李夢(mèng)圓, 徐金龍, 劉 詠, 王軍輝

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

花菇是一種大型真菌,素有“山珍”之稱,屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycotina),傘菌目(Agaricales),白蘑科(Tricholomataceae)。黃山花菇產(chǎn)自安徽黃山,是黃山的一大特產(chǎn),是可蔬可藥的山中珍品,其營(yíng)養(yǎng)豐富,含有多糖、氨基酸、維生素、核酸、甾醇類等多種成分。特別是花菇多糖(floral mushroom polysaccharides,FMPS)有抗瘤、抗癌、降血糖、增強(qiáng)免疫力等功效[1-2]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于FMPS的研究多集中在多糖提取方面,而對(duì)其生物活性的研究報(bào)道較少[2-4]。本課題組已經(jīng)對(duì)黃山花菇多糖的理化性質(zhì)、流變學(xué)性質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行了研究,得出其為三螺旋結(jié)構(gòu),主鏈由(1→3)-β-D-Glcp組成,在主鏈O-6的位置連有支鏈T-β-D-Glcp,溶液為假塑性流體,對(duì)于DPPH自由基和羥基自由基有很強(qiáng)的清除能力,具有一定的Fe2+螯合能力和ABTS自由基清除能力[5-6]。有報(bào)道證實(shí)硫酸基團(tuán)的加入可以改變多糖的理化性質(zhì)和鏈構(gòu)象,而且其抗腫瘤活性有明顯的增強(qiáng)[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用氯磺酸-吡啶法對(duì)FMPS進(jìn)行硫酸化修飾,通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)修飾條件進(jìn)行優(yōu)選,并用MTT法測(cè)定了硫酸化產(chǎn)物的體外抗腫瘤活性,旨在選出硫酸化修飾的最佳條件和抗腫瘤的最佳質(zhì)量濃度,為黃山花菇多糖進(jìn)一步研究和功能性食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃山花菇干品購(gòu)自安徽省黃山市,經(jīng)高速藥物粉碎機(jī)粉碎后備用;肝癌細(xì)胞株(HepG2),購(gòu)自Hyclone公司;DMEM/High-Glucose培養(yǎng)基,購(gòu)自Thermo公司;丙酮、石油醚、乙醇、氯仿、正丁醇、硼氫化鈉、氫氧化鈉、氯磺酸、二甲基甲酰胺、吡啶、明膠、氯化鋇、三氯乙酸和無(wú)水硫酸鈉等均為分析純(AR),購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

ST-16R 高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司);W201B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司);FD-1A-50 冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Nicolet 67 紅外光譜儀(Thermo公司);SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);MCO-17AIC CO2培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社);XD-202 倒置顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司);Multiskan Go 1510 酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 黃山花菇多糖的提取

稱取150 g花菇粉末,用5 L 0.05% NaBH4/5% NaOH溶液在室溫下提取2 h,2次提取后,合并濾液,用乙酸中和,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至溶液體積為300 mL,加入4倍體積的95%乙醇醇沉24 h,抽濾得沉淀,將沉淀復(fù)溶于蒸餾水,用Seveg試劑(三氯甲烷與正丁醇體積比為5∶1)脫蛋白,Seveg試劑與糖液體積比為1∶5～1∶4,重復(fù)操作幾次,直至無(wú)明顯蛋白質(zhì)析出。用分液漏斗除去蛋白質(zhì),糖液減壓蒸餾濃縮,去除三氯甲烷。加H2O2脫色3～4 h,透析,冷凍干燥,得黃山花菇多糖FMPS,提取率為4.7%。

1.4 氯磺酸吡啶法進(jìn)行多糖硫酸化

精確稱取100 mg FMPS,室溫下磁力攪拌溶于10 mL二甲基甲酰胺(DMF)中。在三口瓶中放入25 mL吡啶,加入一定體積的氯磺酸,反應(yīng)置于冰鹽浴中并不斷攪拌。充分混合后,將溶解于DMF中的多糖加入三口瓶中并移至150 ℃油浴中反應(yīng)。然后冷卻至室溫,倒入100 mL冰水中,用2.5 mol/L NaOH中和,加入95%乙醇沉淀。離心,取沉淀復(fù)溶于水中,用自來(lái)水透析2 d,再用去離子水透析1 d,冷凍干燥得黃山花菇硫酸酯化多糖(FMPS-S)[8]。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,反應(yīng)溫度、試劑的配比和反應(yīng)時(shí)間對(duì)硫酸化修飾的影響較大[9]。因此選用反應(yīng)溫度(A)、氯磺酸與吡啶的體積比(B)和反應(yīng)時(shí)間(C)作為因素,每個(gè)因素取3個(gè)水平,以硫酸基的取代度為指標(biāo),選用正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),見表1所列。

表1 因素水平

1.6 紅外光譜測(cè)定

采用溴化鉀壓片法[10],稱取1～2 mg硫酸化前和硫酸化后的多糖樣品,與溴化鉀一起研磨,混合均勻后壓片,在傅里葉紅外光譜儀上測(cè)定,掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.7 硫酸酯化多糖硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

1.7.1 硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確吸取0.6 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)Na2SO4溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL,以1 mol/L HCl溶液補(bǔ)至0.2 mL。以0.2 mL 1 mol/L的HCl溶液為空白,加入3.8 mL 3%的三氯乙酸和1 mL 5 mg/mL的氯化鋇溶液。搖勻,室溫靜置15 min后于360 nm測(cè)吸光度A1;以1 mL 5 mg/mL的明膠溶液代替5 mg/mL BaCl2溶液測(cè)吸光度A2。以硫酸基毫克數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度(A1-A2)為縱坐標(biāo),平行做3次,取平均值制作硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線[11-12],得回歸方程為:

y=0.334x-0.023 5,R2=0.998 4。

1.7.2 硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

分別稱取硫酸化前和硫酸化后樣品30 mg放入50 mL容量瓶,加入10 mL 的1 mol/L HCl溶液中,100 ℃水解3 h,冷卻后加1 mol/L HCl溶液定容至50 mL,過(guò)濾除去不溶物。取樣液0.2 mL按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測(cè)得吸光度A1、A2。根據(jù)A1-A2的數(shù)值在硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出樣品硫酸基毫克量并計(jì)算硫酸根取代度(DS)：

DS=(1.62wS)/(32-1.02wS)，

其中,wS為多糖中硫元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.8 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

取90 μL細(xì)胞液于96孔板中,細(xì)胞密度約為1×105個(gè)/mL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后,加入10 μL不同質(zhì)量濃度(20、50、100、200、500 μg/mL)的黃山花菇多糖FMPS及硫酸化后的多糖,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入20 μL 5 mg/mL的MTT試劑培養(yǎng)4 h,移去上清液,加入200 μL DMSO,振蕩10 min后用酶標(biāo)儀在570 nm下測(cè)定吸光度值。多糖對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率的計(jì)算公式為:

抑制率=[(Abs0-Abs1)/Abs0]×100%,

其中,Abs1、Abs0分別為樣品組和對(duì)照組的吸光度值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Orign 8.0軟件繪制圖表,利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,*p<0.05表示差異顯著,**p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2所列,FMPS-S2和FMPS-S5比較得出,當(dāng)試劑比例和時(shí)間一定時(shí),溫度上升時(shí)硫酸基取代度增加;從FMPS-S5和FMPS-S6得出,溫度和時(shí)間不變,吡啶量減少取代度增加;比較FMPS-S6和FMPS-S7,時(shí)間不變吡啶的量上升后取代度應(yīng)該下降,然而試驗(yàn)結(jié)果表明取代度上升,證明溫度上升時(shí)取代度上升,且溫度比試劑比例對(duì)取代度的影響更大;比較FMPS-S6和FMPS-S9,試劑比例不變,溫度上升取代度應(yīng)該上升,然而試驗(yàn)結(jié)果是取代度下降,表明時(shí)間變短取代度降低,且比溫度對(duì)取代度的影響更大。由極差R也可以得出,影響多糖FMPS硫酸酯化取代度DS的因素主次順序?yàn)镃>A>B,這和推論出的結(jié)果一致,但與文獻(xiàn)[13]得出的結(jié)論(A>C>B)有差異,這可能由于在高溫下進(jìn)行多糖硫酸化破壞了多糖的結(jié)構(gòu),使其降解,而隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,反應(yīng)物充分接觸,反應(yīng)得以完全發(fā)生,導(dǎo)致硫酸化取代度DS隨之升高,因此高溫下反應(yīng)時(shí)間開始占主導(dǎo)地位。根據(jù)取代度DS的數(shù)值可以得出FMPS硫酸酯化最佳條件為A3B2C3,即反應(yīng)溫度100 ℃,氯磺酸與吡啶的比例1∶4,反應(yīng)時(shí)間4 h,在此條件下多糖FMPS的硫酸基取代度可達(dá)到2.08。

表2 多糖FMPS硫酸酯化的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 紅外光譜分析結(jié)果

選取黃山花菇原糖和3種不同取代度的硫酸酯化多糖進(jìn)行紅外光譜測(cè)定,結(jié)果如圖1所示。FMPS的紫外圖譜在文獻(xiàn)[5]中已被分析,表明其具有多糖特征峰、無(wú)硫酸基團(tuán)。與未被硫酸化修飾的FMPS相比,3種硫酸化的多糖在3 600～3 200 cm-1、3 000～2 800 cm-1、1 400～1 000 cm-1處也出現(xiàn)了多糖的特征峰[14],并且出現(xiàn)了2個(gè)新的吸收峰。位于1 248 cm-1處的吸收峰歸因于非對(duì)稱的S=O伸縮振動(dòng);位于810 cm-1處的吸收峰是C—O—S的對(duì)稱振動(dòng)峰[15-16]。紅外光譜圖表明FMPS的硫酸化修飾成功,進(jìn)一步證實(shí)了—OSO3-1基團(tuán)的加入。

圖1 不同硫酸基黃山花姑多糖的紅外光譜圖

2.3 抗腫瘤活性結(jié)果

抗腫瘤活性結(jié)果如圖2所示,從圖2可以看出，所有黃山花菇多糖對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2都有一定的抑制作用,在相同質(zhì)量濃度下硫酸酯化黃山花菇多糖FMPS-S對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制活性明顯高于黃山花菇多糖FMPS。不同的硫酸化修飾黃山花菇多糖的抑制活性與質(zhì)量濃度表現(xiàn)出不同的相互關(guān)系,FMPS-S2、FMPS-S3、FMPS-S4、FMPS-S5和FMPS-S8對(duì)HepG2的抑制活性隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),在質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)達(dá)到最大,抑制率分別為42.30%、9.95%、17.27%、16.25%、33.81%。FMPS-S1和FMPS-S9對(duì)HepG2的抑制活性隨著質(zhì)量濃度的增加先增強(qiáng)后減弱,在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)具有最大活性,抑制率為8.25%和25.30%。FMPS-S6和FMPS-S7對(duì)HepG2的抑制活性隨著質(zhì)量濃度的增加先增強(qiáng)后減弱,在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)具有最大活性,抑制率達(dá)到19.82%和16.44%。從圖2還可以看出,FMPS-S2在各個(gè)質(zhì)量濃度下均有最好的腫瘤抑制活性,其硫酸基取代度為1.90,并不是所有硫酸化多糖中最高的,表明FMPS-S2有一個(gè)最佳的取代度以使其具有最好的腫瘤抑制活性。綜上所述,硫酸基取代度有一個(gè)最佳值，而不是越高越好,不同硫酸化條件得到的硫酸化黃山花菇多糖表現(xiàn)出最高抗腫瘤活性的最適質(zhì)量濃度不同。

圖2 FMPS和FMPS-S對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的體外抑制作用

3 結(jié) 論

從正交試驗(yàn)結(jié)果可以得出硫酸化修飾的最佳反應(yīng)條件如下:反應(yīng)溫度為100 ℃,氯磺酸與吡啶的比例為1∶4,反應(yīng)時(shí)間為4 h,在該條件下黃山花菇多糖FMPS的硫酸基取代度可以達(dá)到最大值。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FMPS具有一定的抗腫瘤活性,硫酸化修飾使FMPS的抗腫瘤活性進(jìn)一步提高,并且不同硫酸基取代度黃山花菇多糖的抗腫瘤活性表現(xiàn)出不同的質(zhì)量濃度依賴性。