劉明科, 閆芳芳, 齊禹哲, 黃 巖, 閆雪梨, 錢逸彬, 李茂業(yè),*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點(diǎn)實驗室, 合肥 230036; 2. 四川省煙草公司攀枝花市公司, 四川攀枝花 617026)

桃蚜Myzuspersicae又名煙蚜，屬半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，是世界上分布最廣泛的蚜蟲之一，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以取食800多種植物(van Emden and Harrington, 2017)。其主要為害是通過刺吸植株汁液導(dǎo)致葉片卷曲萎蔫，分泌蜜露誘發(fā)煤污病以及傳播各種植物病毒造成植株矮縮，葉片花葉、畸形(Novyetal., 2002; Loweryetal., 2015)。目前對蚜蟲的防治主要以化學(xué)防治為主，但是隨著蚜蟲對常用殺蟲劑的抗藥性不斷增強(qiáng)(Feng and Isman, 1995; Fosteretal., 2000; Srigirirajuetal., 2009; Bassetal., 2011, 2014; Lietal., 2016)，導(dǎo)致該蟲的防治越來越困難，同時農(nóng)民對殺蟲劑的用量也不斷加重，致使人們對保障生態(tài)安全和食品安全更加擔(dān)憂。近年來，隨著人們對生態(tài)環(huán)保的觀念不斷加深，對綠色、有機(jī)食品的強(qiáng)烈需求，開發(fā)利用環(huán)境友好型農(nóng)藥來防治蚜蟲越來越受到人們的重視。

為了克服大量使用化學(xué)殺蟲劑所引起的一系列問題，許多學(xué)者已對昆蟲病原真菌防治害蟲進(jìn)行了廣泛的研究，如球孢白僵菌Beauveriabassiana、布氏白僵菌B.brongniartii、金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae、玫煙色棒束孢Paecilomycesfurmosoroseus等具有廣泛殺蟲作用的蟲生真菌已經(jīng)商品化，并且應(yīng)用于農(nóng)林害蟲防治中(Vandenbergetal., 2001; Hattingetal., 2004; Hajeketal., 2006; de Faria and Wraight, 2007; Lietal., 2010; Shresthaetal., 2015)。蠟蚧菌Lecanicillium也是一類重要的廣譜性昆蟲病原真菌(蒲蟄龍和李增智, 1996)，其中，蠟蚧輪枝菌Lecanicilliumlecanii和漸狹蠟蚧菌L.attenuatum已報道對蚜蟲具有致病性(Vuetal., 2007; Kimetal., 2008)，但尚未見刀孢蠟蚧菌L.psalliotae對蚜蟲的致病性研究。

本研究選擇安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲病理實驗室已分離純化并鑒定的3個刀孢蠟蚧菌菌株和4個漸狹蠟蚧菌菌株共7個菌株，測定各菌株與毒力相關(guān)的生物學(xué)性狀，同時以桃蚜作為供試?yán)ハx，通過室內(nèi)毒力測定比較各菌株間的致病性，并將累計校正死亡率大于60%的菌株進(jìn)行時間-劑量-死亡率關(guān)系分析，獲得對桃蚜無翅成蚜高毒力的蠟蚧菌菌株，并用體式顯微鏡觀察其對桃蚜的侵染過程，以期為蚜蟲的生物防治提供新的生防材料和進(jìn)一步商品化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株保藏于安徽省微生物重點(diǎn)實驗室。試驗前，用接種針挑取一定量孢子接種到SDAY培養(yǎng)基上，在26℃孢子霉菌培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)15 d作為供試菌株。各菌株寄主、原始采集地及采集時間見表1。

表1 供試蠟蚧菌菌株的采集信息Table 1 Collecting data of the tested Lecanicillium strains

1.2 供試?yán)ハx

供試桃蚜于2017年采自四川省瀘州市煙草試驗基地，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲生態(tài)飼養(yǎng)室內(nèi)用煙草(云煙87)人工飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件為25±1℃，光周期16L∶8D。挑選大小一致，活力較強(qiáng)的無翅成蚜于長勢良好的干凈煙草葉片上，12 h后將成蚜挑離葉片，剩下若蚜在葉片上繼續(xù)飼養(yǎng)至成蚜，挑選最后一次蛻皮1～2 d內(nèi)活力強(qiáng)的無翅成蚜作為試蟲。

1.3 菌落生長及產(chǎn)孢量性狀觀測

將活化后的菌株在直徑為9 cm的SDAY培養(yǎng)基平板上分別用菌液點(diǎn)植培養(yǎng)法接種，蘸取供試菌株濃度為1.0×106/mL的分生孢子懸浮液點(diǎn)植在平板中心，呈一個圓形接種面，每菌株接4個培養(yǎng)皿。接菌后分別置于(25±1)℃、RH>85%和光周期12L∶12D光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀測記錄菌落形態(tài)、顏色、及分生孢子層色澤。從第3天開始，每日測量1次菌落縱橫2個方向的直徑，取其平均值，15 d后用邊長為1 cm的正方形打孔器分別在菌落中心和菌落邊緣和兩條直徑測量線交叉處取菌塊5個，放入10 mL含有0.05% Tween-80無菌水的試管中，在渦旋混合器上振蕩10 min，用血球計數(shù)板測定孢子含量。用無菌水將菌株分生孢子配成1.0×106孢子/mL的懸浮液，用移液槍吸取15 μL滴在含SDAY固體培養(yǎng)基的載玻片上，將載玻片置于25±1℃的無菌環(huán)境下培養(yǎng)，在18 h用顯微鏡隨機(jī)鏡檢5個不同視野，記錄孢子萌發(fā)率。

1.4 菌株對桃蚜無翅成蚜的致病力測定

將活化后的7個菌株的分生孢子分別刮到盛有無菌水的試管中，在渦旋混合器上充分振蕩10 min，用2層無菌棉布過濾掉多余菌絲，并用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)后配制成濃度為2.0×107孢子/mL的孢子懸浮液備用。

采用浸漬法接種，將帶有蚜蟲的煙葉用鑷子夾住葉柄在菌液中浸漬2 s，取出后去除多余菌液，將接種的成蚜用軟毛刷轉(zhuǎn)移到150 mm玻璃培養(yǎng)皿中的新鮮煙葉上，葉柄用吸水性較好的滅菌脫脂棉球包住并加入無菌水，再用保鮮膜包住脫脂棉球，每個培養(yǎng)皿中放一片煙葉，每片煙葉接20頭蚜蟲作為一個處理，每個處理4次重復(fù)，對照組用無菌水處理蚜蟲。將處理后盛放蚜蟲的培養(yǎng)皿放入溫度為25±1℃，相對濕度85%±3%，光周期為16L∶8D人工氣候箱中，連續(xù)7 d觀察記錄桃蚜死蟲數(shù)并及時挑出若蟲和死蟲，計算死亡率。

1.5 菌株對桃蚜無翅成蚜的毒力測定

取致病力測定中篩選出來對桃蚜死亡率大于60%的菌株分生孢子，依次按照梯度稀釋，配制成5個濃度(1.0×104, 1.0×105, 1.0×106, 1.0×107和1.0×108孢子/mL)的孢子懸浮液，分別接種無翅成蚜，以無菌水處理作為對照，每個處理30頭，重復(fù)4次。處理、飼養(yǎng)和觀察方法如同1.4節(jié)。

1.6 菌株對桃蚜無翅成蚜的侵染過程觀察

將篩選出的高毒力菌株以1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液用浸漬法(同1.4節(jié))感染桃蚜無翅成蚜，每隔24 h用體式顯微鏡觀察并記錄桃蚜的體表變化。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用WPS軟件對數(shù)據(jù)做初步整理并計算各處理的死亡率，以Abbott公式計算校正死亡率(公式如下)。用DPS7.05軟件(唐啟義和馮明光, 2002)對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算致死中時(LT50)和致死中濃度(LC50)，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

校正死亡率(%)=

2 結(jié)果

2.1 蠟蚧菌菌株的菌落形態(tài)和培養(yǎng)性狀

供試蠟蚧菌菌株在SDAY培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)均為毛氈狀，菌落色澤和孢子粉色澤為白色或乳白色(圖1)。由表2可以看出，供試蠟蚧菌菌株在SDAY培養(yǎng)基上的菌落直徑(5 d:F6,21=29.21,P<0.0001; 10 d:F6,21=47.71,P<0.0001; 15 d:F6,21=50.63,P<0.0001)、產(chǎn)孢量(F6,28=57.48,P<0.0001)和萌發(fā)率(F6,28=2.02,P<0.1)存在顯著性差異。其中 HFLP006 和 HFLA032 菌株的菌落生長最快，15 d的菌落直徑分別為50.75 mm和51.13 mm，二者無顯著性差異(P>0.05)。15 d后HFLP006菌株的產(chǎn)孢量最高，為13.90×107孢子/cm2，顯著高于其他菌株(P<0.05)。 各菌株18 h的孢子萌發(fā)率均達(dá)到96%以上，其中HFLP006菌株的孢子萌發(fā)率為99.28%。

圖1 供試蠟蚧菌菌株在SDAY培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of the tested Lecanicillium strains on SDAY mediumA: HFLP006; B: HFLP021; C: HFLP025; D: HFLA032; E: HFLA041; F: HFLA064; G: HFLA066.

表2 供試蠟蚧菌菌株在SDAY培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀Table 2 Culture traits of the tested Lecanicillium strains on SDAY medium

2.2 不同蠟蚧菌菌株對桃蚜無翅成蚜的毒力

由表3可以看出，7個蠟蚧菌均對桃蚜無翅成蚜具有一定的致病性，不同蠟蚧菌對桃蚜無翅成蚜的7 d累計校正死亡率存在顯著性差異(F6,21=40.58,P<0.0001)，其中HFLP006菌株引起的無翅成蚜累計校正死亡率最高，為83.56%，致死速率最快，LT50為3.74 d，其次為HFLA032菌株，引起的無翅成蚜累計校正死亡率為63.01%，LT50為5.75 d。其他菌株引起的無翅成蚜累計校正死亡率均未超過50%，LT50均大于7 d。表明這兩個菌株對桃蚜無翅成蚜具有較高毒力。

表3 不同蠟蚧菌菌株在2.0×107孢子/mL濃度下對桃蚜無翅成蚜的致病性Table 3 Pathogenicity of Lecanicillium stains at the concentration of 2.0×107 conidia/mL against the apterous adults of Myzus persicae

2.3 菌株對桃蚜無翅成蚜的毒力及侵染過程

桃蚜無翅成蚜的死亡率與速度與HFLP006和HFLA032菌株的處理劑量呈正相關(guān)性，但前者對桃蚜無翅成蚜的致病效果更顯著。在高濃度1.0×108孢子/mL下，HFLP006菌株引起的桃蚜無翅成蚜累計死亡率達(dá)到94.17%，而HFLA032菌株引起的無翅成蚜累計死亡率處于較低水平，為79.17%(圖2)。在接種后7 d，HFLP006菌株對桃蚜無翅成蚜的LC50最小，為0.21×106孢子/mL; HFLA032菌株對無翅成蚜的LC50為1.86×106孢子/mL(表4)。

表4 蠟蚧菌菌株HFLP006和HFLA032對桃蚜無翅成蚜的毒力Table 4 Virulence of Lecanicillium strains HFLP006 and HFLA032 against the apterous adults of Myzus persicae

圖2 不同濃度菌株HFLP006(A)和HFLA032(B)引起的桃蚜無翅成蚜的逐日累計死亡率Fig. 2 Daily accumulative mortalities of apterous adults of Myzus persicae caused by the stains HFLP006 (A) and HFLA032 (B) at different concentrations CK: 無菌水Sterile water.

從HFLP006菌株對桃蚜無翅成蚜的侵染過程來看，以濃度為1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液接種桃蚜2 d后，桃蚜開始行動遲緩、足和頭部出現(xiàn)白色絲狀菌絲，胸部逐漸變褐，腹部出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，并開始死亡，3 d后全身變?yōu)楹诤稚?，干癟縮小，足和觸角變白，足基部及頭部布滿菌絲，之后菌絲逐漸布滿全身(圖3)。

3 討論

菌株的菌落直徑、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率等生物學(xué)性狀與對靶標(biāo)昆蟲的毒力具有一定的相關(guān)性。李茂業(yè)等(2012)從8株綠僵菌菌株中篩選出一株黃綠綠僵菌MetarhiziumflavovirideMf96在室內(nèi)對Q型煙粉虱Bemisiatabaci2齡若蟲的毒力最高，同時其還具有產(chǎn)孢量大、萌發(fā)率高和生長快等生物學(xué)特性。Zhang等(2011)在白僵菌菌株防治松毛蟲的研究中，分離出一株高毒力菌株Bb1801，同時其菌絲生長速度、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)速率，紫外線耐受性均比其他菌株表現(xiàn)優(yōu)異。本研究通過測定供試菌株菌落直徑、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率，結(jié)果表明，HFLP006菌株的菌落生長最快，產(chǎn)孢量和萌發(fā)率表現(xiàn)最好，尤其是產(chǎn)孢量顯著高于其他菌株(圖1; 表2)，這與上述學(xué)者的觀點(diǎn)基本一致。在進(jìn)一步開發(fā)的過程中，不僅要考慮菌株的高毒力，而且要考慮菌株產(chǎn)孢量和萌發(fā)率，因為高產(chǎn)孢量和萌發(fā)率的昆蟲病原真菌在規(guī)?；a(chǎn)方面一定程度上保證了孢子產(chǎn)量和質(zhì)量，同時也在一定程度上增加菌株在田間流行性傳播的能力，因此更具有田間應(yīng)用和商品化的潛力。

蠟蚧菌為一個復(fù)合種，Zare和Gams(2001)將蠟蚧輪枝菌歸納于一個新屬Lecanicillium中，并分出不同的種，且一些種已報道對蚜蟲具有一定的致病性，Kim等(2008)分離出的一株漸狹蠟蚧菌L.attenuatum對蚜蟲的室內(nèi)死亡率約為80%，在雨季期間對溫室胡椒植物蚜蟲死亡率為72%～97%。Vu等(2007)用多種昆蟲病原真菌對蚜蟲做毒力測定，其中蠟蚧輪枝菌L.lecanii對桃蚜和棉蚜均表現(xiàn)出很高的致病性，其在處理后約5 d和2 d死亡率均接近100%。刀孢蠟蚧菌L.psalliotae雖未見其對蚜蟲的致病性報道，但是對于防治南方根結(jié)線蟲具有一定的效果，Nguyen等(2014)研究表明，刀孢蠟蚧菌對于黃瓜田間的南方根結(jié)線蟲具有較好的防治效果，且對卵有很強(qiáng)的侵染能力；同樣刀孢蠟蚧菌還可以對豆蔻薊馬Sciothripscardamomi具有一定的致病性，Kumar等(2015)在實驗室中用1.0×107孢子/mL的刀孢蠟蚧菌孢子懸浮液接種豆蔻薊馬10 d后測試群體中的死亡率可達(dá)62.9%；不僅如此，Lu等(2015)研究證明刀孢蠟蚧菌對亞洲柑橘木虱Diaphorinacitri具有較好的侵染能力，在相對濕度為90%，孢子濃度為1.0×108孢子/mL條件下，9 d后引起的死亡率高達(dá)92.55%。本試驗通過浸漬法，在相對濕度為85%，孢子濃度為2.0×107孢子/mL條件下從7株不同蠟蚧菌菌株中篩選獲得對桃蚜無翅成蚜具有高毒力的HFLP006菌株，7 d引起的累計校正死亡率為83.56%，LT50為3.74 d(表3)，LC50為2.06×105孢子/mL(表4)，表明菌株HFLP006對桃蚜的毒力更高。同時本研究用HFLP006菌株以1.0×108孢子/mL濃度感染桃蚜無翅成蚜，2 d后桃蚜行動遲緩，足部長出菌絲，腹部逐漸出現(xiàn)褐斑(圖3)，這可能是由于菌絲首先侵入昆蟲足部，并吸干足部水分，菌絲開始向外生長，同時侵入桃蚜體表，并在體內(nèi)開始增殖所導(dǎo)致的。隨著進(jìn)一步的侵染，蟲體開始完全變褐，并皺縮干癟，體表產(chǎn)生大量菌絲(圖3)，這可能是因為菌絲侵入體表后大量增殖并快速吸干體內(nèi)水分及養(yǎng)分造成的結(jié)果。

綜上所述，刀孢蠟蚧菌HFLP006菌株的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均比其他菌株表現(xiàn)優(yōu)異，且對桃蚜的致死率最高，作用時間最短，因此具有一定的開發(fā)為微生物殺蟲劑應(yīng)用于桃蚜的生物防治潛力。