劉 敏, 韓海斌, 劉愛萍，*, 高書晶, 徐林波, 岳方正, 黃海廣

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所, 呼和浩特 010000; 2. 國(guó)家林業(yè)和草原局森林和草原病蟲害防治總站, 沈陽 110034; 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院, 呼和浩特 010000)

茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebustestaceipes是一種寄生性天敵，寄主蚜蟲種類廣泛，包括危害經(jīng)濟(jì)作物的麥二叉蚜Schizaphisgraminum、棉蚜Aphisgossypii、玉米蚜Rhopalosiphummaidis和大豆蚜Aphisgylcnies以及豆科牧草和沙生植物的苜蓿蚜Aphiscraccivora等(Rodrigues and Bueno, 2001; Silvaetal., 2008; 劉興龍等, 2009)。滯育是指昆蟲在不利環(huán)境條件下受到某些信號(hào)的刺激，通過體內(nèi)一系列生理生化變化，使其生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖暫時(shí)停止的生命現(xiàn)象，是對(duì)不利環(huán)境的遺傳性適應(yīng)(Tauberetal., 1986; Saunders, 2002)，滯育一旦開始，不會(huì)因?yàn)榄h(huán)境條件的轉(zhuǎn)變而立即解除滯育，通常會(huì)持續(xù)一段時(shí)間(劉流等, 2010)。滯育不僅可以幫助昆蟲度過不良環(huán)境，維持個(gè)體的生存；而且可以使昆蟲種群發(fā)育整齊，提高雌雄個(gè)體間的交配機(jī)率，保證種群的繁衍(王滿囷和李周直, 2004)。利用茶足柄瘤蚜繭蜂滯育特性來延長(zhǎng)其產(chǎn)品的貨架期，可以更好地防治害蟲。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)寄生蜂滯育的研究主要包括誘導(dǎo)滯育的條件、滯育特征、滯育的親代效應(yīng)、滯育后發(fā)育、滯育的分子機(jī)制等(張洪志等, 2018)。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等生物技術(shù)近年來的快速發(fā)展與廣泛應(yīng)用，昆蟲滯育的機(jī)理正逐步被揭示。滯育期間，昆蟲的血淋巴或脂肪體中存在某些蛋白質(zhì)，且濃度較高，隨著滯育的終止，這些蛋白質(zhì)逐漸消失，而在非滯育昆蟲中無此類蛋白質(zhì)(或僅有極微量痕跡)，它們被認(rèn)為與昆蟲滯育的發(fā)生有關(guān)，稱為滯育關(guān)聯(lián)蛋白(diapause-associated protein, DAP)。昆蟲在滯育過程中，代謝速率緩慢，形態(tài)上無變化，也無組織分化和器官發(fā)育，但生理過程仍繼續(xù)進(jìn)行，如神經(jīng)分泌、脂類代謝及糖類代謝等(Duboisetal., 1956; Haykawa and Chino, 1981; Puirouxetal., 1989)。昆蟲能夠在極端環(huán)境條件下成功存活正是由于這種特殊的生理代謝機(jī)制(Mansingh, 1971; Storey and Storey, 1988; Denlinger, 1991)。

能量代謝是有機(jī)體在物質(zhì)代謝過程中所伴隨能量釋放、轉(zhuǎn)移、貯存與利用的過程，昆蟲利用這些能量來維持生命活動(dòng)。為探究昆蟲滯育過程中能量代謝分子機(jī)制，本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)，對(duì)茶足柄瘤蚜繭蜂進(jìn)行滯育誘導(dǎo)，采用iTRAQ技術(shù)比較茶足柄瘤蚜繭蜂滯育組與非滯育組的蛋白含量，并結(jié)合生物信息學(xué)方法揭示了茶足柄瘤蚜繭蜂滯育期間蛋白的變化規(guī)律，篩選出與能量代謝相關(guān)的滯育關(guān)聯(lián)蛋白并分析功能，為深入分析茶足柄瘤蚜繭蜂滯育機(jī)理提供參考。 這一工作對(duì)研究昆蟲滯育分子機(jī)理與應(yīng)用天敵防治害蟲具有重要意義，同時(shí)也可為滯育后害蟲發(fā)生量與發(fā)生期預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供一種依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源和樣品收集

1.1.1試蟲來源：載體植物蠶豆Viciafaba苗為室內(nèi)培育，寄主苜蓿蚜采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所沙爾沁基地的羊柴Hedysarummongolicum植株上，將苜蓿蚜轉(zhuǎn)接在溫室內(nèi)的水培蠶豆苗上繁殖，確保接在蠶豆苗上的苜蓿蚜未被天敵寄生，接蟲后對(duì)蠶豆苗進(jìn)行籠罩(100目防蟲網(wǎng))，在溫室內(nèi)飼養(yǎng)5代以上作為供試寄主蟲源。從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所沙爾沁基地的羊柴植株上采集被寄生的苜蓿蚜僵蚜，從中挑取茶足柄瘤蚜繭蜂未羽化破殼的僵蚜置于人工氣候箱溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度(70±1)%，光周期14L∶10D條件下培養(yǎng)，挑選羽化后茶足柄瘤蚜繭蜂轉(zhuǎn)移至試管(10 cm×3 cm)內(nèi)，用20%的蜂蜜水作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，接入上述實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的苜蓿蚜2-3齡若蚜上，在室溫下養(yǎng)蟲籠中按照足柄瘤蚜繭蜂∶苜蓿蚜=1∶100釋放成對(duì)剛羽化茶足柄瘤蚜繭蜂和苜蓿蚜，建立茶足柄瘤蚜繭蜂種群作為供試蟲源。 茶足柄瘤蚜繭蜂在室溫下用苜蓿蚜有效擴(kuò)繁10代以上，取羽化24 h內(nèi)的成蜂待用。

1.1.2樣品收集：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)可知，苜蓿蚜若蚜被茶足柄瘤蚜繭蜂寄生后，寄生蜂卵繼續(xù)發(fā)育120 h，此時(shí)僵蚜體內(nèi)寄生蜂處于高齡幼蟲(3-4齡)階段，高齡幼蟲為茶足柄瘤蚜繭蜂感受滯育信號(hào)的敏感蟲態(tài)，將此時(shí)的僵蚜放入人工氣候箱中進(jìn)行滯育誘導(dǎo)。高齡幼蟲處于滯育環(huán)境條件時(shí)，并不會(huì)立刻停止發(fā)育，而是繼續(xù)發(fā)育一段時(shí)間，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)發(fā)育至蛹時(shí)，便不再繼續(xù)發(fā)育(孫程鵬, 2018)。本研究中，基于1.1.1節(jié)中供試蟲源，誘導(dǎo)茶足柄瘤蚜繭蜂滯育的溫光組合為溫度8℃和光周期8L∶16D，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為30 d。選取經(jīng)過30 d滯育誘導(dǎo)的僵蚜300頭,解剖出茶足柄瘤蚜繭蜂活蛹, 50頭/管放入液氮中速凍暫時(shí)保存，然后作為滯育組樣品放入-80℃冰箱中保存；苜蓿蚜若蚜被茶足柄瘤蚜繭蜂寄生后，放置在(25±0.5)℃、RH (70±5)%、光周期14L∶10D、光照強(qiáng)度8 800 lx(人工氣候箱，上海一恒公司MGC-HP系列)條件下，寄生蜂卵繼續(xù)發(fā)育168 h(此時(shí)蚜繭蜂處于蛹態(tài))，對(duì)300頭僵蚜進(jìn)行解剖，挑選飽滿、有活力的茶足柄瘤蚜繭蜂蛹, 50頭/管放入液氮中速凍暫時(shí)保存，然后作為非滯育組樣品放入-80℃冰箱中保存。

1.2 滯育組與非滯育組茶足柄瘤蚜繭蜂蛋白提取

蛋白質(zhì)提取采用裂解液法(徐珊珊等, 2008)。采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford 法)(胡文霞,2011)測(cè)定蛋白濃度。取100 μg蛋白樣品，加入適量蛋白溶解液(8 mol/L尿素， 100 mmol/L TEAB, pH 8.5)補(bǔ)足體積至100 μL，胰蛋白酶(1 μg/μL) 2 μL和TEAB緩沖液(100 mmol/L) 500 μL，混勻后于37℃酶切過夜，取上清通過C18除鹽柱進(jìn)行脫鹽處理，然后加入足量iTRAQ標(biāo)記試劑(溶于異丙醇)，室溫下顛倒混勻反應(yīng)1 h，取等體積標(biāo)記后的蛋白樣品混合，除鹽后凍干。配制流動(dòng)相A液(2%乙腈和98%水，氨水調(diào)至pH 10)和B液(98%乙腈和2%水，氨水調(diào)至pH 10)。使用1 mL A液溶解標(biāo)記后的混合樣品粉末，離心后取1 mL上清進(jìn)樣。經(jīng)過脫鹽處理, 真空干燥，每分鐘收集1管，凍干后各加入0.1%甲酸溶解，經(jīng)高效液相色譜 (HPLC) 預(yù)分離。配制流動(dòng)相A液(100%水和0.1%甲酸)和B液(80%乙腈和0.1%甲酸)。對(duì)收得餾分上清各取2 μg樣品進(jìn)樣，液質(zhì)檢測(cè)。使用Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用軟件Discoverer2.2對(duì)生成質(zhì)譜檢測(cè)的原始數(shù)據(jù)(.raw)進(jìn)行查庫鑒定及定量分析。Discoverer2.2軟件對(duì)檢索結(jié)果做了進(jìn)一步過濾以提高分析結(jié)果質(zhì)量，降低假陽性率，可信度在95%以上的肽段匹配譜圖(peptide spectrum matches, PSMs)為可信PSMs，至少包含一個(gè)特有肽段的蛋白為可信蛋白，只保留可信的PSMs和蛋白，經(jīng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)驗(yàn)證去除FDR>5%的肽段和蛋白。將每個(gè)蛋白在滯育組和非滯育組中的所有生物學(xué)重復(fù)定量值均值的比值作為差異倍數(shù)(fold change, FC)。為了判斷差異的顯著性，將每個(gè)蛋白在滯育組和非滯育組樣品中的相對(duì)定量值進(jìn)行了T檢驗(yàn)，并計(jì)算相應(yīng)的P值，以此作為顯著性指標(biāo)。當(dāng)FC≥2.0，同時(shí)P≤0.05時(shí)，蛋白表現(xiàn)為表達(dá)量上調(diào);當(dāng)FC≤0.50，同時(shí)P≤0.05時(shí)，蛋白表現(xiàn)為表達(dá)量下調(diào)。

利用GO功能顯著性富集分析將滯育組和非滯育組樣品差異表達(dá)蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http:∥www.geneontology.org/)的各個(gè)term映射，計(jì)算每個(gè)term的蛋白質(zhì)數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)找出與所有蛋白質(zhì)背景相比，在DEPs中顯著富集的GO條目(term)。其計(jì)算公式：

其中N為所有蛋白中具有GO注釋信息的蛋白數(shù)目，n為N中差異蛋白的數(shù)目，M為所有蛋白中注釋到某個(gè)GO條目的蛋白數(shù)目，X為注釋到某個(gè)GO條目的差異蛋白數(shù)目。計(jì)算得到P值，以P≤0.05為閾值，滿足此條件的GO term定義為在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO term。通過GO顯著性分析能確定DEPs行使的主要生物學(xué)功能。

利用KEGG pathway顯著性富集分析方法對(duì)滯育組和非滯育組樣品DEPs進(jìn)行功能富集分析，確定DEPs參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果

2.1 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹中差異表達(dá)蛋白

本研究中定量蛋白總數(shù)為7 251個(gè)，根據(jù)1.3節(jié)中篩選差異蛋白的條件，對(duì)定量到的蛋白進(jìn)行篩選，滯育組與非滯育組中DEPs有135個(gè)，滯育組上調(diào)表達(dá)蛋白有38個(gè)(FC≥2.0,P≤0.05)，上調(diào)表達(dá)量最高的蛋白為茶足柄瘤蚜繭蜂knottin樣蛋白(序列ID為Cluster-35028.0,FC=4.616)；下調(diào)表達(dá)蛋白有97個(gè)(FC≤0.50,P≤0.05)，下調(diào)表達(dá)量最高的蛋白為大蜜蜂Apisdorsata不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) M-like (序列ID為Cluster-50256.0,FC=0.145)。火山圖(圖1)可以非常直觀地展現(xiàn)出滯育組與非滯育組樣本間的差異蛋白，及其統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P值)和表達(dá)水平差異程度(FC)。

圖1 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹差異表達(dá)蛋白火山圖Fig. 1 Volcano plot of differentially expressed proteins (DEPs) in diapause and non-diapause pupae of Lysiphlebus testaceipes None: 表達(dá)差異不顯著的蛋白Proteins without significant expression difference; Up: 上調(diào)DEPs (Up-regulated DEPs); Dwon: 下調(diào)DEPs (Down-regulated DEPs). 圖2同The same forFig.2. 橫坐標(biāo)表示滯育蛹(D)與非滯育蛹(ND)間差異蛋白的差異倍數(shù)(log2值)，縱軸表示P值(-log10值)。Transverse coordinate indicates the fold change (log2P-value) of DEPs in diapause pupae (D) and non-diapause pupae (ND), and longitudinal axis represents the P-value (-log10 value).

2.2 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹中差異表達(dá)蛋白的GO富集分析

圖2中，GO注釋到的差異蛋白數(shù)目為90，分為生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能3類，富集到154條條目，共有44個(gè)GO條目顯著富集；在生物學(xué)過程中參與有機(jī)物代謝過程的蛋白數(shù)最多，高分子代謝過程和蛋白質(zhì)代謝過程次之；在細(xì)胞成分中與胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)功能相關(guān)的蛋白數(shù)較多；在分子功能部分中參與結(jié)構(gòu)分子活性和核糖體結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)數(shù)量較多。與天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)(aspartate transport)、L-谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)(L-glutamate transport)、膽堿脫氫酶活性(choline dehydrogenase activity)、膽堿生物合成甘氨酸甜菜堿(glycine betaine biosynthetic process from choline)等條目相關(guān)的蛋白質(zhì)在滯育階段顯著上調(diào)表達(dá)。

圖2 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹間差異表達(dá)蛋白的GO功能富集Fig. 2 GO function enrichment of differentially expressed proteins in diapause and non-diapause pupae of Lysiphlebus testaceipes

2.3 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育與非滯育蛹中差異表達(dá)蛋白的KEGG富集分析

KEGG注釋到64個(gè)差異蛋白，共富集到97條KEGG pathway，對(duì)富集通路進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，除與人類疾病相關(guān)的通路外，有3條途徑顯著富集到KEGG pathway上，分別是核糖體(ribosome)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)和逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)(retrograde endocannabinoid signaling)。而富集到這些條目及通路中的蛋白質(zhì)與能量代謝及抗逆性有密切關(guān)系。根據(jù)富集結(jié)果，繪制富集到的KEGG通路的氣泡圖(圖3, 只展示top20的結(jié)果)。

圖3 茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹與非滯育蛹差異表達(dá)蛋白KEGG富集氣泡圖Fig. 3 Scatter plot of KEGG enrichment of differentially expressed proteins (DEPs) in diapause and non-diapause pupae of Lysiphlebus testaceipes 圖中橫坐標(biāo)軸為相應(yīng)通路中DEPs的數(shù)目與鑒定出的總蛋白數(shù)目的比值，值越大，說明在該通路中DEPs富集程度越高;圓點(diǎn)的顏色代表超幾何檢驗(yàn)的P值，值越小，說明檢驗(yàn)的可靠性越大、越具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。點(diǎn)的大小代表相應(yīng)通路中DEPs的數(shù)目，值越大，該通路內(nèi)DEPs越多。The abscissa in theFigure is the ratio of the number of DEPs in the corresponding pathway to the number of total proteins identified. The larger the value is, the higher the concentration of DEPs in this pathway is. The color of dots represents the P-value of hypergeometric test. The smaller the value is, the more reliable and statistically significant the test is. The size of the dots represents the number of DEPs in the corresponding pathway. The larger the dot, the more DEPs in the pathway.

3 討論

近年來，發(fā)現(xiàn)了大量滯育關(guān)聯(lián)蛋白，并鑒定分析了一些蛋白。例如，Hao等(2012)對(duì)菜蛾盤絨繭蜂Cotesiavestalis進(jìn)行了滯育研究，主要研究了過氧化物相關(guān)酶在其親代效應(yīng)中的作用，結(jié)果顯示，親代的滯育蛹過氧化物酶活性升高，過氧化氫酶活性降低，但是在滯育子代的卵中過氧化物酶和過氧化氫酶的活性顯著提高，并以此推測(cè)在代際間過氧化氫具有進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的作用；Colinet等(2012)利用2D-DIGE技術(shù)對(duì)滯育與非滯育翼蚜外繭蜂Praonvolucre的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，確定了221個(gè)差異表達(dá)顯著的蛋白，對(duì)這些蛋白利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定，最終鑒定出細(xì)胞骨架蛋白、ATP 結(jié)合蛋白、角質(zhì)層類蛋白、應(yīng)激蛋白、糖酵解、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝等重要代謝過程中的酶等；黃鳳霞等(2015)利用iTRAQ技術(shù)，對(duì)滯育與非滯育煙蚜繭蜂Aphidiusgifuensis進(jìn)行蛋白檢測(cè)，在滯育階段發(fā)現(xiàn)278個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)。本研究中下調(diào)表達(dá)量最高的蛋白為大蜜蜂不均一核糖核蛋白 M-like(序列ID為Cluster-50256.0,FC=0.145)，該蛋白被用作轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄抑制(黃嘉等, 2004)。這些差異表達(dá)蛋白主要與糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝等代謝過程及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，各種代謝酶等有關(guān)。能量代謝是滯育昆蟲成活的關(guān)鍵，滯育期間的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備水平直接影響昆蟲的存活情況以及滯育后的發(fā)育和生殖(張倩等, 2019)。KEGG通路分析顯示，茶足柄瘤蚜繭蜂蛹滯育相關(guān)蛋白在氧化磷酸化通路顯著上調(diào)。在有氧條件下，氧化磷酸化作用是需氧細(xì)胞生物生命活動(dòng)的主要能量來源，在細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)分子經(jīng)氧化分解形成CO2和H2O，并釋放出能量使ADP和Pi合成ATP(王鏡巖等, 2008)。其中有10個(gè)與能量產(chǎn)生及轉(zhuǎn)化有關(guān)的蛋白過表達(dá)。在本研究中發(fā)現(xiàn)的與茶足柄瘤蚜繭蜂滯育相關(guān)的蛋白質(zhì)主要涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶亞基(復(fù)合物)、細(xì)胞色素bc1復(fù)合物亞基、ATP合酶ε亞基、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)等。

NADH脫氫酶催化由NADH至輔酶Q的電子傳遞過程，同時(shí)將電子由線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜間隙。細(xì)胞色素bc1復(fù)合物是線粒體呼吸電子傳遞鏈中的核心元素，是催化從輔酶Q到細(xì)胞色素C的電子傳遞過程，同時(shí)將質(zhì)子由線粒體基質(zhì)泵至膜間隙。ATP合酶ε亞基，屬于ATP合酶F1組分。ATP合酶，又稱F0F1-ATP酶，在細(xì)胞內(nèi)催化能源物質(zhì)ATP的合成(王鏡巖等, 2008)。在茶足柄瘤蚜繭蜂呼吸作用過程中通過電子傳遞鏈釋放的能量先轉(zhuǎn)換為跨膜質(zhì)子(H+)梯差，之后質(zhì)子流順質(zhì)子梯差通過ATP合酶可以使ADP+Pi合成ATP。ε亞基有抑制酶水解ATP的活性，同時(shí)有堵塞H+通道，減少H+外泄的功能，這一功能保證了茶足柄瘤蚜繭蜂在滯育過程中ATP的順利合成(倪張林, 2001)。在環(huán)境脅迫條件下，能量需求增加，通過氧化磷酸化途徑，能量產(chǎn)生增加，從而為滯育期間的茶足柄瘤蚜繭蜂提供更多的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，推斷NADH脫氫酶、細(xì)胞色素bc1復(fù)合物、ATP合酶對(duì)茶足柄瘤蚜繭蜂的逆境生存和能量緩沖有積極作用。谷氨酸脫氫酶是調(diào)控機(jī)體碳、氮代謝相互交叉的重要酶，催化氧化脫氨基作用(oxidative deamination)，氨基酸脫氨基后形成的氨是有毒物質(zhì)。絕大多數(shù)陸生動(dòng)物將脫下的氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩嘏判埂Ｔ贕O富集結(jié)果中顯示，與天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)、L-谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)條目相關(guān)的蛋白在滯育過程中上調(diào)表達(dá)，而天冬氨酸(aspartic acid)和谷氨酸(L-glutamic acid)是尿素形成的關(guān)鍵。線粒體中的谷氨酸脫氫酶將谷氨酸的氨基脫下，為氨甲酰磷酸(carbamoyl phosphate)的合成提供游離的氨；細(xì)胞質(zhì)中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase)把谷氨酸的氨基轉(zhuǎn)移給草酰乙酸(oxaloacetic acid)，草酰乙酸再形成天冬氨酸進(jìn)入尿素循環(huán)(urea cycle)，谷氨酸為循環(huán)間接提供第2個(gè)氨基(王鏡巖等, 2008)。同時(shí)谷氨酸脫氫酶在茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹中上調(diào)表達(dá)，表明滯育蛹體內(nèi)將有更多的氨進(jìn)入尿素循環(huán)。這可能是由于滯育蛹新陳代謝較弱，從而抑制了氨基酸的合成，導(dǎo)致氨過剩的結(jié)果。此外，有研究報(bào)道，滯育型棉鈴蟲Helicoverpaarmigera幼蟲可能通過在體內(nèi)積累大量尿素達(dá)到抵御低溫的作用(Zhangetal., 2013)，茶足柄瘤蚜繭蜂滯育蛹也同樣可能利用尿素來提高其耐寒性。NADH產(chǎn)生于糖酵解(glycolysis)和細(xì)胞呼吸作用中的檸檬酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)，谷氨酸經(jīng)過轉(zhuǎn)化后可生成檸檬酸循環(huán)中間物質(zhì)2-氧戊二酸，說明茶足柄瘤蚜繭蜂滯育對(duì)檸檬酸循環(huán)產(chǎn)生了顯著影響。檸檬酸循環(huán)不僅為生命體提供能量，同時(shí)也是糖類、脂類和氨基酸三者之間互轉(zhuǎn)化的樞紐(Bergetal., 2002)。已有研究表明，檸檬酸循環(huán)在昆蟲滯育期間受到抑制(Michaud and Denlinger, 2007; Xuetal., 2012; 劉遙等, 2014; Luetal., 2014)，這與滯育期間代謝減弱相符合。茶足柄瘤蚜繭蜂在滯育期間代謝減弱，與正常發(fā)育的茶足柄瘤蚜繭蜂相比，產(chǎn)能必定減少，但機(jī)體仍需要熱能來抵御低溫。在低溫環(huán)境下，生物體產(chǎn)熱增加，散熱減少。而實(shí)驗(yàn)證明，在滯育過程中，參與氧化磷酸化通路的蛋白上調(diào)表達(dá)，說明此過程中產(chǎn)生的一部分能量用作維持正常的生命活動(dòng)，還有一部分產(chǎn)生的是熱能。自然界適應(yīng)冷環(huán)境的動(dòng)物，利用氧化磷酸化解偶聯(lián)的方式產(chǎn)生大量的熱。它們的脂肪組織中有一種褐色脂肪組織含有產(chǎn)熱素(thermogenin)又稱解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein),能構(gòu)建一種被動(dòng)質(zhì)子通道，使質(zhì)子流從內(nèi)膜外流向基質(zhì)而不經(jīng)過F0F1復(fù)合體的F0通道而是又回到基質(zhì)，結(jié)果產(chǎn)生熱而不形成ATP(王鏡巖等, 2008)。我們推測(cè),滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂脂肪組織中可能也存在這種“解偶聯(lián)劑”，使得蟲體在氧化磷酸化過程中既能滿足生命活動(dòng)所需的能量，又能保證足夠的熱量來抵御低溫環(huán)境。但滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂體內(nèi)是否含有這樣的物質(zhì)，我們需進(jìn)一步探究。膽堿脫氫酶活性、膽堿生物合成甘氨酸甜菜堿條目相關(guān)蛋白在GO富集結(jié)果中顯著上調(diào)，膽堿脫氫酶(choline dehydrogenase)可催化底物合成甘氨酸甜菜堿(glycine betain)，因此甘氨酸甜菜堿的含量在滯育的茶足柄瘤蚜繭蜂蛹中必然增加。在滯育條件下，茶足柄瘤蚜繭蜂受到水分脅迫，甜菜堿作為有機(jī)滲透劑可維持細(xì)胞滲透壓，同時(shí)甜菜堿對(duì)酶有保護(hù)作用，不僅可以抵御冰凍脅迫，對(duì)有氧呼吸和能量代謝過程也有良好的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究從蛋白質(zhì)組整體層面闡明茶足柄瘤蚜繭蜂蛹滯育背后的多蛋白調(diào)控，重點(diǎn)篩選了與能量代謝相關(guān)的滯育關(guān)聯(lián)蛋白并分析了其功能，有助于更好地理解茶足柄瘤蚜繭蜂蛹滯育的代謝機(jī)制，進(jìn)一步擴(kuò)展了對(duì)蚜繭蜂滯育機(jī)制的理解，為基于遺傳或化學(xué)調(diào)控天敵滯育建立提供了新思路、新平臺(tái)，具有重要的理論意義以及潛在的應(yīng)用價(jià)值。