盧曉聲 吳昊 習(xí)海濤 黃朝霞 呂杰強

[摘要] 目的 探討蛇床子素（OST）對卵巢氧化損傷的保護作用。 方法 體外培養(yǎng)小鼠卵巢組織，用過氧化氫（H2O2）構(gòu)建卵巢組織氧化損傷模型（模型組）;藥物組以20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL 3種不同濃度OST預(yù)處理卵巢組織后再加入H2O2;同時設(shè)對照組。在顯微鏡下計數(shù)卵巢組織內(nèi)卵泡總數(shù)和生長卵泡數(shù)，計算生長卵泡率;化學(xué)發(fā)光法檢測培養(yǎng)液中雌二醇（E2）的水平，WST-1法檢測卵巢組織中SOD活性，TBA法檢測卵巢組織中MDA含量。結(jié)果 與對照組相比，H2O2損傷模型組卵巢生長卵泡數(shù)、卵泡總數(shù)和生長卵泡率均明顯下降，培養(yǎng)第4天的培養(yǎng)液中E2濃度明顯下降，組織內(nèi)SOD活性顯著下降（P<0.01），MDA含量明顯升高（P<0.01）。40 μg/mL和80 μg/mL兩個濃度的OST預(yù)處理后，卵巢組織中的生長卵泡數(shù)、卵泡總數(shù)和生長卵泡率、第4天培養(yǎng)液中的E2濃度、組織內(nèi)SOD活性均較模型組有不同程度的上升，MDA含量下降（P<0.01）。20 μg/mL OST組僅在第4天培養(yǎng)液中的E2濃度上明顯高于模型組，其他相關(guān)指標相對于模型組均無顯著性差異。 結(jié)論 一定濃度的蛇床子素預(yù)處理可減輕H2O2對卵巢組織的氧化應(yīng)激損傷。

[關(guān)鍵詞] 蛇床子素;過氧化氫;氧化損傷;卵巢

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）16-0035-05

Effects of Osthole on oxidative stress in ovarian tissue

LU Xiaosheng? ?WU Hao? ?XI Haitao? ?HUANG Zhaoxia? ?LV Jieqiang

Reproductive Center， the 2nd Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China

[Abstract] Objective To explore the protective effect of Osthole（OST） on ovarian oxidative damage. Methods Mice ovarian tissues were cultured in vitro. Hydrogen peroxide（H2O2） was used to construct oxidative damage models of ovarian tissues（model group）. The drug group was pretreated with different concentrations of OST， 20 μg/mL， 40 μg/mL and 80 μg/mL and H2O2 was added later; the control group was also set. The total number of follicles and the number of growing follicles in the ovarian tissue under a microscope was counted to calculate the rate of growing follicles; chemiluminescence method was applied to detect the level of estradiol（E2） in the culture fluid， WST-1 method to detect SOD activity in the ovarian tissue， and TBA method to detect the MDA content in ovarian tissue. Results Compared with the control group， the number of ovarian growth follicles， the total number of follicles， and the growth follicle rate in the H2O2 injury model group significantly reduced. The concentration of E2 in the culture fluid on the 4th day of culture significantly reduced， the SOD activity in the tissues significantly reduced（P<0.01）， and MDA content increased significantly（P<0.01）. After pretreatment with OST at 40 μg/mL and 80 μg/mL， the number of growing follicle in the ovarian tissue， the total number of follicles and the rate of growing follicles， the concentration of E2 in the culture medium on the 4th day， and the SOD activity in the tissues increased and MDA contents decreased as compared with the model group（P<0.01）. The E2 concentration of in the culture medium in 20 μg/mL OST group was significantly higher than that in the model group on the 4th day， and there were no significant differences in other related indicators compared with the model group. Conclusion Pretreatment with a certain concentration of OST can reduce the oxidative stress damage of ovarian tissue by H2O2.

三種不同濃度的OST組間比較，40 μg/mL和80 μg/mL兩組在生長卵泡數(shù)上均明顯高于20 μg/mL組（P<0.01），而40 μg/mL和80 μg/mL兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異;3個不同濃度的OST組在卵泡總數(shù)上，組間均有統(tǒng)計學(xué)差異，以80 μg/mL組最高，20 μg/mL組最低（P<0.05）;3組之間在生長卵泡率上均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表1、圖1。以上結(jié)果提示20 μg/mL OST組的預(yù)處理不足以對H2O2在卵巢組織中造成的卵泡發(fā)育和構(gòu)成上的損傷產(chǎn)生預(yù)防或緩解的作用，40 μg/mL OST組在卵泡數(shù)量與生長卵泡的比例上，較20 μg/mL OST組已有較大改善，而80 μg/mL OST組的濃度在本研究中對改善卵泡的總數(shù)和生長卵泡的比例均是最佳。

2.2 蛇床子素對體外培養(yǎng)卵巢E2分泌的影響

檢測培養(yǎng)2 d收集的培養(yǎng)液中E2濃度，5組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;提示H2O2在培養(yǎng)的第2天尚未對卵巢的內(nèi)分泌功能產(chǎn)生影響。

培養(yǎng)第4天，模型組在H2O2的作用下，培養(yǎng)液中E2的濃度明顯下降，明顯低于對照組（P<0.01），提示H2O2在培養(yǎng)第4天對卵巢的內(nèi)分泌功能產(chǎn)生破壞;而3個不同濃度的OST組培養(yǎng)第4天的培養(yǎng)液E2濃度顯著高于模型組（P<0.01），且與對照組相比無顯著性差異。提示OST的預(yù)處理，可減緩H2O2對卵巢內(nèi)分泌功能的影響。3個OST組之間比較亦無顯著性差異（P>0.05），提示OST在較低濃度即可緩解H2O2對卵巢內(nèi)分泌功能的影響，見表2、圖2。

2.3 蛇床子素對卵巢組織內(nèi)SOD活性的影響

SOD的活性檢測結(jié)果顯示，模型組在H2O2的作用下，SOD活性較對照組明顯降低（P<0.01）;3個OST組的SOD活性均明顯低于對照組（P<0.01）。20 μg/mL OST組的SOD活性與模型組比較無顯著性差異，40 μg/mL OST組和80 μg/mL OST組的SOD活性較模型組顯著提升（P<0.01）。OST組間比較，40 μg/mL OST組和80 μg/mL OST組的SOD活性均高于20 μg/mL OST組，兩者之間無顯著性差異。見表3、圖3。

以上結(jié)果提示：H2O2對卵巢組織中的SOD活性有明顯影響，20 μg/mL 濃度的OST不足以緩解H2O2對卵巢組織中SOD活性的損傷，40 μg/mL OST組和80 μg/mL OST組兩個濃度對SOD活性有所改善，但也未能恢復(fù)到對照組的水平。

2.4 蛇床子素對卵巢組織內(nèi)MDA 含量的影響

MDA的含量檢測結(jié)果顯示，模型組在H2O2的作用下，MDA含量較對照組明顯升高（P<0.01）;20 μg/mL OST組和40 μg/mL OST組的MDA含量顯著高于對照組（P<0.01）;80 μg/mL OST組的MDA含量則與對照組無顯著性差異（P>0.05）;20 μg/mL OST組的MDA含量與模型組比較無顯著性差異，40 μg/mL OST組的MDA含量較模型組顯著降低（P<0.01），80 μg/mL OST組的MDA含量顯著低于模型組（P<0.01），3個不同濃度的OST組間比較，MDA含量均有顯著性差異，以20 μg/mL OST組最高，80 μg/mL OST組最低（P<0.05）。見表3、圖3。

以上結(jié)果提示：H2O2對卵巢組織中的MDA含量有明顯影響，20 μg/mL 濃度的OST不足以緩解H2O2對卵巢組織中MDA含量的影響，40 μg/mL濃度的OST已開始表現(xiàn)出緩解H2O2損傷的趨勢，而80 μg/mL的OST則可使卵巢組織中的MDA含量恢復(fù)到對照組的水平，呈現(xiàn)了濃度效應(yīng)相關(guān)的趨勢。

3 討論

卵巢儲備功能下降（Diminished ovarian reverse，DOR）主要表現(xiàn)為卵子數(shù)量的減少和質(zhì)量的減退，患者妊娠率低，行輔助生殖技術(shù)的治療效果也較差[7]，給患者及其家庭造成身體上的痛苦和經(jīng)濟上的負擔。如何減緩卵巢功能衰退的速度，保護卵巢功能，提高生活質(zhì)量，是目前國內(nèi)外生殖醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題。

在祖國的傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，沒有DOR這一診斷，依據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于“血枯”、“經(jīng)水早斷”等范疇[8]。中藥蛇床子在治療女性腎虛血枯、宮冷不孕中有獨特的功效。蛇床子是為傘形科植物蛇床的干燥成熟果實[9]。《本草綱目》中記載蛇床子“乃右腎命門、少陽，三焦氣分之藥;神農(nóng)列之為上品，不獨補助男子，而又有益婦人”、“暖丈夫陽氣，助女人陰氣”;《別錄》中描述蛇床子“溫中下氣，令婦人臟熱，男子陰強，令人有子”。從蛇床子中提取的OST，是蛇床子中的主要功能成分，又名甲氧基歐芹酚，具有顯著的抗炎[10]、抗腫瘤[11]和抗氧化[12]等作用，臨床上廣泛用于男科、婦科、皮膚科疾病等的治療。

本研究利用OST對H2O2引起的卵巢組織氧化損傷模型進行干預(yù)，研究OST在卵巢組織抗氧化應(yīng)激中的治療作用并初步探索了其機制。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2對卵巢組織造成了氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致小鼠卵巢內(nèi)的卵泡總數(shù)、生長卵泡數(shù)、生長卵泡率均明顯減少，培養(yǎng)第4天分泌的E2水平降低。在使用OST預(yù)處理后，40 μg/mL OST與80 μg/mL兩個濃度的OST可使H2O2作用下卵巢內(nèi)的卵泡總數(shù)、生長卵泡數(shù)、生長卵泡率較模型組明顯提高。OST預(yù)處理的3組，對培養(yǎng)2天的卵巢組織分泌的E2水平?jīng)]有改善，但在培養(yǎng)第4天，觀察到有OST預(yù)處理的卵巢組織分泌的E2水平比模型組有明顯的改善;在抗氧化應(yīng)激能力的檢測中，40 μg/mL OST組與80 μg/mL OST組兩個濃度的OST預(yù)處理可減輕H2O2引起的卵巢組織氧化損傷，表現(xiàn)為SOD水平的回升和MDA含量的下降。以上結(jié)果提示，一定濃度的OST預(yù)處理可減輕H2O2引起的卵巢組織損傷，其機制可能與氧化應(yīng)激通路有關(guān)。

大量研究表明，氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致卵巢衰老的重要原因，DOR的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[13]。卵巢組織內(nèi)自由基生成持續(xù)增多和清除能力不斷下降，導(dǎo)致氧化應(yīng)激壓力持續(xù)上升，進而誘發(fā)一系列的衰老性改變[14]：影響卵母細胞的發(fā)育、成熟、卵泡閉鎖，增加竇卵泡的凋亡，影響卵母細胞的質(zhì)量、受精和胚胎著床，最終降低女性的生育力[15]。而應(yīng)用抗氧化劑，則可改善卵母細胞數(shù)目及質(zhì)量降低的現(xiàn)象，降低胚胎非整倍體的發(fā)生率[2]。本研究測定離體培養(yǎng)的小鼠卵巢組織內(nèi)的兩種氧化應(yīng)激重要相關(guān)因子SOD和MDA，以評估OST在卵巢組織中的抗氧化應(yīng)激作用，并初探其改善卵巢儲備功能的可能機制。

SOD是在生物體內(nèi)廣泛存在的一種抗氧化物歧化酶，其能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用[16]。在卵巢衰老過程中，SOD的表達與活性均呈現(xiàn)不同程度的下降[17-18]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷使卵巢組織內(nèi)的SOD活性顯著降低，40 μg/mL OST與80 μg/mL OST兩個濃度均能明顯改善H2O2對SOD活性的損傷。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，可反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，是評估氧化應(yīng)激損傷的一個重要指標[19]。在男科研究中，蛇床子素可明顯降低受損精子中MDA的水平[20]。在本研究中，H2O2導(dǎo)致的氧化損傷使卵巢組織內(nèi)的MDA顯著升高。而在不同濃度OST處理后，40 μg/mL OST組與80 μg/mL OST組的MDA含量較模型組顯著下降，并與OST劑量呈一定的相關(guān)性。20 μg/mL的OST在本研究中未能顯示有效的抗H2O2氧化應(yīng)激損傷作用。

綜上，一定濃度的蛇床子素在卵巢組織中具有緩解H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷的作用，在氧化應(yīng)激壓力下，保護卵巢組織的功能，增強卵巢組織的抗氧化能力，OST在卵巢功能保護中的作用值得進一步研究。

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（收稿日期：2019-11-29）