīng)炎癥相關(guān)。前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也顯示了柴胡疏肝散對(duì)PSD的治療作用可能涉及調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答、突觸合成等生物學(xué)過(guò)程[15]。本研究?jī)H初步驗(yàn)證了柴胡疏肝散對(duì)PSD的療效，應(yīng)進(jìn)一步明確神經(jīng)炎癥與突觸功能的關(guān)系，深入尋找二者之間的核心介質(zhì)，有助于進(jìn)一步揭示柴胡疏肝散治療PSD的科學(xué)內(nèi)涵和PSD發(fā)病機(jī)制。