周玉蘭 朱文超 石冰 賈仲林

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心

四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院唇腭裂外科，成都 610041

唇腭裂（cleft lip with or without cleft palate，CL/P）是人類最常見的顱面部先天性畸形之一，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示全世界每700個(gè)新生兒中就有一個(gè)唇腭裂患者[1]。在中國，其發(fā)病率約為1.67‰[2]。根據(jù)有無其他全身性先天畸形的伴發(fā)，可以將其分為綜合征型唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P）和非綜合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）[3]。SCL/P表型較NSCL/P復(fù)雜，大多符合孟德爾單基因遺傳模式；約70%的CL/P為NSCL/P，患者無身體其他部位的畸形，是由多基因突變、有害環(huán)境因素及其相互作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病[3]。只有當(dāng)多種危險(xiǎn)因素的共同作用達(dá)到閾值時(shí)，NSCL/P才會發(fā)生。NSCL/P的易感基因和區(qū)域逐漸被發(fā)現(xiàn)，候選基因不斷增多。在目前已發(fā)現(xiàn)的眾多候選基因和信號傳遞通路中，研究較多的有干擾素調(diào)節(jié)因子6（interferon regulatory factor-6，IRF-6）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-3、同源異性盒基因1（Msh homeobox1，MSX1）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（forkhead box E1，F(xiàn)OX-E1）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）4、 v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B（v-maf musculoaponeurotic fi bro sarcoma oncogene homolog B，MAFB）、鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）533、ABCA4（ATP binding cassette subfamily A member 4）、VAX1（ventral anterior homeobox 1）、SPRY2（sprouty RTK signaling antagonist 2）等基因[4-13]。

血小板源性生長因子C（platelet-derived growth factor-C，PDGF-C）屬于血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）家族成員，通過PDGF受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGF-R）-α和α二聚體信號通路在胚胎和出生后發(fā)育過程中參與多種細(xì)胞功能。研究[14]表明，rs28999109位點(diǎn)位于4q32，即PDGF-C基因的調(diào)控區(qū)域，與NSCL/P發(fā)生密切相關(guān)。PDGF-C基因敲除小鼠模型出現(xiàn)了腭裂表型，表明PDGF-C基因在腭形成中具有作用[15]。Wu等[16]納入214個(gè)唇腭裂患者—父母三人家系，研究發(fā)現(xiàn)24例患者有CL/P陽性家族史，TDT分析表明PDGF-C的rs17035464位點(diǎn)的A等位基因在母系遺傳過剩，而父系遺傳不足，提出PDGF-C基因與NSCL/P之間存在關(guān)聯(lián)。目前尚未見PDGF-C基因與中國西部漢族人群NSCL/P發(fā)生的相關(guān)性報(bào)道。

另外，環(huán)境因素在NSCL/P發(fā)生中占據(jù)重要地位這一理論也得到了大量研究的證實(shí)，但其與遺傳因素在NSCL/P發(fā)生過程中是否存在交互作用的研究較少。Zeng等[3]納入294個(gè)NSCL/P家系及183個(gè)對照家系，研究發(fā)現(xiàn)妊娠前3個(gè)月吸煙環(huán)境、感冒史、飲酒史是患NSCL/P的危險(xiǎn)因素，而母親補(bǔ)充鈣是一個(gè)保護(hù)因素，并未發(fā)現(xiàn)EYA1基因與環(huán)境因素存在相互作用的證據(jù)。研究[17]表明，妊娠前3個(gè)月母體暴露于農(nóng)毒素環(huán)境與GREM1基因rs16969816位點(diǎn)之間有顯著的交互作用；孩子攜帶A等位基因和母親孕期暴露于農(nóng)毒素環(huán)境，與未暴露者相比，其患NSCL/P風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。學(xué)者[18]提出，孕婦被動吸煙是NSCL/P的危險(xiǎn)因素；孕婦補(bǔ)充多種維生素是一個(gè)保護(hù)因素；BMP4基因T538C位點(diǎn)與母體被動吸煙具有協(xié)同效應(yīng)，為NSCL/P由遺傳和環(huán)境因素共同決定提供了新的證據(jù)。孕期適當(dāng)?shù)娜~酸攝入、適當(dāng)?shù)纳挲g和文化程度高是NSCL/P的保護(hù)因素，而家族史、流產(chǎn)史和孕期的藥物濫用是NSCL/P的有害因素[19]。但是，目前國內(nèi)外學(xué)者對PDGF-C基因與環(huán)境暴露因素之間是否存在交互作用尚無研究。

由于NSCL/P遺傳異質(zhì)性的存在，本研究從人類基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中選取PDGF-C基因雜合度大于20%的2個(gè)靶向單核苷酸多態(tài)性（single nucleo tide polymorphisms，SNPs）位點(diǎn)（rs4691383和rs7667857）進(jìn)行遺傳統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討中國西部人群中PDGF-C基因與NSCL/P發(fā)生的相關(guān)性；同時(shí)，本研究還對患者母親孕期情況進(jìn)行調(diào)查，對PDGF-C基因的2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型和環(huán)境暴露因素之間是否存在交互作用進(jìn)行條件Logistic回歸分析，探討在NSCL/P發(fā)生中基因—環(huán)境暴露因素是否存在相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

收集2011年3月—2018年4月于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院唇腭裂外科住院手術(shù)治療的268個(gè)NSCL/P病例—父母核心三人家系（表1）。所有研究對象均屬于中國西部地區(qū)漢族人群，且符合先天性NSCL/P診斷標(biāo)準(zhǔn)，不合并其他先天畸形或先天性疾病。簽訂書面知情同意書后，采集患者及其父母外周靜脈血5～6 mL。另外再同期收集納入研究的268例患者的母親填寫《唇腭裂流行病學(xué)研究問卷表》，舍棄無效資料，將有效資料數(shù)據(jù)錄入資料庫，對PDGF-C基因的SNPs位點(diǎn)基因型和環(huán)境暴露因素（孕婦吸煙/被動吸煙、葉酸補(bǔ)充史、環(huán)境有害氣體長期吸入史）之間是否存在交互作用進(jìn)行條件Logistic回歸分析。本研究及研究過程中所需操作均獲得倫理委員會的批準(zhǔn)。

表1 NSCL/P分類情況表Tab 1 Classif i cation of NSCL/P

1.2 SNPs位點(diǎn)的選擇和基因分型

PDGF-C基因位于染色體4q32區(qū)域，在International HapMap Project數(shù)據(jù)庫中查詢PDGF-C基因的CHB（Han Chinese in Beijing，China）部分典型SNPs圖，選擇位于PDGF-C基因結(jié)構(gòu)中分布較遠(yuǎn)且雜合度大于20%的2個(gè)靶向SNPs位點(diǎn)（表2）。PDGF-C基因分型采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）—限制性酶切片段長度多態(tài)法和直接測序法，均委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。所選SNPs位點(diǎn)信息及PCR引物序列見表3。

表2 PDGF-C基因選用的SNPs情況Tab 2 Selected SNPs of PDGF-C gene

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20軟件對患者及雙親rs4691383位點(diǎn)和rs7667857位點(diǎn)進(jìn)行哈溫平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium）檢驗(yàn)。采用Haploview軟件對rs4691383位點(diǎn)和rs7667857位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡 （linkage disequilibrium，LD）分析，并采用Family Based Association Test（FBAT）1.7.2軟件對父母至少一方為雜合子的家庭進(jìn)行傳遞不平衡檢驗(yàn)（transmission disequilibrium test，TDT）和單倍型關(guān)聯(lián)分析（haplotype association），檢測等位基因在父母和患者之間的傳遞情況。對PDGF-C基因和環(huán)境暴露因素之間是否存在交互作用進(jìn)行條件Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 哈溫平衡檢驗(yàn)

rs4691383位點(diǎn)和rs7667857位點(diǎn)雙親的基因型頻率測量值和期望值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），符合哈溫平衡，具有群體代表性。

表3 PDGF-C SNPs位點(diǎn)PCR引物序列、溫度及產(chǎn)物片段長度Tab 3 PCR primers, temperature and product fragment length of the SNPs at PDGF-C

2.2 LD分析

利用FBAT軟件進(jìn)行LD分析，結(jié)果表明：D'=0.05，說明rs4691383與rs7667857位點(diǎn)間發(fā)生過重組；r2=0.012，說明rs4691383與rs7667857位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 TDT分析

將雙親中含有雜合子的家系進(jìn)行TDT分析（表4），在NSCLP、NSCPO、NSCL/P組內(nèi)，rs4691383和rs7667857兩個(gè)位點(diǎn)傳遞的A等位基因頻率與未傳遞的A等位基因頻率均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），傳遞與未傳遞的G等位基因頻率也均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

相對危險(xiǎn)度分析顯示：在NSCL/P的發(fā)生過程中，rs4691383位點(diǎn)的G等位基因存在傳遞不足，反之，A等位基因存在過度傳遞；rs7667857位點(diǎn)的G等位基 因存在過度傳遞，反之，A等位基因存在傳遞不足。

表4 PDGF-C基因rs4691383和rs4691383位點(diǎn)TDT分析Tab 4 Allelic TDT results for rs4691383 and rs4691383 SNPs in PDGF-C

2.4 單倍型關(guān)聯(lián)分析

rs4691383和rs7667858位點(diǎn)共可構(gòu)建4種單倍型，利用FBAT軟件關(guān)聯(lián)分析各單倍型與NSCL/P的相關(guān)性（表5）。其中A-A（P＜0.05）、A-G（P＜0.01）和G-A（P＜0.01）3種單倍型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在所有rs4691383參與構(gòu)成的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單倍型中，均包含rs4691383位點(diǎn)的A等位基因。

2.5 孕早期環(huán)境危險(xiǎn)因素的條件Logistic回歸分析

孕婦吸煙/被動吸煙、葉酸補(bǔ)充史、環(huán)境有害氣體長期吸入史和PDGF-C基因型的條件Logistic回歸分析結(jié)果見表6～8。結(jié)果表明，孕婦吸煙/被動吸煙史、葉酸補(bǔ)充史、環(huán)境有害氣體長期吸入史這3個(gè)環(huán)境暴露因素與PDGF-C基因的SNPs位點(diǎn)基因型之間均不存在交互作用。

表5 SNPs的單倍型分析Tab 5 Haplotype analyze of SNPs

表6 吸煙/被動吸煙和PDGF-C基因型條件Logistic回歸分析Tab 6 The results of conditional Logistic regression analysis between smoking/passive smoking and the PDGF-C genotype

3 討論

NSCL/P具有顯著的遺傳異質(zhì)性，由易感基因與孕期環(huán)境因素聯(lián)合致病。PDGF-C基因（157.89～158.12 Mb）位于4q32.1，屬于PDGF的家族成員之一[20]。Choi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，位于PDGF-C調(diào)節(jié)區(qū)域的rs28999109位點(diǎn)的T等位基因與中國人群的CL/P發(fā)生之間存在正相關(guān)，揭示了PDGF-C基因與NSCL/P發(fā)病密切相關(guān)。SHH、PDGF、WINT等基因介導(dǎo)的信號通路中斷可導(dǎo)致顱面部發(fā)育異常。Hoch等[21]研究表明，PDGF基因的信號通路在腭板吸引神經(jīng)嵴細(xì)胞進(jìn)入形成腭的過程中起重要作用，提示PDGF-C基因敲除小鼠出現(xiàn)腭部發(fā)育不良是由于神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移進(jìn)入上腭板架障礙所致。在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中microRNA Mirn140在腭發(fā)育過程中負(fù)調(diào)控PDGF信號通路，為PDGF基因如何導(dǎo)致腭裂形成提供了一種機(jī)制，也揭示了PDGF-C基因可作為NSCL/P的候選基因[22]。條件性PDGF-C基因敲除小鼠研究[23]表明，PDGF-C基因表達(dá)的缺失會導(dǎo)致胚胎缺陷，包括腭部融合障礙，因此提出PDGF-C基因在腭發(fā)育中的作用突出。研究[15]表明，PDGF-A和PDGF-C信號均通過PDGFRA調(diào)控顱面結(jié)構(gòu)、神經(jīng)管和中胚層器官的發(fā)育，其異常會出現(xiàn)口面裂、脊柱裂、腎皮質(zhì)間質(zhì)缺乏以及骨骼血管缺陷等畸形，更加證實(shí)了PDGF-C基因與NSCL/P發(fā)生密切相關(guān)。

表7 葉酸補(bǔ)充史和PDGF-C基因型條件Logistic回歸分析Tab 7 The results of conditional Logistic regression analysis between the history of folic acid supplementation and the PDGF-C genotype

表8 環(huán)境有害氣體長期吸入史和PDGF-C基因型條件Logistic回歸分析Tab 8 The results of conditional Logistic regression analysis between the long history of inhalation of environmental harm ful gases and the PDGF-C genotype

本研究意在探索PDGF-C基因SNPs位點(diǎn)與中國西部漢族人群NSCL/P發(fā)生的相關(guān)性。在International HapMap Project數(shù)據(jù)庫中選擇位于PDGF-C基因結(jié)構(gòu)中分布較遠(yuǎn)的2個(gè)SNPs位點(diǎn)（rs4691383位點(diǎn)和rs7667857），且雜合度大于20%（rs4691383為0.463，rs7667857為0.273），優(yōu)于其他SNPs位點(diǎn)，十分具有代表性。本研究患者雙親的基因型頻率分布符合哈溫平衡，具有群體代表性。TDT結(jié)果表明，rs4691383位點(diǎn)A等位基因存在過度傳遞，是NSCL/P發(fā)生的危險(xiǎn)因素；rs7667857位點(diǎn)G等位基因過度傳遞，是NSCL/P發(fā)生的危險(xiǎn)因素；A等位基因傳遞不足，是保護(hù)性因素。本研究證實(shí)PDGF-C基因rs4691383和rs7667857位點(diǎn)與中國西部人群NSCL/P發(fā)生具有相關(guān)性。LD分析結(jié)果顯示，D'值＜1，說明2個(gè)SNPs位點(diǎn)間發(fā)生過重組，存在一定程度的連鎖；r2＜1，說明rs4691383與rs7667857位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過FBAT軟件對2個(gè)靶向SNPs位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，發(fā)現(xiàn)rs4691383位點(diǎn)的A等位基因所構(gòu)成的單倍型與NSCL/P有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

遺傳因素和環(huán)境因素在NSCL/P的發(fā)生過程中均發(fā)揮著重要作用。本研究對孕期環(huán)境因素（有/無吸煙或被動吸煙，有/無葉酸服用，有/無環(huán)境有害氣體長期吸入）在NSCL/P發(fā)生中與PDGF-C基因型的相互作用進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。但未發(fā)現(xiàn)在NSCL/P的發(fā)生過程中PDGF-C基因的2個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型與3種環(huán)境暴露因素之間存在交互作用。目前國內(nèi)外對環(huán)境因素與NSCL/P發(fā)病的相關(guān)性有一定研究。Dien等[24]研究表明，孕期母親被動吸煙與口面裂發(fā)生無關(guān)，飲用含咖啡因飲料的母親會增加唇裂患兒的風(fēng)險(xiǎn)，葉酸或多種維生素的充分補(bǔ)充可預(yù)防口面裂的發(fā)生。Jia等[25]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充維生素和葉酸可降低CL/P的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；母親被動吸煙可增加CL/P的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；加強(qiáng)產(chǎn)前護(hù)理，減少環(huán)境暴露，可降低CL/P的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Yin等[26]收集了1 710例唇腭裂患者和956例健康新生兒的《唇腭裂患者流行病學(xué)調(diào)查》，研究證明孕期母親吸煙、母親被動吸煙及母親飲酒與唇腭裂發(fā)生密切相關(guān)，分別比對照組患病風(fēng)險(xiǎn)增加了8.776、2.780和2.985倍。另外，本研究納入的“有或無環(huán)境有害氣體長期吸入”這一因素，是指母親生活或工作環(huán)境中經(jīng)常接觸脂肪族酸或醛、乙醇醚、三氯乙烯、殺蟲劑等有機(jī)溶劑或其他污染，其與NSCL/P的相關(guān)性也有類似的研究。Zhao等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠前3個(gè)月，母親暴露于空氣污染（O3，CO，SO2，PM2.5和PM10）會增加子代口面裂的風(fēng)險(xiǎn)。Chevrier[28]研究表明，母親孕期職業(yè)接觸有機(jī)溶劑混合物，會增加后代發(fā)生NSCL/P的風(fēng)險(xiǎn)。Aschengrau等[29]研究表明，在妊娠前3個(gè)月接觸四氯乙烯污染的飲用水（＞40 μg·L-1）的母親生下患有脊柱裂、唇裂、腭裂和尿道下裂等畸形嬰兒的風(fēng)險(xiǎn)增加。以上研究說明，環(huán)境因素在NSCL/P發(fā)生中作用顯著。但本研究尚未發(fā)現(xiàn)在NSCL/P的發(fā)生過程中PDGF-C基因的兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型與3種環(huán)境暴露因素之間存在交互作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)中國西部人群PDGF-C基因單核苷酸多態(tài)性與NSCL/P的發(fā)生存在相關(guān)性，這在一定程度上可以完善中國西部人群唇腭裂發(fā)生遺傳數(shù)據(jù)庫。雖然環(huán)境暴露因素與PDGF-C基因的2個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型之間的交互作用尚未得到證實(shí)，但環(huán)境暴露因素單獨(dú)對NSCL/P發(fā)生的作用仍不容忽視。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。