盛正和，曾 健，黃 文，李 玲，李斌斌，呂 超，顏凡棋

1.柳州市人民醫(yī)院 中醫(yī)科(柳州 545006)；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院(南寧 530001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種病因未明的以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性慢性疾病，基本病理改變是滑膜炎、晚期關(guān)節(jié)畸形和功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)是臨床治療RA應(yīng)用廣泛的抗風(fēng)濕藥物之一，已成為RA 聯(lián)合用藥方案的基礎(chǔ)藥物[2]。但MTX單獨使用時，療程較長，容易導(dǎo)致副作用增加，部分患者不能耐受[3]。紫杉醇(paclitaxel, PTX)作為從紅豆杉樹皮中提取的一種雙萜類偽生物堿，能影響機體一系列重要細(xì)胞免疫和炎癥活動[1]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，PTX 可以緩解膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，改善RA癥狀。PTX和MTX作為關(guān)節(jié)炎治療的潛在有效藥物，二者聯(lián)合用藥對RA治療效果及作用機制還不清楚，故本實驗采用膠原誘發(fā)建立大鼠CIA模型，給予 MTX和PTX不同劑量單獨或聯(lián)合給藥觀察療效，對MTX、PTX對RA的作用機制進行深入研究，旨在為臨床治療RA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥物及試劑 PTX(阿拉丁試劑，P106868-10 mg)；MTX(阿拉丁試劑，M111239-500 mg)、Ⅱ型膠原蛋白、弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)；大鼠IL-1β、IL-6、IL-12、TNFα ELISA試劑盒(武漢博士德工程有限公司)；MMP-3 ELISA試劑盒(北京誠林生物科技公司)；ECL發(fā)光試劑盒、β-Actin 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗免IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司)；TLR4、p-NFκBp65抗體(英國Abcam公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)。

1.1.2 主要儀器 BX51T-PHD-J11型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RM2015型切片機(德國萊卡公司)；計算機圖像處理系統(tǒng)CMOS(日本奧林巴斯公司)；CA91786 U.S.A UVP GDS-8000 UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國Thermo公司)；DYCZ-24DN型電泳儀系統(tǒng)(北京六一公司)；WSE-4040型半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(美國ATTO公司)；SPECTRONIC?GENESYSTM型紫外可見分光光度計(美國 Milton roy公司)；TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；ELX800型酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)。

1.1.3 Ⅱ型膠原免疫乳劑制備 將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的冰醋酸中，制成2 g/L的Ⅱ型膠原溶液，然后與等體積的弗氏完全佐劑混勻制備成乳劑，乳劑中Ⅱ型膠原的濃度為1 g/L。

1.1.4 大鼠CIA模型建立 SPF級雌性SD 大鼠，體重120～150 g，購自于上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2017-0005]。在大鼠背部中軸線選擇3個接種位點，每個接種位點接種100 μL免疫乳劑。同時在大鼠尾根部注射200 μL乳劑。7 d后在相同的接種點接種同樣劑量乳劑增強免疫。14 d后四肢紅腫為CIA模型構(gòu)建成功。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠CIA模型建立及分組 將建模成功的CIA SD大鼠隨機分為6組，每組10只?？瞻捉M與CIA模型對照組常規(guī)飼養(yǎng)；MTX治療組腹腔MTX給藥，給藥劑量為1 mg/kg，1次/周；PTX低、中、高劑量組進行腹腔PTX給藥，給藥劑量分別為1.5、2.5、3.5 mg/kg，隔日給藥1次；MTX+PTX聯(lián)合治療組腹腔MTX給藥，給藥劑量為1 mg/kg，1次/周，同時進行腹腔PTX給藥，給藥劑量為3.5 mg/kg，隔日給藥1次。以上每組連續(xù)給藥4周后，結(jié)束給藥治療。

1.2.2 踝關(guān)節(jié)炎癥病理學(xué)觀察 斷頸處理大鼠，收集右后肢完整踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色，流動水沖洗后，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜有無增生、血管數(shù)量是否正常、滑膜組織有無炎性細(xì)胞浸潤、組織是否有水腫及充血等現(xiàn)象。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測 將新鮮取材的組織塊用4%多聚甲醛溶液固定，銅制模具包埋，4 μm切片，脫蠟入水，3%甲醇雙氧水，室溫20～30 min，采用高壓修復(fù)，放入磷酸鹽緩沖液(PBS)中，切片上滴加一抗羊抗鼠(1∶200)，4 ℃過夜，用PBS洗2～3次，切片上滴加生物素化二抗，37 ℃下放置20 min，用PBS洗2～3次，再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB 顯色，脫水、透明中性樹膠封片，在每個載玻片中選取陽性表達強的5個視野，并通過Image-Pro Plus軟件計算IL-6和IL-1β陽性細(xì)胞比例。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot)檢測 選取癥狀明顯的左后肢關(guān)節(jié)滑膜組織，加入裂解液，收集上清液并使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h，加入一抗(TLR4, 1∶200; p-NFκBp65, 1∶200)，4 ℃過夜。將孵育一抗的膜用PBST洗滌3次，將二抗用PBST稀釋3 000倍，與膜室溫孵育90 min，用PBST洗去游離二抗，使用ECL試劑盒進行檢測，以β-Actin為內(nèi)部對照，用UVP分析儀進行掃描以確定TLR4和p-NFκBp65蛋白的相對表達。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測 對各組大鼠進行尾靜脈取血，采血后室溫靜置1 h，4 ℃，離心速度1 500 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒的說明書測定血清中MMP-3、IL-12、IL-6、IL-1β和TNFα的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠踝關(guān)節(jié)IL-6和IL-1β的表達比較

免疫組化檢測結(jié)果，IL-6和IL-1β陽性表達于細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕色或棕黃色。CIA模型組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯高于空白組(P<0.05)。與模型組相比， MTX組、PTX低劑量組、PTX中劑量組、PTX高劑量組以及MTX+PTX聯(lián)合治療組的細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)量均有不同程度降低，陽性信號強度減弱，其中以PTX高劑量組降低明顯(P<0.05)(圖1～2)。

2.2 6組大鼠踝關(guān)節(jié)炎癥病理形態(tài)比較

HE染色結(jié)果顯示，與空白組相比，CIA模型組滑膜出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，組織水腫，結(jié)構(gòu)紊亂且滑膜不完整，組織內(nèi)血管數(shù)量增多，血管擴張且部分血管有充血等現(xiàn)象。與模型組相比，各治療組對以上組織病理學(xué)損傷均有不同程度的改善，其中以PTX高劑量組改善效果較為明顯。PTX高劑量組偶見炎性細(xì)胞浸潤，無水腫及充血現(xiàn)象，血管數(shù)量達到正常組水平，滑膜結(jié)構(gòu)整體較完整(圖3)。

2.3 6組大鼠滑膜組織中TLR4和p-NFκBp65蛋白表達

CIA模型組中TLR4和p-NFκBp65蛋白表達水平明顯高于空白組(P<0.01)。與模型組相比，各治療組TLR4和p-NFκBp65的表達量均有所下降，PTX高劑量組降低尤為明顯(P<0.01)(圖4)。

2.4 6組大鼠血清中MMP-3、IL-12、IL-6、IL1-β和TNFα含量比較

模型組中MMP-3、IL-12、IL-6、IL-1β、TNFα的含量明顯高于空白組(P<0.01)。與模型組相比，各治療組中MMP-3、IL-12、IL-6、IL1-β、TNFα的含量均有不同程度的降低(P<0.05)，且PTX高劑量組降低更明顯(圖5)。

3 討論

RA 是一種常見的以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性、全身性、自身免疫性疾病，是一種多因素疾病[5]。RA發(fā)病可能與溶血性鏈球菌或其他細(xì)菌代謝產(chǎn)物、病毒等的持續(xù)感染所引起的遺傳易感個體的自身免疫反應(yīng)密切相關(guān)[6]。RA的治療藥物主要是非甾體抗炎藥、抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素和植物藥等，這些藥物能緩解病情卻毒副作用較大。故尋找到一種安全有效、副作用少的治療藥物或方案已成為臨床研究的重點。CIA與人類RA具有多種相似的免疫及病理特征，是目前理想的關(guān)節(jié)炎模型，故CIA已成為研究RA發(fā)病機制和治療藥物篩選的理想模型[7-8]。本研究通過構(gòu)建CIA大鼠模型，探討MTX和PTX不同劑量單獨或聯(lián)合給藥對CIA大鼠的治療作用比較及機制，為用于治療RA找到PTX優(yōu)選劑量以及聯(lián)合給藥的可能性提供依據(jù)。

以往研究[5-8]結(jié)果提示，PTX與MTX對RA具有治療作用，但對于PTX單獨使用劑量或與MTX聯(lián)合用藥對關(guān)節(jié)炎的藥效尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，MTX和PTX均可改善RA病理特征，但MTX+PTX聯(lián)合治療組未能呈現(xiàn)最佳療效，并且在實驗中觀察到MTX+PTX聯(lián)合治療組大鼠創(chuàng)口不愈合的情況，而PTX高劑量組顯示出對CIA大鼠的最佳療效。這一結(jié)果可能與MTX主要作用于細(xì)胞周期的S期，對G1/S期細(xì)胞也有延緩作用，同時PTX主要作用于細(xì)胞周期的G2/M期，兩藥聯(lián)合時抑制炎癥細(xì)胞增殖的同時過度干擾正常細(xì)胞有絲分裂，造成藥源性組織損傷[9-10]。PTX與MTX聯(lián)合用藥效果低于PTX單獨給藥，且PTX 3.5 mg/kg隔日腹腔給藥一次，為本研究觀察到的優(yōu)選劑量。PTX和MTX作為關(guān)節(jié)炎治療的潛在有效藥物，對RA的發(fā)生與發(fā)展具有重要作用[1，11]。Oliver等[12]發(fā)現(xiàn)PTX可降低關(guān)節(jié)炎評分，能抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，Brahn等[13]發(fā)現(xiàn)在CIA發(fā)病前用PTX進行預(yù)防，可防止CIA發(fā)生，而CIA發(fā)病后用PTX治療可減輕臨床癥狀，包括紅腫及發(fā)熱消退。同時也有臨床研究[14]表明，小劑量應(yīng)用MTX可改善RA 患者的主要癥狀、體征，并可減少炎性滲出。

研究[15-16]表明，IL-12、IL-6、IL1-β具有提高血管通透性，促進滑膜組織血管新生的作用，可促進滑膜慢性炎癥的形成。TNFα可促進滑膜細(xì)胞分泌炎性遞質(zhì)，刺激血管擴張滲出, 從而加強炎癥反應(yīng)[17]。MMP-3是參與關(guān)節(jié)炎的主要介質(zhì)，可促進成纖維細(xì)胞生成，同時還參與膠質(zhì)蛋白酶的激活，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[18]。周瑋等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抑制 IL-1β 和TNFα表達可達到抗關(guān)節(jié)炎的作用，炎癥因子在RA發(fā)展中具有重要作用，本研究檢測了CIA大鼠血清中炎癥因子的表達情況，結(jié)果表明，PTX與MTX可抑制血清中炎癥因子MMP-3、IL-12、IL-6、IL-1β和TNFα的表達。自身的免疫反應(yīng)與RA發(fā)病機制密切相關(guān)[20-21]。本研究結(jié)果顯示，PTX與MTX均可明顯抑制TLR4和p-NF-κBp65蛋白的表達。已有研究[22]發(fā)現(xiàn)，TLR4是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁，NF-κB是RA滑膜炎癥發(fā)生發(fā)展的一條重要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其活化的失調(diào)與RA直接相關(guān)[23- 24]。TLR4啟動的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以激活NF-κB，且NF-κB可通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達參與炎癥反應(yīng)的擴增[25]。NF-κB激活的主要表現(xiàn)為抑制IKBα的磷酸化并對此發(fā)生降解，然后進入細(xì)胞核中，誘導(dǎo)特定基因的表達，激活多種炎性細(xì)胞因子[25]。本研究結(jié)果顯示，TLR4和p-NF-κBp65的表達與血清中炎癥因子的表達呈正相關(guān)，推測當(dāng)抑制TLR4和p-NF-κBp65蛋白的表達可降低MMP-3、IL-12、IL-6、IL-1β和TNFα含量。侯曉彬等[26]發(fā)現(xiàn)，p-NF-κBp65的結(jié)合部位常在促炎細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)的啟動部位，因此p-NF-κBp65表達增高可觸發(fā)促炎細(xì)胞因子IL-6、TNFα合成。以上研究結(jié)果說明，PTX與MTX可能通過抑制TLR4和p-NF-κBp65蛋白的表達，從而對RA起治療作用。

綜上所述，PTX單獨給藥治療作用優(yōu)于PTX與MTX聯(lián)合給藥，且PTX 3.5 mg/kg隔日腹腔給藥一次，是本研究觀察到的優(yōu)選劑量。PTX與MTX對RA具有治療作用，其作用機制可能是PTX和MTX能夠在一定程度上抑制CIA模型滑膜組織中TLR4和p-NF-κBp65蛋白的表達，從而降低血清中炎癥因子的含量。