姜雪冰, 張 雪, 杜文梅, 鄒 振, 張俊杰,*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所, 生物防治技術(shù)工程研究中心, 長春 130118; 2. 中國科學(xué)院動物研究所, 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室, 北京 100101)

松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi隸屬于膜翅目(Hymenoptera)赤眼蜂科(Trichogrammatidae)赤眼蜂屬Trichogramma，能寄生多種農(nóng)林害蟲的卵，如亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis、水稻二化螟Chilosuppressalis等(李麗英, 1984; 林乃銓, 1987)。在松毛蟲赤眼蜂工廠化生產(chǎn)的過程中，天敵昆蟲的保存是一個十分重要的環(huán)節(jié)(張俊杰等, 2015)。傳統(tǒng)的方法是利用低溫對松毛蟲赤眼蜂商品進(jìn)行保存，但低溫保存的劣勢也是比較明顯的，經(jīng)過低溫冷藏的松毛蟲赤眼蜂在寄生率、羽化率等指標(biāo)上均顯著下降，直接地影響了松毛蟲赤眼蜂的防治效果(張俊杰等, 2018)。滯育技術(shù)的應(yīng)用能很好地解決松毛蟲赤眼蜂商品的保存問題。盡管滯育技術(shù)已經(jīng)在松毛蟲赤眼蜂工廠化生產(chǎn)中得以應(yīng)用(Zhangetal., 2018)，但對于松毛蟲赤眼蜂滯育誘導(dǎo)及解除的機(jī)制還不甚了解，這也使得滯育技術(shù)的運用存在著極大的局限性。因此，為了進(jìn)一步促進(jìn)松毛蟲赤眼蜂的工廠化生產(chǎn)進(jìn)程，提高生物防治的效果，亟需對影響滯育的分子機(jī)制進(jìn)行深入的探究。

一氧化氮(nitric oxide, NO)作為一種具有自由基特性的活性分子，參與多種昆蟲的生命活動，如激活昆蟲的先天性免疫(Ishiietal., 2013; Sadekuzzamanetal., 2018)，激活精子(Nagaokaetal., 2017)，并可以作為神經(jīng)系統(tǒng)的信號分子(Müller, 1997)。還有報道證實，NO對蜜蜂Apis的嗅覺記憶及嗅覺馴化均有重要作用(Müller and Hildebrandt, 2002)。在其他動物如鹵蟲中，NO還可以作為活性氮物質(zhì)促進(jìn)個體囊胚發(fā)育(Villalobo, 2006; Formanetal., 2008; 杜濱, 2012)。在近年來的研究中還發(fā)現(xiàn)，NO與水稻二化螟的滯育有著密切的聯(lián)系(Luetal., 2013)。

生物體內(nèi)催化一氧化氮合成的酶即為一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS) (Rivero, 2006; Poytonetal., 2009)。一氧化氮合酶通過兩步反應(yīng)催化生成一氧化氮：(1)由L-精氨酸生成NG-羥基-L-精氨酸(L-NHA)；(2) L-NHA轉(zhuǎn)變?yōu)長-瓜氨酸及一氧化氮(Zhu and Silverman, 2008)。Kitta等(2016)在研究家蠶Bombyxmori的NOS的過程中發(fā)現(xiàn)，BmNOS在家蠶胚胎發(fā)育的早期有著重要的作用，這一研究也證明了NOS對家蠶的滯育發(fā)育具有一定的影響。而相關(guān)研究在天敵昆蟲松毛蟲赤眼蜂中的研究尚未見報道，因此，本研究克隆了松毛蟲赤眼蜂NOS基因的cDNA，并對其序列進(jìn)行分析、原核純化及滯育相關(guān)表達(dá)分析，為進(jìn)一步闡明該基因在調(diào)控松毛蟲赤眼蜂滯育和發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)，為松毛蟲赤眼蜂的工廠化生產(chǎn)中，滯育技術(shù)的靈活應(yīng)用提供了重要的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

本實驗所用松毛蟲赤眼蜂采自于黑龍江省尚志市葦河鎮(zhèn)玉米田，寄生于亞洲玉米螟卵內(nèi)，在26±1℃，RH 60%±5%，光周期14L∶10D的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至成蜂后，按赤眼蜂∶柞蠶卵=8∶1的比例提供新鮮柞蠶卵繼續(xù)繁育，繁育至少5代的赤眼蜂才被用于后續(xù)實驗(張俊杰等, 2019)。目前松毛蟲赤眼蜂一直在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所用柞蠶卵繁育。實驗中所用到的柞蠶卵為在25±1℃溫度條件下，柞蠶繭發(fā)育至出蛾后剖腹取得，并用0.1%新潔爾滅浸泡消毒10 min，晾干備用。其中柞蠶繭采購自吉林省永吉縣(張俊杰, 2015)。

1.2 滯育及滯育解除模型的構(gòu)建

滯育誘導(dǎo)：在26±1℃，RH 60%±5%，光周期14L∶10D的培養(yǎng)箱中，以1.1節(jié)柞蠶卵繁育的松毛蟲赤眼蜂發(fā)育至幼蟲中期后，置于12℃，RH 60%±5%，全暗條件下30 d。30 d后解剖寄主卵觀察，仍停留在預(yù)蛹期的松毛蟲赤眼蜂個體即判定其進(jìn)入滯育狀態(tài)。

滯育解除：將滯育松毛蟲赤眼蜂置于3℃，RH 60%±5%，全暗條件下70 d，轉(zhuǎn)入正常發(fā)育條件(同1.1節(jié))下培養(yǎng)，可繼續(xù)發(fā)育至蛹期的個體即為成功解除滯育的個體(張俊杰, 2015)。

本實驗中共設(shè)置5組樣品，分別為：滯育預(yù)蛹(diapause prepupa, Dpre)，正在誘導(dǎo)解除滯育預(yù)蛹(prepupa after diapause termination, DT)，滯育解除后的蛹(pupa after diapause, Dp)，正常發(fā)育的預(yù)蛹(non-diapause prepupa, NDpre) 和正常發(fā)育的蛹(non-diapause pupa, NDp)。其中，NDpre及NDp作為對照組。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

分別取來自一粒柞蠶卵內(nèi)的Dpre, DT, Dp, NDpre和NDp個體以TRIzol溶液(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)進(jìn)行總RNA提取(一粒柞蠶卵中的松毛蟲赤眼蜂個體數(shù)約90頭)，提取的RNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop (Thermo Scientific, 美國)進(jìn)行質(zhì)量檢測后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(TaKaRa, 日本)，合成的cDNA作為后續(xù)實驗的模板。

1.4 內(nèi)參基因的篩選和不同滯育階段松毛蟲赤眼蜂TdNOS基因表達(dá)譜分析

結(jié)合已發(fā)表的文章選定GAPDH,β-Actin, 18S rRNA和25S rRNA 4個較為常見的內(nèi)參基因(魏永贊等, 2012)，用qPCR技術(shù)檢測4個待定的內(nèi)參基因在松毛蟲赤眼蜂的5種不同滯育階段(Dpre, DT, Dp, NDpre和NDp)的表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系10 μL如SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa,日本)說明書所示。反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性30 s； 95℃變性5 s, 60℃退火30 s, 40個循環(huán)。溶解曲線：起始溫度60℃，終溫度95℃，持續(xù)1 s，溫度增量0.2℃； 20℃ 10 s。利用BestKeeper程序進(jìn)行定量結(jié)果的分析(吳建陽等, 2017)，以篩選最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

基于前期轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)獲得不同滯育階段松毛蟲赤眼蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(project number PRJNA597631)，篩選出NOS基因TdNOS。以1.3節(jié)獲得的cDNA為模板，采用qPCR對5種不同滯育階段松毛蟲赤眼蜂Dpre, DT, Dp, NDpre和NDp樣本中NOS基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析；每組樣本重復(fù)4次。PCR反應(yīng)體系10 μL，體系中各成分具體組成及反應(yīng)程序如SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa, 日本)說明書所示。實驗中所使用的引物均由Primer Premier 6 (Premier, 加拿大)軟件設(shè)計(表1)。以2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因及內(nèi)參基因的相對表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.5 TdNOS基因cDNA序列克隆

根據(jù)1.4節(jié)qPCR結(jié)果，以TdNOS表達(dá)量最高的樣本cDNA為模板對TdNOS的cDNA序列進(jìn)行克隆。PCR反應(yīng)體系(50 μL)和具體反應(yīng)程序參考Easy-Taq DNA聚合酶說明書(TaKaRa, 日本)。PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，送生工生物工程股份有限公司(上海)測序，拼接后獲得TdNOS的cDNA序列。并在同樣條件下，以取未被寄生的新鮮柞蠶雌蛾剖腹取卵，0.1%新潔爾滅浸泡消毒10 min，晾干，解剖后用200 μL移液槍將卵液移至1.5 mL EP管中，按1.3節(jié)中的方法提取柞蠶卵總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣品，以該樣品為模板進(jìn)行NOS基因cDNA序列的克隆，作為對照。

1.6 TdNOS cDNA序列分析

核苷酸序列比對使用blast工具(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn &PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)；預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域的網(wǎng)站為： https:∥ www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；用DNAMAN軟件推導(dǎo)編碼氨基酸序列；用NetPhos 3.1 Server程序分析磷酸化修飾位點；氨基酸序列比對使用ClustalX2.0軟件；蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用在線軟件PRABI(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_a utomat.pl? page=nps a_sopm.html)；蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用在線軟件https:∥swissmodel.expasy.org/interactive；蛋白親水性使Protscale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析；使用TMHMM Server v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；使用SignalP-5.0 Server分析信號肽；使用MEGA7.0軟件最大簡約法(maximum parsimony, MP)(bootstrap=1 000)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析。

1.7 TdNOS原核表達(dá)及及特異性抗體的制備

構(gòu)建重組載體TdNOS/pET-28a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板中過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，并測序驗證。將驗證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)，并在新的LB培養(yǎng)基中以37℃ 200 r/min的條件培養(yǎng)至OD600=0.6，然后加入2.5 μL的IPTG培養(yǎng)16 h。收集菌體超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，以未加入IPTG誘導(dǎo)的菌液為對照。觀察到目的條帶后，改用900 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan+)大量誘導(dǎo)菌體表達(dá)，收集菌體超聲破碎，使用Ni-NTA瓊脂糖親和進(jìn)行層析純化，在蛋白純化的過程中，利用不同濃度(100, 150和200 mmol/L)的咪唑溶液對蛋白進(jìn)行洗脫，收集純化后的蛋白送樣至華大基因有限公司進(jìn)行多克隆抗體的制備(兔抗)。

取4組松毛蟲赤眼蜂(Dpre, Dp, NDpre和NDp)樣本及10粒未被寄生的新鮮柞蠶卵的卵液樣本，每組赤眼蜂樣品為10粒柞蠶卵內(nèi)包含的全部松毛蟲赤眼蜂(每粒卵內(nèi)約含松毛蟲赤眼蜂90頭)。分別置于1.5 mL EP管中，加300 mL RIPA裂解液(含胰蛋白酶抑制劑)，用破碎儀進(jìn)行破碎處理。 冰上孵育30 min，細(xì)胞充分裂解后，4℃ 14 000 g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)至新的EP管中，進(jìn)行Western blot檢測。

1.8 TdNOS蛋白質(zhì)譜檢測

收集1.7節(jié)中表達(dá)純化的TdNOS進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，并對目的條帶進(jìn)行切割、純化，加入100%乙腈(ACN)進(jìn)行脫水，再加入10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫鍵，同時，為抑制蛋白降解并封閉巰基，加入55 mmol/L碘乙酰胺，去除后以碳酸氫銨溶液清洗、孵育，經(jīng)超聲清洗，加入胰蛋白酶過夜孵育。過夜孵育后取上清，加入600 μL，6% ACN/0.1% TFA(乙腈/三氟乙酸)，真空懸干得到5～10 μL樣品，加入60 μL 2% ACN/0.1% TFA(乙腈/三氟乙酸)，再經(jīng)超聲處理及高速離心(4℃ 14 000 g, 10 min)后收集到的上清液用于質(zhì)譜檢測，并對蛋白質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

各處理之間的差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較(P<0.05)方法比較平均值的差異顯著性。利用SPSS Statistic 19.0軟件(IBM, 美國)及GraphPad Prism7 (GraphPad, 美國)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計。以2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因及內(nèi)參基因的相對表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)。

2 結(jié)果

2.1 不同滯育階段松毛蟲赤眼蜂TdNOS的表達(dá)量

利用BestKeeper程序計算GAPDH,β-Actin, 18S rRNA和25S rRNA 4個內(nèi)參基因之間的相關(guān)系數(shù)和程序指數(shù)，結(jié)果表明GAPDH和25S rRNA基因的標(biāo)準(zhǔn)差和協(xié)方差值明顯低于其他兩個基因，且GAPDH的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.90(表2)，因此選取GAPDH作為分析TdNOS表達(dá)量的內(nèi)參基因。

表2 BestKeeper計算出的內(nèi)參基因穩(wěn)定性參數(shù)Table 2 Stability of selected reference genes calculated by BestKeeper

qPCR結(jié)果可知，TdNOS轉(zhuǎn)錄本在松毛蟲赤眼蜂的不同滯育階段均有表達(dá)，但是表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)。其中，在解除滯育后蛹期個體(Dp)中，TdNOS的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他幾個發(fā)育階段個體(Dpre, DT, NDpre和NDp)中的；處于預(yù)蛹期的松毛蟲赤眼蜂個體(Dpre和NDpre)，無論是否滯育，其TdNOS的表達(dá)量均較低；但是在經(jīng)過30 d低溫處理正在誘導(dǎo)解除滯育預(yù)蛹期個體(DT)中，TdNOS的表達(dá)量明顯提升，在滯育發(fā)育過程(Dpre-DT-Dp)中，TdNOS的表達(dá)量呈明顯的上調(diào)趨勢(圖1)。

圖1 TdNOS在不同滯育階段松毛蟲赤眼蜂中 的相對表達(dá)量Fig. 1 Relative expression levels of TdNOS in Trichogramma dendrolimi at different diapause stages Dpre: 滯育預(yù)蛹Diapause prepupa; DT: 正在誘導(dǎo)解除滯育的預(yù)蛹Prepupa after diapaue termination; Dp: 滯育解除后的蛹Pupa after diapause; NDpre: 正常發(fā)育的預(yù)蛹Non-diapause prepupa; NDp: 正常發(fā)育的蛹Non-diapause pupa. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)椎誤，不同階段樣本中基因表達(dá)量以滯育的預(yù)蛹中的表達(dá)量為基準(zhǔn)。柱上不同小寫字母表示不同階段樣本中基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05, Duncan氏多重比較)。Data in theFigure are mean±SE. The relative expression levels of the gene in samples of different stages are normalized to that in the diapause prepupa. Different lowercase letters above bars indicate significant differences in the gene expression level in samples among different stages (P<0.05, Duncan’s multiple comparisons).

2.2 TdNOS序列特征

克隆獲得的目的片段大小為1 014 bp，而以柞蠶卵為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并未有目的條帶產(chǎn)生(圖2)，通過blast對比鑒定為一氧化氮合酶基因，登記為TdNOS(GenBank登錄號: MN650600)。通過生物信息學(xué)對該序列編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析和預(yù)測，結(jié)果表明，該序列共編碼337個氨基酸(圖3)，無信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)，含絲氨酸磷酸化位點33個，酪氨酸磷酸化位點7個，蘇氨酸磷酸化位點10個，為親水性蛋白。其二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋及無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其次由延伸鏈和β轉(zhuǎn)角組成。

圖2 NOS基因cDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification results of cDNA sequence of NOS geneA: 松毛蟲赤眼蜂體內(nèi)NOS基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果The PCR amplification results of NOS gene in Trichogramma dendrolimi; B: 未被寄生的柞蠶卵內(nèi)NOS基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果The PCR amplification results of NOS gene in unparasitized eggs of Antheraea pernyi.

圖3 松毛蟲赤眼蜂TdNOS的核苷酸及編碼的氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide and amino acid sequences of TdNOS of Trichogramma dendrolimi 加方框的核苷酸序列表示起始密碼子和終止密碼子，加方框的氨基酸表示保守的半胱氨酸。The nucleotide sequences in box represent the start codon and the stop codon, and the amino acids in box represent conserved cysteines.

2.3 NOS系統(tǒng)發(fā)育樹

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)可知，在選擇的21種昆蟲中，松毛蟲赤眼蜂與短管赤眼蜂Trichogrammapretiosum的NOS序列一致性最高(98.95%)，其次與膜翅目中的其他5種昆蟲聚為一支，符合分類學(xué)上的分類關(guān)系;選擇的其他昆蟲種類，半翅目的兩種昆蟲聚在一起，雙翅目、鞘翅目及鱗翅目的昆蟲也分別聚成一支，但就NOS序列而言，它們與膜翅目之間的關(guān)系尚待進(jìn)一步考量。

圖4 最大簡約法構(gòu)建的基于氨基酸序列的NOS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of NOS based on amino acid sequences by maximum parsimony method

2.4 TdNOS原核表達(dá)及蛋白表達(dá)譜

本研究克隆了TdNOS的ORF序列，且構(gòu)建重組表達(dá)載體TdNOS/pET-28a。通過SDS-PAGE電泳檢測，確定TdNOS蛋白主要存在于包涵體內(nèi)。在蛋白純化的過程中，利用200 mmol/L咪唑溶液時，目的蛋白的洗脫效果最佳(圖5: A)。獲得TdNOS特異性抗體(兔抗)，并檢測在不同滯育階段松毛蟲赤眼蜂中TdNOS蛋白的表達(dá)量(圖5: B)，Western blot測結(jié)果與qPCR檢測結(jié)果一致，在解除滯育的蛹(Dp)中TdNOS在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)量均是最高的，而在未被寄生的柞蠶卵總蛋白中則無目的蛋白條帶。

圖5 重組蛋白TdNOS的誘導(dǎo)表達(dá)(A)及Western blot分析TdNOS在不同滯育階段松毛蟲赤眼蜂中的表達(dá)量(B)Fig. 5 Induced expression of the recombinant protein TdNOS (A) and the expression levels of TdNOS in Trichogramma dendrolimi at different diapause stages detected by Western blot (B) M: 蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Protein molecular weight marker; 1, 2, 3: 用200 mmol/L咪唑洗脫純化的重組蛋白TdNOS Purified recombinant protein TdNOS eluted by 200 mmol/L imidazole. Dpre: 滯育預(yù)蛹Diapause prepupa; Dp: 滯育解除后的蛹Pupa after diapause; NDp: 正常發(fā)育的蛹Non-diapause pupa; NDpre: 正常發(fā)育的預(yù)蛹Non-diapause prepupa; AP-1, AP-2: 未被寄生柞蠶卵總蛋白的兩次生物學(xué)重復(fù)Two biological replicates of the total protein of unparasitized Antheraea pernyi egg.

2.5 TdNOS蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果

質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明本研究中純化的目的蛋白為一氧化氮合酶(NOS)，具體指標(biāo)如表3所示。

表3 質(zhì)譜鑒定TdNOS蛋白條帶結(jié)果Table 3 Identification of TdNOS protein by mass spectrometry

3 討論與結(jié)論

滯育是昆蟲中極為常見的一種現(xiàn)象，是昆蟲在長期的進(jìn)化過程中形成的，用于應(yīng)對不良環(huán)境條件的一種生存策略(Handetal., 2016)。進(jìn)入滯育的昆蟲都表現(xiàn)出相似的特性，如新陳代謝速度減慢，壽命延長，對外界的抗逆性增強(qiáng)等(Macrae, 2005; Robbinsetal., 2010)。而且區(qū)別于休眠(dormancy)，滯育昆蟲即使在外界環(huán)境恢復(fù)到適宜昆蟲生長發(fā)育時，也不會馬上解除滯育。例如：打破家蠶滯育需將其滯育卵放置5℃下低溫誘導(dǎo)2個月(Yaginumaetal., 1990)。對于夏滯育的雙色泉蠅Pegomyiabicolor而言，10℃處理45 d的時間僅有一半的滯育個體能解除滯育(李愛青和薛芳森, 2002)。松毛蟲赤眼蜂作為應(yīng)用最為成功的天敵昆蟲之一，滯育技術(shù)的成功應(yīng)用更是成為更優(yōu)的天敵昆蟲的貯藏方法，其解除滯育的條件為：3℃低溫下冷藏至少70 d (張俊杰等, 2018)。通過以上研究可知，昆蟲解除滯育的過程是一項十分耗時的過程。目前，滯育技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于天敵昆蟲工廠化生產(chǎn)中，而且解除滯育這一過程雖然可以進(jìn)一步延長昆蟲的貨架期，但是也為滯育技術(shù)的實際應(yīng)用造成了諸多的不便。因此，對于松毛蟲赤眼蜂滯育分子機(jī)制的研究，將為松毛蟲赤眼蜂的工廠化生產(chǎn)提供重要的基礎(chǔ)資料。

在本研究中，NOS的表達(dá)量在經(jīng)歷過滯育發(fā)育的松毛蟲赤眼蜂中顯著升高(圖1)，這一結(jié)果與在家蠶中的研究結(jié)果一致。通過HCl處理人為解除家蠶卵滯育，并檢測處理后的家蠶卵中NOS的表達(dá)量變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)解除滯育后家蠶卵中NOS的表達(dá)量顯著上調(diào)(Kittaetal., 2016)。在果蠅中的研究表明，在果蠅的不同發(fā)育階段，NOS起到的作用是截然相反的，在幼蟲發(fā)育階段，NOS起到抑制幼蟲生長發(fā)育的作用，在幼蟲后的發(fā)育階段則會促進(jìn)果蠅個體的發(fā)育(Jaszczaketal., 2015)。但是在本研究中，無論松毛蟲赤眼蜂是否經(jīng)歷滯育發(fā)育過程，蛹期個體(Dp/NDp)中的NOS的表達(dá)量始終高于預(yù)蛹期(Dpre/NDpre)(圖1)?；谶@一結(jié)果，作者推測NOS可能促進(jìn)松毛蟲赤眼蜂預(yù)蛹期后的個體發(fā)育，且經(jīng)過低溫處理的松毛蟲赤眼蜂體內(nèi)會進(jìn)一步促進(jìn)NOS的表達(dá)，這與經(jīng)歷過滯育的松毛蟲赤眼蜂具有更高的產(chǎn)卵能力及更優(yōu)的種群延續(xù)性(Zhangetal., 2018)相吻合。兩者之間是否存在關(guān)聯(lián)性也是本研究組后續(xù)將要關(guān)注內(nèi)容。

除此之外，通過長時間的滯育發(fā)育過程，松毛蟲赤眼蜂是否可以順利解除滯育進(jìn)入下一階段的生長發(fā)育，一直是工廠化生產(chǎn)滯育松毛蟲赤眼蜂過程中重點關(guān)注的問題之一。在本研究中，解除滯育后的松毛蟲赤眼蜂個體(DT和Dp)中，NOS的基因及蛋白的表達(dá)量均有明顯的提升(圖1; 圖5: B)，這一結(jié)果說明，在松毛蟲赤眼蜂中，NOS不僅在轉(zhuǎn)錄水平起到調(diào)控的作用，在轉(zhuǎn)錄后水平上也起到一定的調(diào)控作用。在哺乳動物中，NOS與mTOR通路緊密聯(lián)系，共同對有機(jī)體進(jìn)行調(diào)控，在個體生長發(fā)育及疾病(尤其是癌癥)的調(diào)控中有著重要的作用(Lopez-Riveraetal., 2014; Saeedietal., 2017)，但是其在昆蟲中的研究還尚未見報道。因此，本研究的數(shù)據(jù)可以為研究mTOR/NOS信號通路在昆蟲中的作用提供一定的基礎(chǔ)及思路。

綜上所述，本研究通過克隆松毛蟲赤眼蜂NOS基因cDNA序列，對不同發(fā)育階段的NOS基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，并成功制備了松毛蟲赤眼蜂特異性NOS抗體，為后續(xù)深入研究NOS在赤眼蜂及其他昆蟲滯育中的作用提供了基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。