尉捷 王丹 王育林

摘要? 目的：優(yōu)化敗醬多糖提取工藝，并評價其體外抗氧化活性。方法：在單因素考察的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以提取時間、提取溫度、料液比為考察因素，以多糖提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化敗醬多糖的提取工藝;采用比色法考察其抗氧化活性。結(jié)果：最佳條件為提取時間3 h，提取溫度100 ℃，提取次數(shù)3次，料液比1∶ 25，多糖提取率為（3.42±0.27）%。多糖對1，1-二苯基-2-吡啶酰肼（DPPH）自由基具有較高的清除活性，對超氧陰離子和羥基的自由基清除作用相對不明顯。結(jié)論：該方法穩(wěn)定可靠，可用于提取具有較強(qiáng)抗DPPH活性的敗醬多糖。

關(guān)鍵詞? 敗醬;多糖;提取條件;抗氧化活性

Extraction Optimization and Antioxidant Activity Estimation for Polysaccharides from Patrinia

WEI Jie1，2，WANG Dan2，WANG Yulin1

（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Beijing City University，Beijing 100083，China）

Abstract Objective： To optimize the extraction process for polysaccharides from Patrinia and to estimate their in vitro antioxidant activity. Methods： An orthogonal experiment was designed on the basis of single factor investigation，extraction time，extraction temperature，material-to-liquid ratio was taken as investigation factors，polysaccharide extraction rate was taken as an investigation index，and the extraction process of polysaccharides from Patrinia was optimized; colorimetry was used to investigate its antioxidant activity. Results： The optimal conditions were determined to be 3 h for extraction time，100 ℃ for extraction temperature and 1：25 for solid-liquid ratio，the extraction rate was（3.42±0.27）%.Polysaccharides have high scavenging activity on 1，1-diphenyl-2-pyridine hydrazide（DPPH）free radicals，but relatively little scavenging activity on superoxide anion and hydroxyl radicals. Conclusion： This method is stable and reliable，and can be used to extract polysaccharides from Patrinia with strong anti-DPPH activity.

Keywords? Patrinia; Polysaccharides; Extraction condition; Antioxidant activity

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.002

敗醬草，又名胭脂麻，為敗醬科植物黃花敗醬（ Patrinia scabiosaefolia? Fisch.ex Trev）、白花敗醬（ Patrinia villosa? Juss）的帶根全草，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。辛、苦，微寒，歸胃、大腸、肝經(jīng)，具有清熱解毒、祛瘀止痛等功效，可用于治療腸癰、肺癰、燥熱便秘等證[1]。

敗醬中的化學(xué)成分主要有黃酮類、皂苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油和多糖類等，比較復(fù)雜多樣[2]。其藥理作用也非常廣泛，有抑菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤作用等。孟良玉等從敗醬中提取的黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，沈德鳳等發(fā)現(xiàn)白花敗醬總皂苷通過提高抗氧化能力發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4]。

從藥用植物中提取的多糖因其獨(dú)特的生物活性，近年來受到了越來越多的關(guān)注[5-6]。植物多糖具有較強(qiáng)的抗氧化和調(diào)節(jié)免疫作用，可以通過體外作為自由基清除劑用于預(yù)防多糖的氧化損傷。然而，迄今為止還沒有關(guān)于敗醬多糖（PSP）的抗氧化性的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用L9（3）4正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化了敗醬多糖的提取，并評價了敗醬多糖的抗氧化活性，為中藥敗醬草的開發(fā)和敗醬多糖的利用提供參考[7-8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平（METTLER TOLEDO公司，瑞士，型號：PL203）、干燥箱（上海力辰科技有限公司，型號：101-0BS）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-2010）、恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司，型號：HH-S26）、數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500DB）、艾澤拉多功能粉碎機(jī)（浙江萬基塑業(yè)有限公司，型號：2000c）、恒溫恒濕箱（天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠，型號：HSP-250B）、精密pH計(jì)（賽多利斯公司，德國，型號：PB-10）。

1.2 試劑 D-無水-葡萄糖（中國食品藥品鑒定研究院，批號：11508-201602），1，1-二苯基-2-吡啶酰肼（DPPH）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：D1602005）

1.3 分析樣品 敗醬草于2016年5月采集于中國廣西省玉林市，經(jīng)北京城市學(xué)院李京生教授鑒定為敗醬科植物黃花敗醬 Patrinia scabiosaefolia? Fisch.ex Trev的干燥全草，粉碎后過40目篩后備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材預(yù)處理 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行藥材預(yù)處理，簡述如下：稱取敗醬黃花藥材粉末1 000 g，用石油醚（60～90 ℃）脫脂后，加入95%乙醇提取3次，得到藥渣約246 g。

2.2 敗醬多糖含量測定

2.2.1 線性關(guān)系考察 采用苯酚-硫酸法，按參考文獻(xiàn)進(jìn)行操作[9]，葡萄糖做為對照品溶液，蒸餾水同法操作，作為空白對照，在波長492 nm下測吸光度值。以對照品葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.015 6X-0.007 8（R2=0.998），在5～40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 方法學(xué)考察 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-9]進(jìn)行方法學(xué)考察，可知儀器精密度良好，RSD為0.12%;方法重復(fù)性良好，RSD為2.07%;溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.54%;方法準(zhǔn)確度良好，平均加樣回收率為97.63%，RSD為4.79%。

2.3 敗醬多糖提取單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取時間考察 取適量藥渣（M1），精密稱定，放置于150 mL具塞三角瓶中，加入1∶ 20的蒸餾水，于超聲（40 kHz，200 W）提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，每組平行3次。所得液體過濾并減壓濃縮至約10 mL，按照Savage法除蛋白[10]，減壓干燥，得到精制多糖，精密稱定其質(zhì)量（M2），計(jì)算提取率（公式為：M2/M1×100%）。見圖1。隨著提取時間的增加，敗醬多糖提取率逐漸增加，從1 h增加到3 h，提取率顯著提高，提取時間為3 h達(dá)到最大值（3.46±0.10）%，而當(dāng)提取時間超過3 h時，得率無明顯增加，故選擇2～3 h做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.2 提取溫度 取適量藥渣，精密稱定，放置于150 mL具塞三角瓶中，加入料液比為1：20的水，提取溫度分別為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃，超聲處理120 min（ n =3），按“2.3.1”項(xiàng)下方法核算敗醬多糖提取率。見圖2。由圖2可知，當(dāng)提取溫度從60 ℃提高到100 ℃，提取率明顯提高，在100 ℃時達(dá)到峰值（3.29±0.113）%;其中，提取溫度在95～100 ℃范圍內(nèi)時，多糖產(chǎn)量沒有明顯增加，故選擇80～100 ℃做下一步優(yōu)化。

2.3.3 料液比 取適量藥渣，精密稱定，放置于150 mL具塞三角瓶中，加入蒸餾水，和物料的比例分別為1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30的蒸餾水，加熱溫度均為100 ℃，超聲處理120 min（ n =3）。按“2.3.1”項(xiàng)下方法核算敗醬多糖提取率。見圖3。敗醬多糖的提取率隨著料液比增加而增加，在1∶ 25時達(dá)到最大值（3.28±0.09）%，然后隨著水料比的進(jìn)一步增加，產(chǎn)量沒有再明顯增加。將下一步試驗(yàn)料液比定為1∶ 20～1∶ 30。

2.3.4 提取次數(shù) 取適量藥渣，精密稱定，放置于150 mL具塞三角瓶中，加蒸餾水，和物料的比例為1∶ 20，加熱溫度均為95 ℃，超聲提取120 min，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5次（ n =3），按“2.3.1”項(xiàng)下方法核算敗醬多糖提取率。見圖4。由圖可知，增加提取次數(shù)，提取率明顯提高，在3次時達(dá)到峰值（3.52±0.178）%，再增加提取次數(shù)至5次，敗醬多糖產(chǎn)量并沒有提高，故選擇提取次數(shù)為3次。

2.4 正交試驗(yàn) 在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響因素為提取溫度（80 ℃、90 ℃、100 ℃）、提取時間（2 h、2.5 h、3 h）、料液比（1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30），評價指標(biāo)為敗醬多糖提取率，L9（34）為正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，每組平行3個。見表1。

由表1可知，正交試驗(yàn)3個因素影響大小為：提取溫度>料液比>提取時間，所得最佳提取工藝為A3B3C2。由方差分析表2可知，在3個影響因素中，提取溫度的影響較顯著（ P <0.05），其余2個因素?zé)o顯著影響（ P >0.05）。

2.5 正交驗(yàn)證試驗(yàn) 按照最優(yōu)工藝提取敗醬多糖，3次的提取率為3.47%、3.39%、3.40%，平均值3.42%，表示該提取工藝穩(wěn)定性較好。

2.6 多糖精制及其光譜測定 采用Sevage法對敗醬多糖溶液除蛋白[7-9]得精制多糖。將其配成100 μg/mL的溶液，在190～400 nm波長內(nèi)掃描，得其在260 nm、280 nm處均無雜質(zhì)吸收峰，表明精制的敗醬多糖不含蛋白質(zhì)和核酸。

2.7 敗醬多糖體外活性測定

2.7.1 PSP還原力測定 根據(jù)DENG等[11]文獻(xiàn)中的方法對PSP的還原力進(jìn)行了評價。反應(yīng)混合物中含：2.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH值6.6），2.5 mL鐵氰化鉀（1%）和PSP（100～2 000 mg/L）。在50 ℃條件下培養(yǎng)30 min后，取出后加入將2.5 mL三氯乙酸（10%），搖勻、離心（1 200× g）10 min。收集上清液2.5 mL于新試管中，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL FeCl3（0.1%），溶液搖勻，室溫培養(yǎng)15 min，測定700 nm吸光度值。以相同濃度的VC為陽性對照。見圖5。由圖可知，隨敗醬多糖濃度增加總還原力升高，但比相同濃度的Vc要低?？傔€原力可以反映潛在的抗氧化活性[12]，由此可見，PSP的還原力較小。

2.7.2 DPPH自由基清除能力測定 參考Shimada等[13]的方法做DPPH自由基清除測定實(shí)驗(yàn)是，過程略作調(diào)整。向試管中加入2 mL DPPH（每95%乙醇中含0.1 μg/mol）和2 mL PSP（100～2 000 mg/L）。在25 ℃下培養(yǎng)15 min，以Vc作為陽性對照，在517 nm下測定其吸光度值。用95%乙醇代替樣品作空白對照，記A0，用以下公式對PSP的抗氧化活性進(jìn)行了評價：

清除率/%= A0-（Ai-Ai0） A0 ×100%

其中Ai為PSP/VC的吸光度，A0為DPPH溶液的吸光度。

DPPH是1，1-二苯基-2-吡啶酰肼，是一種穩(wěn)定的自由基，能接受氫自由基或電子，成為一種穩(wěn)定的抗磁分子，被廣泛應(yīng)用于自由基的測定[14-15]。同時，DPPH自由基穩(wěn)定性好，最大吸收波長為517 nm，具有較好的抗氧化能力。PSP對自由基的清除作用結(jié)果見圖6所示，在100～500 mg/L濃度范圍內(nèi)，PSP和VC對DPPH自由基均有明顯的清除活性，濃度為500 mg/L時，PBP的清除率可達(dá)到88.4%，但在濃度為500 mg/L（500～2 000 mg/L）時，清除活性無明顯提高。PSP對DPPH自由基清除活性的EC50值為105 mg/L，VC的EC50值為42 mg/L，得出多糖清除DPPH自由基的能力是Vc的40%。

2.7.3 羥自由基清除能力測定 羥自由基清除活性實(shí)驗(yàn)采用Winterburn CC等[16]的方法進(jìn)行測定。反應(yīng)混合物中含：1 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）、1 mL濃度為40 g/mL的琥珀酸鈉、1 mL 0.945 mm的EDTA-Fe（Ⅱ）、1 mL 3%（v/v）的H2O2和0.5 mL的PSP（100～2 000 mg/L）。37 ℃培養(yǎng)30 min后，以VC為陽性對照在560 nm處測定吸光度。以蒸餾水代替樣品，記A0，用以下公式計(jì)算PSP清除羥自由基的能力：清除率（%）=（A0- Ai）/A0×100%，公式中A0指空白的吸光度，Ai為PSP/VC的吸光度。羥基自由基很容易穿過細(xì)胞膜，容易與大多數(shù)生物分子（包括細(xì)胞中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA）發(fā)生反應(yīng)，從而造成組織損傷或細(xì)胞死亡，羥自由基的清除對于保護(hù)生命系統(tǒng)至關(guān)重要[17-18]。PSP對羥自由基的清除率結(jié)果見圖7所示，樣品濃度范圍為0.1～1 mg/mL。在此基礎(chǔ)上，隨著樣品濃度的增加，其清除活性迅速增加。PSP的EC50值為1 705 mg/L，VC的EC50值為490 mg/L，得出多糖清除羥基自由基的能力是Vc的28.74%。

2.7.4 超氧陰離子清除能力測定 采用了Wang CY等[19]的方法測定了超氧陰離子自由基清除活性程度。用4.5 mL的50 mmol Tris-HCl緩沖液（pH值8.2）與4.2 mL去離子水混合，在25 ℃的條件下培養(yǎng)20 min后，加入1 mL的PSP溶液和0.4 mL的焦性沒食子酸。將所得混合物快速搖勻，在25 ℃的條件下培養(yǎng)5 min，立即在混合物中加入8 mmol鹽酸終止反應(yīng)，并在320 nm處測其吸光度值，用Vc作陽性對照。用以下公式計(jì)算清除能力：清除率（%）=（A0- Ai）/A0×100%，公式中A0指空白的吸光度，Ai為PSP/VC的吸光度。超氧陰離子作為單線態(tài)氧和羥基自由基的前驅(qū)體之一，間接引發(fā)脂質(zhì)過氧化。此外，超氧陰離子的存在還會加重細(xì)胞的損傷，因?yàn)樗鼤a(chǎn)生其他種類的自由基和氧化劑[20]，超氧自由基清除試驗(yàn)的結(jié)果見圖8所示。Vc對其的清除率與其濃度成正比。PSP對其的清除率隨濃度的增加而增加，PSP的EC50值為1 705 mg/L，VC的EC50值為357 mg/L，得出多糖對超氧陰離子的清除能力是Vc的20.4%。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)的方法，對提取時間、提取溫度、水料比等3個自變量的影響進(jìn)行了評價，研究了敗醬中水溶性多糖的提取。敗醬多糖的最佳提取條件為：提取溫度100 ℃，水料比25∶ 1，提取時間3 h，提取次數(shù)3次。此工藝下，PSP的得率為（3.42±0.27）%，得到了高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的生物活性多糖。

敗醬多糖具有抗氧化能力，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PSP對DPPH自由基具有較高的自由基清除活性，對羥自由基和超氧陰離子有清除活性。

本研究通過正交試驗(yàn)，為大規(guī)模生產(chǎn)PSP提供了最佳的提取工藝，PSP可被作為一種新型和潛在的天然抗氧化劑，用于功能性食品或醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。

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（2019-12-10收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303292）——五味子乙素對非酒精性脂肪肝的作用和分子機(jī)制研究作者簡介：尉捷（1980.07—），女，博士，副教授，研究方向：中藥的活性成分研究，E-mail：xiaoxuyujie@163.com通信作者：王育林（1958.04—），男，博士，教授，研究方向：中醫(yī)醫(yī)史文獻(xiàn)，Tel：（010）64799902，E-mail：lionw@vip.sina.com