武紀(jì)天，程 浩，殷 實(shí)，李 楠*

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.江蘇瑞禾生物科技有限公司，江蘇蘇州 215000）

丹參（Salvia miltiorrhiza）主產(chǎn)于四川、山西、河北、江蘇、安徽等地，其根部含有脂溶性和水溶性兩大類化學(xué)物質(zhì)，其中水溶性是以丹參素為基本結(jié)構(gòu)的酚酸類化合物，多數(shù)命名為丹酚酸；脂溶性為丹參酮類，主要是丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB等[1]。丹參的藥用價(jià)值很高，在臨床上主要是活化瘀血，常用于心腦血管疾病、糖尿病、腎病、小兒肺炎等疾病[2-5]；丹參也與其他中藥配伍應(yīng)用于多種疾病的治療與保健康復(fù)，如肝損傷[6]、黃褐斑[7]、體疲勞[8]、失眠[9]、痤瘡[10]和骨質(zhì)疏松[11]等。

謝興亮等[12]采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究丹參酒制的炮制工藝條件。STRYJEWSKI M E等[13]以丹參酮ⅡA含量為關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)酒丹參的加酒量、加熱溫度和時(shí)間三個(gè)影響炮制結(jié)果的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選出了酒丹參的最佳炮制條件：加酒量5%、加熱溫度60 ℃、加熱時(shí)間10 min。宋平順等[14]利用正交試驗(yàn)以丹參中的丹酚酸B為指標(biāo)得到最佳提取工藝：10%的黃酒、加20%的酒量、80 ℃炒制4 min。

目前丹參的主要用于茶飲、食療和醫(yī)療，但丹參用于釀酒行業(yè)生產(chǎn)丹參保健酒還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以鮮丹參為原料，不僅可以利用丹參中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及有效成分，提高丹參的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且還可以開發(fā)風(fēng)味獨(dú)特的保健飲品，實(shí)現(xiàn)丹參的多樣化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)我國(guó)丹森產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展具有重要意義。該實(shí)驗(yàn)利用丹參與赤砂糖為原料，以總黃酮含量、總酚酸含量為主要指標(biāo)，同時(shí)以酒精含量作為輔助考察指標(biāo)，確定丹參保健酒的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤砂糖：南寧糖業(yè)股份有限公司；丹參：江蘇瑞禾生物科技有限公司；超級(jí)釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、亞硫酸氫鈉、磷酸、葡萄糖、亞硝酸鈉、沒食子酸、蘆丁、硝酸鋁、十二烷基硫酸鈉、鐵氰化鉀（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TW12恒溫水浴鍋：優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；SN510C全自動(dòng)高壓滅菌鍋：重慶雅瑪拓科技有限公司；UVmini-1240紫外-可見光分光光度計(jì)：日本島津公司；JJ-2組織搗碎機(jī)：金壇市城東新瑞儀器廠；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市醫(yī)療器械有限公司；雷磁PHS-3CpH計(jì)：上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；PL-303電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酒精計(jì)：余姚儀表二廠有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 丹參保健酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：將丹參清洗破碎，按照一定的添加量加入到調(diào)好的發(fā)酵糖液中，放入組織搗碎機(jī)打碎，把丹參與發(fā)酵糖液的混合物分裝到容量為250 mL的三角瓶中，裝液量為150 mL，用磷酸調(diào)pH值后滅菌，接種一定量的干酵母并在一定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵6 d[15]，發(fā)酵結(jié)束后，先后用300目、500目的尼龍紗布粗過濾后做澄清處理，得到丹參保健酒。

1.3.2 丹參保健酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在控制其他變量不變的情況下，分別考察丹參添加量（0、5%、10%、15%、20%）、酵母接種量（0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%）、發(fā)酵溫度（16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃）、發(fā)酵初始pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、發(fā)酵初始總糖（200 g/L、225 g/L、250 g/L、275 g/L、300 g/L）對(duì)丹參保健酒酒精含量、總黃酮含量以及總多酚酸含量變化的影響，并確定最佳的工藝參數(shù)。

1.3.3 丹參保健酒發(fā)酵條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始糖含量（A）、發(fā)酵pH（B）、發(fā)酵溫度（C）為正交試驗(yàn)的影響因素，每因素選擇3水平，以總黃酮含量和酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（33）正交設(shè)計(jì)確定丹參保健酒的最佳發(fā)酵條件參數(shù)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 丹參保健酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of Saliva miltiorrhiza health wine

1.3.4 總糖含量的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)還原糖[16]。得到葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.347 5x-0.028 5（R2=0.999 4），表明二者線性關(guān)系良好。

1.3.5 酒精度的測(cè)定

采用蒸餾法測(cè)定發(fā)酵液酒精度[17-18]。

1.3.6 總酚酸含量的測(cè)定

參考陳麗珍等[19]的方法并稍作修改。以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確制22.4 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL、1.5 mL置于25 mL的具塞比色管中，用無水乙醇定容至5 mL，加入2 mL的0.3%十二烷基硫酸鈉溶液、0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀（1∶1）混合溶液1 mL混勻，放置于暗處反應(yīng)5 min，最后用0.1 mol/mL HCl定容至刻度，混勻，在暗處放置20 min。以顯色劑為空白，在720 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。測(cè)定酒樣中的總酚酸含量時(shí)，需先將醪液進(jìn)行4 000 r/min離心20 min，測(cè)定上清液中的含量測(cè)定。

最終得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.034 2x+0.046 7（R2=0.999 7），表明沒食子酸含量在0.22～1.12 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.3.7 總黃酮含量的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[20-21]，并稍有改動(dòng)。根據(jù)弱堿環(huán)境下，黃酮類分子中的酚羥基與鋁鹽生成絡(luò)合物顯紅橙色在510 nm處有最大吸光度的原理。準(zhǔn)確稱量烘干至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.5 mg用醫(yī)用乙醇定容至100 mL。精確吸取不同體積（0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL）此溶液于25 mL試管中，用醫(yī)用乙醇補(bǔ)足至10 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.8 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.8 mL，搖勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10 mL，定容搖勻，靜置15 min，測(cè)定吸光度值（OD510nm值）。將樣品稀釋1倍，按照上述方法測(cè)定總黃酮含量。得到蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.484 5x-0.023（R2=0.999 5），表明蘆丁含量在4.2～21.0 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參保健酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同丹參添加量對(duì)丹參保健酒酒精度、總黃酮及總酚酸含量的影響

圖1 丹參添加量對(duì)丹參保健酒酒精度的影響Fig.1 Effect of Saliva miltiorrhiza addition on the alcohol content of Saliva miltiorrhiza health wine

圖2 丹參添加量對(duì)總黃酮和總酚酸含量的影響Fig.2 Effect of Saliva miltiorrhiza addition on the total flavonoids and total phenolic acids contents

由圖1可知，丹參保健酒酒精度隨丹參添加量的增多逐漸下降的趨勢(shì)，且下降的幅度越來越大，結(jié)合圖2總黃酮與總酚酸含量的與丹參含量的關(guān)系，選取丹參添加量為10%。此時(shí)酒精含量達(dá)8.6%vol，總黃酮與總多酚酸含量分別為348 mg/L、198 mg/L。

2.1.2 不同酵母接種量對(duì)丹參保健酒酒精度、總黃酮及總酚酸含量的影響

圖3 酵母接種量對(duì)丹參保健酒酒精度的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the alcohol content of Saliva miltiorrhiza health wine

圖4 酵母接種量對(duì)總黃酮和總酚酸含量的影響Fig.4 Effect of yeast inoculum on the total flavonoids and total phenolic acids contents

丹參保健酒在發(fā)酵過程中，酵母菌種添加量的多少直接影響到酵母的倍增時(shí)間。由圖3、圖4可以看出，隨著酵母接種量的不斷增大，丹參保健酒的酒精含量與總黃酮、總酚酸含量都呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)酵母接種量為0.01%時(shí)，發(fā)酵啟動(dòng)慢，產(chǎn)生的酒精量少，所以溶解在酒中的黃酮量也少；接種量為0.03%時(shí)，酵母基數(shù)大，新增酵母細(xì)胞數(shù)量少，容易老化，酒精產(chǎn)量低，酒中的總黃酮含量也較低。與陳玲在研究枸杞果酒發(fā)酵過程中，酵母接種量對(duì)酒中黃酮含量的影響的結(jié)論相一致[22]。當(dāng)酵母接種量為0.015%時(shí)，發(fā)酵較快，酒精產(chǎn)量也較高，總黃酮含量也達(dá)到了最大值。而總酚酸與總黃酮呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，可能與黃酮酚酸極性相似有關(guān)。因此，選擇酵母接種量0.015%為宜，此時(shí)的總黃酮和總酚酸的含量分別是418 mg/L、202 mg/L。

2.1.3 不同初初糖度對(duì)丹參保健酒酒精度、總黃酮及總酚酸含量的影響

圖5 初始糖度對(duì)丹參保健酒酒精度的影響Fig.5 Effect of initial sugar content on the alcohol content of Saliva miltiorrhiza health wine

圖6 初始糖度對(duì)總黃酮和總酚酸含量的影響Fig.6 Effect of initial sugar content on the total flavonoids and total phenolic acids contents

由于丹參含糖量較低，發(fā)酵需要添加一定量的蔗糖才能達(dá)到所需酒度，含糖量越高，發(fā)酵產(chǎn)酒精越高，而過高的糖濃度與酒精含量都會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的滲透壓增大，不利于酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。由圖5、6可知，不同的糖度對(duì)酒精度與活性物質(zhì)的含量影響較大。當(dāng)初始總糖為200 g/L時(shí)，糖度較低，酵母的生長(zhǎng)得不到足夠碳源而導(dǎo)致酒精度低，發(fā)酵醪液中的活性物質(zhì)含量也低；隨著總糖的增加，酒精度與黃酮、酚酸含量雖然一直在增加但幅度有所降低。當(dāng)初初糖度達(dá)到300 g/L時(shí)，酵母的生長(zhǎng)和代謝受到抑制，造成糖的利用率低。因此，發(fā)酵過程中調(diào)整初始糖度為275 g/L為宜。

2.1.4 發(fā)酵液pH值對(duì)丹參保健酒酒精度、總黃酮及總酚酸含量的影響

圖7 發(fā)酵液pH值對(duì)丹參保健酒酒精度的影響Fig.7 Effect of fermentation liquid pH on the alcohol content of Saliva miltiorrhiza health wine

圖8 發(fā)酵液pH值對(duì)總黃酮和總酚酸含量的影響Fig.8 Effect of fermentation liquid pH on the total flavonoids and total phenolic acids contents

由圖7、8可知，當(dāng)發(fā)酵液pH值為3～5時(shí)，酒精含量與總黃酮、總酚酸含量表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即先上升后下降。當(dāng)pH值為3時(shí)，酵母菌的生長(zhǎng)和代謝受到抑制，酒精產(chǎn)量較低，不利用黃酮與酚酸的溶出；當(dāng)pH值為4時(shí)，適合酵母菌的生長(zhǎng)，在提高了酒精含量的同時(shí)也增加了黃酮和酚酸的含量；但pH值過高時(shí)，丹參酒發(fā)酵液易受雜菌污染，而導(dǎo)致酒精含量降低。李楠等[23]發(fā)現(xiàn)，在山楂果酒的發(fā)酵過程中，pH值對(duì)酒中總黃酮含量也表現(xiàn)出相同的影響規(guī)律。因此選擇發(fā)酵液pH值4為宜。

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)丹參保健酒酒精度、總黃酮及總酚酸含量的影響

由圖9、10可知，發(fā)酵溫度在16～32 ℃范圍內(nèi)，丹參酒的酒精度與總黃酮和總酚酸含量都隨著溫度的升高而逐漸上升，發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，此時(shí)酵母適宜繁殖，酒精產(chǎn)量高有利于丹參保健酒中黃酮與酚酸的提取率，并保持穩(wěn)定性[24]。當(dāng)溫度過低時(shí)，酵母生長(zhǎng)和代謝速度緩慢，短期內(nèi)酒精含量低，使丹參保健酒中的活性物質(zhì)提取緩慢；溫度過高發(fā)酵速度快，由于酵母衰老化加快，發(fā)酵提前終止，導(dǎo)致酒精度低同時(shí)影響黃酮和酚酸的溶出。因此，選擇發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)丹參保健酒酒精度的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on the alcohol content of Saliva miltiorrhiza health wine

圖10 發(fā)酵溫度對(duì)總黃酮和總酚酸含量的影響Fig.10 Effect of fermentation temperature on the total flavonoids and total phenolic acids contents

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化丹參保健酒的釀造工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)，以總黃酮與酒精度作為考察指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3和表4。

由表2可知，3個(gè)因素對(duì)丹參保健酒總黃酮含量的影響結(jié)果排序?yàn)锳＞C＞B，即初始糖度＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵液pH值，從K值大小可知，以總黃酮為評(píng)價(jià)指標(biāo)的最佳工藝組合為A2B2C2，即初始糖度為275 g/L、溫度28 ℃、發(fā)酵液pH值為4；3個(gè)因素對(duì)丹參保健酒酒精度影響結(jié)果排序?yàn)锳＞C＞B，與總黃酮含量影響一致，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)的的最佳工藝組合為A2B2C2，即發(fā)酵液初始糖度為275 g/L、溫度28 ℃、發(fā)酵液pH值為4，與總黃酮含量影響一致。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到丹參保健酒酒精度為12.6%vol，總黃酮含量為506 mg/L、總酚酸含量為354 mg/L。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of Saliva miltiorrhiza health wine

表3 基于總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments based on total flavonoids

表4 基于酒精度的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments based on alcohol content

由表3和表4可知，在選定試驗(yàn)條件下，初總糖對(duì)丹參保健酒酒精度與總黃酮含量影響顯著（P＜0.05），而發(fā)酵溫度和發(fā)酵液的pH值對(duì)丹參保健酒酒精度與總黃酮含量的影響均不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以丹參保健酒中的總黃酮與總酚酸含量作為指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定發(fā)酵的最佳條件為丹參添加量10%、酵母接種量為0.015%、發(fā)酵液初總糖為275 g/L、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵液pH值為4，在此優(yōu)化條件下，此時(shí)的丹參保健酒酒精度為12.6%vol，總黃酮含量為506 mg/L、總酚酸含量為354 mg/L。