李紅昌，劉維燕，王建法，潘高峰，陸景鋒，劉嘉哲，胡麗萍

（上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院普外科 上海 201100）

三陰性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體（HER-2）均為陰性的一類乳腺癌，約占所有乳腺癌病理類型的15%，其預(yù)后差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、死亡率高。由于TNBC 的內(nèi)分泌治療效果不佳，化療為其重要治療手段，目前常用化療藥物包括紫杉類（紫杉醇，多西紫杉醇又名多西他賽，白蛋白合成紫杉醇)，蒽環(huán)類（阿霉素、表阿霉素，各類脂質(zhì)體阿霉素），抗代謝類（卡培他濱、吉西他濱）。TNBC 容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響療效[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，臨床化療藥物多西他賽（Docetaxel，Doc）長期應(yīng)用可以誘導(dǎo)TNBC 細(xì)胞自噬水平異常升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥，而降低細(xì)胞自噬水平可以增強腫瘤細(xì)胞對多西他賽的敏感性[2]。miRNA 是一類長度為19-25nt 的非編碼單鏈小分子，可以與其靶基因的mRNA 3′非編碼區(qū)（3′UTR）特異性結(jié)合，抑制靶基因表達(dá)。近年來關(guān)于非編碼RNA 如miRNA 在調(diào)控腫瘤自噬過程中的作用研究越來越受到重視。研究顯示miRNA 可以通過調(diào)控細(xì)胞自噬水平進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的耐藥[3]。

中醫(yī)藥治療對乳腺癌術(shù)后并發(fā)癥及減輕乳腺癌放化療毒副反應(yīng)有著重要的臨床意義。其中，復(fù)方斑蝥注射液（Compound Cantharis Injection，CCI），又名艾迪注射液，是臨床上TNBC 常用的化療輔助藥物[4]，目前關(guān)于復(fù)方斑蝥抑制自噬抗TNBC 耐藥的機(jī)制尚未見報道。因此，本研究觀察復(fù)方斑蝥逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌耐藥的藥理學(xué)作用并探討miRNA-自噬信號軸是否是CCI逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌耐藥的關(guān)鍵機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；多西他賽（Docetaxel，Doc）購自美國MedChemExpress 公司；TRIzol 試劑、TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國ThermoFisher公司；TaKaRa 6210A反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司；miR-520d mimics 及inhibitors 購自美國Qiagen 公司；pGL3-Beclin1/BECN13′UTR-promotor 重組質(zhì)粒構(gòu)建由上海基科生物有限公司設(shè)計完成；Beclin1/BECN1 及LC3 抗體購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。PCR 擴(kuò)增儀購自美國Applied Biosystems公司，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人三陰性乳腺癌MDA-MB-231 及MDA-MB-468細(xì)胞株購自美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫（American type culture collections，ATCC），相應(yīng)的多西他賽（Docetaxel, Doc）耐藥株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 誘導(dǎo)于本實驗室。均培養(yǎng)于10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，及37℃并含有5% CO2培養(yǎng)環(huán)境。為了保持耐藥株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 的耐藥表型，多西他賽（終濃度為2 μM）始終加在耐藥細(xì)胞的培養(yǎng)基中，實驗前一周停止加藥。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活性

8 × 103cell/well 密 度 的MDA-MB-231 及MDAMB-468、MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 細(xì)胞接種到96孔板。到細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的多西他賽，置37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 小時后每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，4 小時后吸棄上清，加入100 μL/孔的DMSO，振蕩1 min。待MTT 還原產(chǎn)物溶解完全后，以492 nm 為實驗波長，630 nm 為參照波長運用酶標(biāo)儀檢測其光吸收度。通過計算細(xì)胞的存活率，并確定藥物的IC50。

1.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)

用RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞蛋白。用BCA 試劑盒檢測各組總蛋白濃度，調(diào)平蛋白濃度后，取等量蛋白用10%SDS-PAGE 分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜。5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h，隨后加入一抗，4℃封閉過夜，第2天棄去一抗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫封閉1 h，滴加顯色液顯色，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片。

1.5 miRNA芯片分析

首先運用Trizol 法抽提取終濃度1 mg·ml-1復(fù)方斑蝥及溶劑組處理的MDA-MB-231/Doc細(xì)胞中總RNA。隨后進(jìn)一步使用mirVanaTM 的miRNA 分離試劑盒（購買于Ambion公司）純化總RNA中的miRNA部分，最后將提取好的miRNA 樣品送至上海生物芯片中心進(jìn)行芯片分析，使用安捷倫公司的人miRNA 芯片（v.12.0）進(jìn)行雜交。

1.6 實時定量PCR（RealtimePCR）檢驗miRNA表達(dá)

運用Trizol 從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，用TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，每條miRNA 的相對量均以細(xì)胞中U6 snRNA 的含量為標(biāo)準(zhǔn)，用PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)試劑盒說明書用TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒或?qū)崟r定量PCR 試劑盒進(jìn)行定量分析。實驗所用到的引物均由上海生工設(shè)計合成。所以數(shù)據(jù)均平行3次取平均值。

1.7 熒光素酶報告實驗

通過生物信息預(yù)測miR-520d 上存在Beclin1/BECN1 的結(jié)合位點，用RT-PCR 擴(kuò)增Beclin1/BECN1上含有miR-520d 結(jié)合位點的3′UTR 區(qū)域基因片段，將該片段插入pGL3-promoter 熒光素酶載體，構(gòu)建Beclin1/BECN13′UTR 野生（wild type，WT）質(zhì)粒；再利用基因位點突變技術(shù)對結(jié)合位點的部分核苷酸進(jìn)行突變，構(gòu)建Beclin1/BECN13′UTR 突變（Mutation，Mut）質(zhì)粒。用Beclin1/BECN13′UTR WT 質(zhì)?；駼eclin1/BECN13′UTR Mut質(zhì)粒，海腎熒光素酶對照質(zhì)粒pRLSV40 與miR-520d mimics 對MDA-MB-231/Doc 細(xì) 胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，根據(jù)Dual Luciferase 報告基因試劑盒說明書避光測定熒光素酶活性。

圖1 自噬相關(guān)蛋白Beclin1/BECN1在TNBC耐藥細(xì)胞中表達(dá)增高

圖2 復(fù)方斑蝥通過抑制自噬逆轉(zhuǎn)TNBC化療耐藥

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 24.0 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用GraphPad Prism 8 軟件繪制圖片。實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用One-Way ANOVA 檢測。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自噬相關(guān)蛋白Beclin1/BECN1 在TNBC 化療耐藥細(xì)胞中表達(dá)增高

運用MTT 法檢測TNBC 細(xì)胞MDA-MB-231 及MDA-MB-468 及 其 耐 藥 株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 對于Doc 的敏感性。結(jié)果顯示，對于MDA-MB-231的半數(shù)抑制濃度（IC50）為4.5 μM，相比于其耐藥株（IC50 =45 μM）具有顯著性差異，表明MDA-MB-231/Doc 具有良好的耐藥性；同樣，MDAMB-468 的耐藥株MDA-MB-468/Doc 也具有良好的耐藥性（圖1A）。WB 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于親本株，TNBC 耐藥細(xì)胞株（MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc）中自噬相關(guān)蛋白Beclin1/BECN1 表達(dá)明顯上升（圖1B），提示Beclin1/BECN1的高表達(dá)可能是TNBC耐藥細(xì)胞株產(chǎn)生耐藥的主要原因之一，也進(jìn)一步驗證了臨床化療藥物多西他賽長期應(yīng)用可以誘導(dǎo)TNBC 細(xì)胞自噬水平異常升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥的這一研究結(jié)果。（圖1）

2.2 復(fù)方斑蝥通過抑制自噬逆轉(zhuǎn)TNBC化療耐藥

MTT 檢測Doc 和CCI 聯(lián)合使用多TNBC 耐藥細(xì)胞株的增殖影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCI 能夠顯著降低Doc 作用下耐藥細(xì)胞株的IC50（圖2A），提高TNBC 耐藥細(xì)胞株化療敏感性，提示復(fù)方斑蝥具有逆轉(zhuǎn)TNBC 化療耐藥的能力。隨后運用免疫印跡法（Western bloting，WB）發(fā)現(xiàn)，CCI能夠濃度依賴性的抑制TNBC耐藥細(xì)胞的自噬水平，明顯下調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1/BECN1，及自噬水平標(biāo)注蛋白LC3II（圖2B），表明復(fù)方斑蝥通過抑制自噬逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌化療耐藥，提高對于多西他賽的藥物敏感性。

2.3 復(fù)方斑蝥上調(diào)miR-520d的表達(dá)

近年來關(guān)于miRNA 在調(diào)控腫瘤自噬過程中的作用越來越受到重視，為了進(jìn)一步探究miRNA 是否在復(fù)方斑蝥逆轉(zhuǎn)TNBC 耐藥起到關(guān)鍵的作用，我們對CCI處理前后的TNBC 耐藥細(xì)胞采用miRNA 芯片檢測，發(fā)現(xiàn)CCI 能夠顯著上調(diào)miR-520d 水平（圖3A&B），RealtimePCR 在MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc中驗證這一結(jié)果（圖3C）。上述結(jié)果提示CCI上調(diào)的miR-520d 可能在復(fù)方斑蝥抑制TNBC 耐藥細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮作用。

圖3 芯片結(jié)果顯示復(fù)方斑蝥上調(diào)TNBC耐藥細(xì)胞中miR-520d的表達(dá)

2.4 MiR-520d 通過作用于Beclin1/BECN13′ UTR 區(qū)域抑制其表達(dá)

通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)Beclin1/BECN1 是miR-520d 潛在的靶點，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-520d 在Beclin1/BECN1 的3′UTR 含 有1個 作 用 位 點（圖4A）。運用雙熒光素酶報告基因法檢測miR-520d在Beclin1/BECN1 的3′UTR 的結(jié)合作用，將構(gòu)建的質(zhì)粒及miR-520d 模擬物（mimics）共轉(zhuǎn)染進(jìn)入MDAMB-231/Doc 細(xì)胞中。圖4B 顯示miR-520d 可以明顯抑制熒光活性的強度，這表明，miR-520d 能夠抑制Beclin1/BECN13′UTR 區(qū)域活性。同時在沒有含有結(jié)合位點的質(zhì)粒組中，熒光活性沒有受到抑制，這表明miR-520d 抑制Beclin1/BECN1 的位點僅有所預(yù)測的這個結(jié)合位點。最后，WB 結(jié)果顯示miR-520d mimics能夠明顯抑制TNBC 耐藥細(xì)胞株（MDA-MB-231/Doc及MDA-MB-468/Doc）中Beclin1/BECN1 的蛋白表達(dá)。綜上，miR-520d 通過作用于Beclin1/BECN13′UTR 區(qū)域的位點進(jìn)而抑制Beclin1/BECN1的表達(dá)。

2.5 MiR-520d 在復(fù)方斑蝥逆轉(zhuǎn)TNBC 化療耐藥過程中起到關(guān)鍵作用

運用MTT法檢測miR-520d在CCI逆轉(zhuǎn)TNBC化療耐藥過程中的作用。結(jié)果顯示miR-520d mimics 能夠顯著提高TNBC耐藥性細(xì)胞對于多西他賽的敏感性（圖5A&C）；相反，如果運用miR-520d抑制劑（inhibitor）抑制miR-520d的水平能夠明顯減弱CCI所促進(jìn)的TNBC耐藥性細(xì)胞對于DOC的敏感性。

圖5 復(fù)方斑蝥通過調(diào)節(jié)MiR-520d的表達(dá)逆轉(zhuǎn)TNBC化療耐藥

3 討論

中醫(yī)在乳腺癌的辨證論治方面有著獨特的優(yōu)勢，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為乳腺癌系情志失調(diào)，肝氣郁結(jié)，經(jīng)絡(luò)痞塞，氣機(jī)阻滯，痰濁、瘀血內(nèi)生，郁久化熱成毒，或沖任失調(diào)，氣血虧損，痰濁內(nèi)生，阻滯氣機(jī)血行，久而成積[5]。病機(jī)錯綜復(fù)雜，但以痰瘀阻絡(luò)、化熱成毒為主要病機(jī)，正氣虛弱是乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，毒痰瘀結(jié)是乳房癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。因此，從毒痰瘀虛論治三陰乳腺癌是預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的中藥治療方法[6]。中醫(yī)藥治療對乳腺癌術(shù)后并發(fā)癥及減輕乳腺癌放化療毒副反應(yīng)有著重要的臨床意義。其中，CCI 是臨床上三陰乳腺癌常用的化療輔助藥物。CCI 是由斑蝥、人參、黃芪、刺五加組成，是現(xiàn)代組方的純中藥制劑。方中以祛邪為主要作用的斑蝥為君藥，斑蝥體內(nèi)含有斑蝥素，是抗腫瘤的主要活性成分；具有扶正為主要作用的人參、黃芪共為臣藥；為增強參芪扶正之功，配以刺五加為佐使之藥。該藥具有破血消瘀、清熱解毒、攻毒蝕瘡、扶正固本功效，可提高免疫力，激活抑癌基因，殺死癌細(xì)胞，對化療有協(xié)同和輔助作用。CCI主要成分斑蝥有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，斑蝥提取物的抗腫瘤活性成分為去甲斑蝥素，它對乳腺癌細(xì)胞均有抑制作用[7]，還具有抗癌而不產(chǎn)生骨髓抑制的特點，能對抗放化療中血細(xì)胞下降。臨床觀察表明，復(fù)方斑蝥對三陰乳腺癌有一定療效，能有效預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，CCI可通過多途徑多靶點對惡性腫瘤起到治療作用：①干擾腫瘤細(xì)胞的DNA 和RNA 的生物合成，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；②抑制癌基因表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；③抑制腫瘤血管新生；④逆轉(zhuǎn)多藥耐藥；⑤保護(hù)骨髓；⑥調(diào)節(jié)免疫，增強淋巴因子激活性殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞活性等[9]。其中，逆轉(zhuǎn)耐藥是CCI 抗腫瘤的作用機(jī)制之一，本研究進(jìn)一步明確了其具體逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制。

細(xì)胞自噬的進(jìn)程主要受自噬相關(guān)基因調(diào)控，Beclinl是自噬激活/啟動的一個標(biāo)志蛋白，通過與不同自噬相關(guān)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，參與調(diào)控自噬體的形成和成熟。在自噬過程中，Beclin1的表達(dá)水平往往會上升[10]。在腫瘤細(xì)胞中Beclin1 可以通過調(diào)控自噬參與腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Doc 誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，輕微應(yīng)激可促進(jìn)應(yīng)激活化信號分子c-Jun 氨基末端激酶-1 介導(dǎo)的Bcl-2 的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致Beclin1 的釋放促進(jìn)自噬發(fā)生，同時釋放的Beclin1 可與Bax結(jié)合抑制凋亡，使得腫瘤細(xì)胞拮抗凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤耐藥[11]。研究證實，在乳腺癌細(xì)胞中降低Beclin1 表達(dá)水平可提高其化療敏感性。因此，探討B(tài)eclin1 表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制對乳腺癌化療耐藥這一臨床難題有極其重要的意義。

本研究應(yīng)用構(gòu)建的三陰性乳腺癌Doc耐藥細(xì)胞株進(jìn)行化療藥物半數(shù)抑制濃度檢測，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌多西他賽耐藥細(xì)胞株相對其親本細(xì)胞株半數(shù)抑制濃度明顯上升，自噬相關(guān)蛋白Beclin1/BECN1 表達(dá)增高，而復(fù)方斑蝥處理后能明顯增加多西他賽的敏感性，顯著降低多西他賽半數(shù)抑制濃度，并且抑制自噬標(biāo)志蛋白Beclin1/BECN1 及LC3II 的表達(dá)，提示復(fù)方斑蝥可能是通過抑制三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞的過度自噬逆轉(zhuǎn)其耐藥作用。

隨著miRNA 在調(diào)控腫瘤自噬過程中的作用研究越來越受到重視[12]，此類研究日趨豐富。研究顯示，miRNAs 可以通過調(diào)控自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞自噬水平。如外泌體miRNA-126通過破壞IRS/Glut-4 信號傳導(dǎo)重塑代謝，激活A(yù)MPK/自噬途徑并穩(wěn)定即將產(chǎn)生的脂肪細(xì)胞中的HIF1α表達(dá)。體內(nèi)抑制miRNA-126 可以減少脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤生長[13]。在MCF-7 乳腺細(xì)胞系中，miR-486-5p 抑制劑誘導(dǎo)自噬并通過增加PTEN 表達(dá)和抑制AKT信號傳導(dǎo)來增強AdoMet 誘導(dǎo)的自噬過程，從而促進(jìn)MCF-7凋亡[14]。同時，有研究表明，miR-224-5p 通過靶向MDA-MB-231 細(xì)胞中的Smad4 抑制自噬，miR-224-5p/Smad4-自噬信號軸可能是乳腺癌治療的新靶點[15]。此外，在TNBC 中，miR-20a 介導(dǎo)的自噬缺陷可能是乳腺腫瘤發(fā)生過程中miRNA 致癌功能的新機(jī)制[16]。小分子miR-376a 可以通過抑制ATG4B 和Beclin1 表達(dá)而抑制MCF-7 細(xì)胞和Huh-7 細(xì)胞因饑餓誘導(dǎo)的自噬[17]。進(jìn)一步檢索發(fā)現(xiàn)，miRNA 可以通過調(diào)控細(xì)胞自噬水平進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的耐藥，如miR-181 不僅可以抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞本底的自噬水平，而且抑制藥物如依托泊苷和雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)耐藥[18]。在乳腺癌中，miR-214 通過抑制自噬從而增強乳腺癌細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性[19]。具有自噬調(diào)節(jié)功能miR-129-5P 可以通過與Beclin1 基因3'UTR 序列結(jié)合下調(diào)后者表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其抑制多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、肺癌等細(xì)胞自噬的作用[20]。

為了進(jìn)一步探究復(fù)方斑蝥逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌耐藥的分子機(jī)制，我們對復(fù)方斑蝥處理前后的三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞MDA-MB-231/Doc 進(jìn)行microRNA 芯片檢測，發(fā)現(xiàn)復(fù)方斑蝥能夠顯著上調(diào)miR-520d 水平，RealtimePCR 也驗證了這一結(jié)果；通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)Beclin1/BECN1 是miR-520d 潛在的靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-520d可能是診斷乳腺癌的一個特異性生物標(biāo)志物，其在乳腺癌中高表達(dá)，尤其是HER-2陰性的乳腺癌[21]。近幾年來，miR-520d 與腫瘤的關(guān)系也逐漸被重視[22]，miR-520d 通過下調(diào)EphA2 的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23]；研究發(fā)現(xiàn)，在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 中，過表達(dá)miR-520d，可以減弱細(xì)胞的增殖和遷移[24]。因此隨后通過雙熒光素酶報告基因方法，我們確認(rèn)miR-520d 能夠結(jié) 合 到Beclin1/BECN1 mRNA 的3′UTR 區(qū) 域，并 且miR-520d 能夠顯著抑制三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞中Beclin1/BECN1蛋白水平的表達(dá)。最后通過轉(zhuǎn)染miR-520d 的模擬物及抑制劑進(jìn)入三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞中，結(jié)果顯示miR-520d 模擬物能夠顯著增加多西他賽對于耐藥細(xì)胞的敏感性，反之，miR-520d 的抑制劑能顯著抑制復(fù)方斑蝥逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞耐藥的作用。這些結(jié)果明確了miR-520d/Beclin1信號軸是復(fù)方斑蝥逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌化療耐藥的主要機(jī)制。

總之，本實驗結(jié)果表明復(fù)方斑蝥通過上調(diào)三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞miR-520d 的表達(dá)，靶向Beclin1/BECN1 抑制三陰乳腺癌化療耐藥過程中過度自噬，從而增加三陰乳腺癌耐藥細(xì)胞對于化療藥物多西他賽的藥物敏感性，逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌化療耐藥。本課題的研究有助于闡明復(fù)方斑蝥、自噬、耐藥之間的內(nèi)在聯(lián)系，進(jìn)一步了解三陰乳腺癌的化療耐藥機(jī)制，為臨床上以復(fù)方斑蝥作為輔助聯(lián)合用藥治療三陰乳腺癌提供實驗依據(jù)。