楊 康，王田甜，孫毅松，冉璐瑤，施松廷，蔣佩文,李 華，楊 平△，李敏惠

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院(成都610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都610500)；4.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 腫瘤科(成都610083)；5.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都610500)

近年來(lái)，隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增趨勢(shì)[1]，預(yù)計(jì)2020年CRC發(fā)病率將達(dá)到20.7/10萬(wàn)[2]。炎癥與CRC發(fā)生發(fā)展間的密切關(guān)系已得到廣泛認(rèn)可。慢性炎癥被普遍認(rèn)為是CRC發(fā)展中的重要病理成分，炎癥引起的細(xì)胞因子和趨化因子的釋放在腫瘤微環(huán)境中可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和存活，有助于腫瘤的進(jìn)展[3]。因此，炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)被認(rèn)為是誘發(fā)CRC的三大高風(fēng)險(xiǎn)誘因之一[4]，且IBD患者發(fā)展成為CRC的風(fēng)險(xiǎn)較正常人顯著升高[5]。

遺傳變異如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，在CRC易感性中發(fā)揮著重要的作用[6]，基于炎癥與CRC的關(guān)聯(lián)性，炎癥因子基因多態(tài)性與CRC易感性研究已成為研究熱點(diǎn)之一。Al Obeed等[7]研究就發(fā)現(xiàn)，IL-17基因多態(tài)性與中東人群CRC易感性顯著相關(guān)，提示炎癥因子的基因多態(tài)性可能與CRC易感性密切相關(guān)。IL-19/IL-20位于1號(hào)染色體q32位置，基于其在基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和受體方面的相似性，將其劃分為IL-10基因家族，其在炎性疾病中發(fā)揮著重要作用[8-9]。在研究IL-20亞家族(IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26)與腸道疾病的關(guān)系時(shí)，研究[10]結(jié)果顯示IL-19和IL-20細(xì)胞因子在IBD的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，在潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD)患者中，其表達(dá)量顯著升高。同時(shí)，研究[11]發(fā)現(xiàn)IL-19基因多態(tài)性與墨西哥人群UC易感性密切相關(guān)，其SNP位點(diǎn)rs2243188和rs2243193可能是墨西哥人患UC的保護(hù)因素。該研究團(tuán)隊(duì)還探討了IL-20基因多態(tài)性與墨西哥人群UC易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示IL-20基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)(rs2981573和rs2232360)的GG基因型為UC易感基因型。由于炎癥與許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，因此，探究炎癥相關(guān)基因與腫瘤的關(guān)系顯得尤為重要。目前關(guān)于IL-19/IL-20基因多態(tài)性與CRC是否相關(guān)聯(lián)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選取IL-19/IL-20基因的5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型測(cè)定及關(guān)聯(lián)性分析，探討IL-19/IL-20基因多態(tài)性與CRC的關(guān)聯(lián)性，以明確2個(gè)基因遺傳變異在我國(guó)漢族人群CRC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年2月至2019年2月西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的94例原發(fā)性CRC患者的外周血樣本。通過(guò)篩選，所有樣本均來(lái)自無(wú)血緣關(guān)系的漢族人群，94例CRC病例組的篩選標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)制定的《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017版)》[12]。病例組男52例，女42例，年齡23.0～88.0(55.0±12.8)歲；將同一時(shí)期在該醫(yī)院體檢中心接受常規(guī)檢查且無(wú)CRC病史或相關(guān)癥狀的94例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男52例，女42，年齡23.0～88.0(55.0±12.7)歲。本研究經(jīng)西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，患者簽署知情同意書。在收集樣本的同時(shí)對(duì)樣本的性別、年齡、病情等臨床資料進(jìn)行信息編號(hào)，并建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)。兩組人群在年齡、性別比例等一般資料方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 兩組一般資料比較

1.2 SNP的選擇

從HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中下載中國(guó)漢族人群CHB 1號(hào)染色體IL-19和IL-20基因區(qū)域的數(shù)據(jù)，利用Haploview軟件進(jìn)行標(biāo)簽位點(diǎn)(Tag SNP)的選擇。本研究對(duì)這2個(gè)基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了標(biāo)簽位點(diǎn)分析，通過(guò)設(shè)定MAF=0.1，r2閾值為0.8，LOD閾值為3.0來(lái)篩選Tag SNP。最后確定了IL-19基因的4個(gè)待測(cè)位點(diǎn)(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)和IL-20的1個(gè)待測(cè)位點(diǎn)(rs1400986)。

1.3 研究方法

本研究采用病例-對(duì)照一一匹配的實(shí)驗(yàn)方案，即每個(gè)病例樣本均有1個(gè)性別、年齡、民族和居住地完全相同的健康對(duì)照樣本。用標(biāo)準(zhǔn)方法從血液?jiǎn)魏思?xì)胞中提取基因組DNA，基于SNP stream檢測(cè)系統(tǒng)遵循多重PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，采用SNP stream超高通量基因分型系統(tǒng)針對(duì)這5個(gè)待測(cè)位點(diǎn)對(duì)CRC患者(n=94)和匹配的健康對(duì)照(n=94)的血液樣本進(jìn)行基因分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用Pearson2goodness-of-fit test檢驗(yàn)考察試驗(yàn)所收集的樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡。兩組間各SNP位點(diǎn)等位基因型頻率和基因型頻率的分布差異采用Pearson Chi-Square test和邏輯回歸進(jìn)行檢驗(yàn)。并通過(guò)SNP stats在線平臺(tái)確定其單倍型。采用條件邏輯回歸分析方法評(píng)價(jià)各位點(diǎn)基因型與CRC及CRC臨床資料的關(guān)聯(lián)性。利用Haploview軟件對(duì)IL-19的2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，并在軟件中生成LD圖，連鎖不平衡的程度由標(biāo)準(zhǔn)化的D′值來(lái)衡量。所選位點(diǎn)的單倍型分析在SNP stats在線平臺(tái)上(http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)進(jìn)行。每次分析均計(jì)算相應(yīng)的P值、比值比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說(shuō)明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

表2 兩組受檢者IL-19/IL-20基因5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果

2.2 IL-19/IL-20基因5個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性分布

表3 兩組IL-19/IL-20基因5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)等位基因型及基因型分析結(jié)果[n(%)]

2.3 IL-19基因4個(gè)SNP位點(diǎn)組成的單倍型頻率分布

采用Haploview4.2軟件對(duì)IL-19基因4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)進(jìn)行連鎖不平衡分析，并用SNP stats在線分析軟件對(duì)這4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果顯示：4個(gè)位點(diǎn)均呈現(xiàn)不同程度的連鎖不平衡關(guān)系，應(yīng)用SNP stats在線分析軟件共構(gòu)建5種單倍型。以TGTG單倍型為參考，結(jié)果顯示：其余4種單倍型在兩組間分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4、圖1)。

表4 兩組IL-19基因4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)單倍型分析結(jié)果

3 討論

IL-19/IL-20作為IL-10家族的成員，其不僅在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；同時(shí)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。Chen等[13]在IL-19與乳腺癌的關(guān)聯(lián)性研究中發(fā)現(xiàn)，IL-19能直接促進(jìn)腫瘤的增殖和遷移，為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供微環(huán)境。與之相比，IL-20參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如肝癌[14]、前列腺癌[15]和口腔癌[16]等；上述研究結(jié)果均顯示，抗IL-20單克隆抗體能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，IL-20有望成為治療多種癌癥的新靶點(diǎn)。以上研究提示IL-19/IL-20基因不僅與炎癥疾病密切相關(guān)，并且極有可能在CRC及其他類型的惡性腫瘤疾病中也發(fā)揮著重要作用。

目前，不少研究揭示炎癥相關(guān)基因多態(tài)性與CRC易感性存在密切的聯(lián)系。Shamoun等[17]發(fā)現(xiàn)IL-32基因多態(tài)性與CRC易感性有關(guān)，其多態(tài)性位點(diǎn)rs28372698與IL-32蛋白在CRC組織中的表達(dá)上調(diào)相關(guān)聯(lián)。有研究[18]通過(guò)遺傳變異闡述了IL-17A基因多態(tài)性與CRC的關(guān)系，該研究發(fā)現(xiàn)IL-17A基因SNP位點(diǎn)rs10484879及該基因的單倍型AGGTG和GAGTG是CRC易感因素。目前，還沒(méi)有IL-19/IL-20基因多態(tài)性與CRC易感的相關(guān)研究，本研究選取IL-19/IL-20作為目的基因，篩選出IL-19基因的4個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)和IL-20基因的1個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)(rs1400986)，但測(cè)定結(jié)果未發(fā)現(xiàn)這5個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群CRC易感性相關(guān)。本研究同時(shí)對(duì)IL-19基因的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了連鎖不平衡分析，用以探討IL-19基因4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)所構(gòu)成的單倍型與CRC易感性的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示供試基因4個(gè)SNP位點(diǎn)所構(gòu)成的單倍型與CRC易感性無(wú)相關(guān)性。

值得注意的是，IL-19基因SNP位點(diǎn)rs2243158的相關(guān)基因型被發(fā)現(xiàn)是兒童患膀胱輸尿管反流的危險(xiǎn)因素[19]，但該位點(diǎn)的次等位基因在斑塊型銀屑病的易感性研究中卻提示有顯著的保護(hù)作用[20]；同樣的情況也出現(xiàn)在IL-20基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1400986上，在研究銀屑病易感性基因多態(tài)性時(shí)，結(jié)果顯示，該位點(diǎn)T等位基因的攜帶者是患銀屑病的保護(hù)因素，但在幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)疾病的研究結(jié)果中卻顯示出該位點(diǎn)多態(tài)性是患JIA的危險(xiǎn)因素[21]。該類研究表明，IL-19/IL-20基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性在不同研究中存在差異，可能是由于疾病類型、遺傳差異性、樣本人群的不同及研究方法的差異導(dǎo)致；其次，也可能是本研究所選的TagSNP位點(diǎn)未能很好的反映其所在區(qū)域的整體情況；亦或者是因?yàn)镃RC的發(fā)病是由多個(gè)基因共同調(diào)控的，IL-19/IL-20基因作為炎癥相關(guān)基因，在調(diào)控CRC發(fā)病的機(jī)制中不占據(jù)主要地位。

綜上所述，為深入探究IL-19/IL-20基因多態(tài)性位點(diǎn)與CRC的相關(guān)性，下一步研究將擴(kuò)大樣本量和樣本收集范圍，并且收集多種族人群，納入更多IL-19/IL-20基因的功能性SNP位點(diǎn)及相關(guān)通路其他基因(STAT、JAK等)的SNP位點(diǎn)，進(jìn)一步完善CRC發(fā)病機(jī)制的研究，為臨床預(yù)防、診斷、治療CRC提供理論依據(jù)。