范志宇 陳萌萌 胡波

摘要：為深入研究國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并鑒定的兔出血癥病毒2型（RHDV2）四川分離株SC2020/04的致病性，用SC2020/04 RHDV2分離株，以皮下注射方式感染25日齡仔兔和4月齡成年兔，記錄家兔發(fā)病情況，對(duì)病死兔進(jìn)行剖檢，并取肝臟樣品進(jìn)行血凝（HA）和核酸檢測(cè)，取心、肝、脾、肺、腎、十二指腸等組織制作病理切片，進(jìn)行病理學(xué)研究。試驗(yàn)結(jié)果顯示，感染后仔兔18 h出現(xiàn)死亡，成年兔40 h出現(xiàn)死亡，死亡率均為5/5;感染后試驗(yàn)兔出現(xiàn)典型兔瘟臨床癥狀，瀕死時(shí)四肢抽搐、角弓反張，部分死亡兔可見口鼻流出紅色血液;剖檢主要病變?yōu)楦闻K腫大并伴有明顯的小葉樣改變，脾腫大，肺、肝、脾和腎出現(xiàn)充血和彌漫性瘀點(diǎn)出血，腹腔內(nèi)有血樣滲出物;血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示，病死仔兔和成年兔肝臟血凝效價(jià)沒有明顯差異;采用鑒別經(jīng)典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法檢測(cè)攻毒死亡兔肝臟樣品，結(jié)果顯示為RHDV2陽(yáng)性;病理學(xué)觀察可見多臟器嚴(yán)重出血、腫脹，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)，病死仔兔十二指腸組織嚴(yán)重糜爛，成年兔十二指腸病變較輕。本研究對(duì)我國(guó)首個(gè)RHDV2毒株進(jìn)行了致病性初探和病理學(xué)觀察，研究結(jié)果可以為RHDV2疫苗研發(fā)和致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒2型;臨床癥狀;剖檢病變;病理學(xué)觀察

中圖分類號(hào)： S855.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）11-0143-05

收稿日期：2020-05-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD0502203）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（編號(hào)：CARS-43-C-1）。

作者簡(jiǎn)介：范志宇（1982—），男，山西太谷人，博士，副研究員，主要從事家兔疫病防控技術(shù)研究，E-mail：fanzhiyu2007@163.com;共同第一作者：陳萌萌（1987—），女，江蘇連云港人，博士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術(shù)研究，E-mail：moonchen2010@yeah.net。

通信作者：王 芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疫病致病機(jī)制及防控技術(shù)研究。E-mail：rwangfang@126.com。 ?兔出血癥（rabbit hemorrhagic disease，簡(jiǎn)稱“RHD”）俗稱“兔瘟”，是由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，簡(jiǎn)稱“RHDV”）引起的一種急性、烈性、高致死性傳染病。經(jīng)典RHDV只感染家兔，2月齡以上家兔易感，病死率可達(dá)90%，常于感染后48～72 h死亡，死亡兔以呼吸系統(tǒng)和肝、脾、腎、心等實(shí)質(zhì)臟器瘀血、腫大和出血為特征，幼兔不易感[1]。2010年，在法國(guó)首次發(fā)現(xiàn)了RHDV的新毒株，命名為RHDV2或RHDVb，隨后該毒株蔓延到意大利、西班牙、葡萄牙、英格蘭、蘇格蘭和德國(guó)，在歐洲RHDV2取代經(jīng)典RHDV的趨勢(shì)正在擴(kuò)大[2-3]。在澳大利亞和亞速爾群島也有檢測(cè)到RHDV2的相關(guān)報(bào)道[4-5]。2020年4月，我國(guó)四川省發(fā)生疑似病例，經(jīng)多種檢測(cè)方法確定病原為RHDV2[6]，這是我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)RHDV2型毒株[7]，由此可見，RHDV2的流行趨勢(shì)正在世界范圍內(nèi)逐步擴(kuò)大。據(jù)OIE數(shù)據(jù)報(bào)道，當(dāng)感染RHDV2時(shí)，7～15日齡的幼齡動(dòng)物中也可以觀察到明顯的臨床癥狀和死亡，病死率可達(dá)90%。為了掌握我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的RHDV2型毒株的致病性和攻毒動(dòng)物發(fā)病特征，本研究以25日齡仔兔和4月齡成年兔為攻毒對(duì)象，觀察攻毒后試驗(yàn)兔的臨床癥狀、剖檢病變以及病理學(xué)變化，以期為RHDV2疫苗研發(fā)和致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

含兔出血癥病毒2型病死兔肝臟由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所兔病學(xué)科團(tuán)隊(duì)鑒定并保存[6]，命名為SC2020/04（GenBank登錄號(hào)：MT383749）;經(jīng)典兔出血癥病毒對(duì)照RHDV皖阜株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;陰性肝臟來(lái)自邳州市東方養(yǎng)殖有限公司的SPF兔。實(shí)驗(yàn)兔購(gòu)自江蘇省明天農(nóng)牧科技有限公司，合格證號(hào)NO.202004338。

1.2 分離株感染試驗(yàn)

1.2.1 感染用病毒制備 在生物安全柜中，剔除含RHDV2病死兔肝臟上結(jié)締組織，取少許肝臟，加入PBS后勻漿，使勻漿中含肝臟質(zhì)量（g） ∶ PBS的體積（mL）為1 ∶ 10，反復(fù)凍融3次，以8 000 r/min離心30 min，取上清用0.22 μm濾器進(jìn)行除菌，標(biāo)記為SC2020F1備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)管理 實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)于負(fù)壓強(qiáng)毒攻毒動(dòng)物房，試驗(yàn)過(guò)程中注意人員的防護(hù)，產(chǎn)生的垃圾和動(dòng)物尸體等經(jīng)高壓滅菌后無(wú)害化處理，試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)環(huán)境進(jìn)行徹底消毒。動(dòng)物處理詳見《病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程》（GB 16548—2006）。

1.2.3 感染試驗(yàn)觀察及取樣 將5只25日齡仔兔和5只4月齡成年兔分別頸部皮下注射SC2020F1，1 mL/只，使用監(jiān)控設(shè)備觀察發(fā)病死亡情況，及時(shí)剖檢死亡兔并無(wú)菌取相關(guān)組織器官備用。

1.3 微量血凝試驗(yàn)

取病死兔少許肝臟樣品，剪碎，按1 g ∶ 10 mL加入PBS后勻漿，反復(fù)凍融3次，以8 000 r/min離心 30 min，取上清進(jìn)行微量血凝試驗(yàn)，具體參照《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法》（NY/T 572—2016）。

1.4 死亡兔核酸鑒定

將死亡兔肝臟樣品與DEPC水按1 g ∶ 10 mL比例研磨成懸液，離心取上清，按照Trizol法提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得病毒cDNA，用筆者所在實(shí)驗(yàn)室建立的鑒別經(jīng)典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法，以cDNA為模板，進(jìn)行兔出血癥病毒VP60基因片段的擴(kuò)增。經(jīng)典RHDV擴(kuò)增產(chǎn)物大小為193 bp，RHDV2擴(kuò)增產(chǎn)物大小為829 bp。

1.5 病理學(xué)觀察

將無(wú)菌采集的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸等組織器官浸入4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋、切片，進(jìn)行H.E染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化并拍照;以無(wú)菌采集安樂(lè)死后健康25日齡仔兔和4月齡成年兔正常組織制作病理切片作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

通過(guò)監(jiān)控觀察發(fā)現(xiàn)，攻毒兔在注射病毒后12 h內(nèi)有少量的采食和飲水行為，之后攻毒仔兔食欲、飲欲基本廢絕，成年兔采食和飲水次數(shù)比仔兔稍多，但采食量明顯下降，直至死亡。攻毒兔死亡前幾小時(shí)精神沉郁、呼吸困難、反應(yīng)遲鈍，最緊急的病例在癥狀出現(xiàn)后1～2 h內(nèi)迅速死亡，瀕死前表現(xiàn)有短暫的興奮，突然倒地，劃動(dòng)四肢呈游泳狀，瀕死時(shí)四肢抽搐，用力蹬后肢，角弓反張，部分死亡兔可見口鼻流出紅色血液（圖1），肛門松馳，肛周有少量淡黃色黏液和糞便附著。

2.2 剖檢病變

剖檢可見各臟器有不同程度的腫脹、充血、出血，尤其是胸腺、肺臟、肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重出血。鼻腔、喉頭和氣管黏膜、氣管環(huán)瘀血、出血，氣管和支氣管內(nèi)有泡沫狀血液;胸腺出血，散在針頭大出血點(diǎn);肺有不同程度充血、瘀血、水腫，切開肺臟流出多量紅色泡沫狀液體;肝臟瘀血、腫大、質(zhì)脆，表面發(fā)黃，切面粗糙，切開流出大量暗紅色血液;脾臟瘀血、腫大，呈暗紅色;腎臟腫大，并見有大小不等的出血點(diǎn)，呈黑紫色;膀胱積尿，內(nèi)充滿黃褐色尿液，部分病例尿液中混有絮狀凝塊。血液凝固不良，攻毒兔死亡后肺臟、肝臟等依然出血，胸腔和腹腔可見有未凝固的血液，死亡時(shí)間較長(zhǎng)的在胸腔和腹腔有血凝塊（圖2）。

2.3 微量血凝試驗(yàn)

頸部皮下注射SC2020F1毒株的10只家兔全部在72 h內(nèi)死亡。用微量血凝試驗(yàn)測(cè)定不同時(shí)間死亡的攻毒兔肝臟樣本血凝效價(jià)。結(jié)果顯示仔兔死亡時(shí)間明顯早于成年兔，死亡更快，病死仔兔和成年兔肝臟血凝效價(jià)沒有明顯差異（表1）。

2.4 核酸鑒定

以病毒cDNA為模板，使用經(jīng)典RHDV/RHDV2鑒別引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，10個(gè)攻毒死亡兔肝臟樣品在829 bp位置均出現(xiàn)單一的RHDV2的特異

性條帶，在193 bp位置未出現(xiàn)經(jīng)典RHDV特異性條帶（圖3）。說(shuō)明本試驗(yàn)攻毒死亡兔全部由于感染RHDV2死亡，且沒有污染經(jīng)典RHDV。

2.5 病理變化

對(duì)死亡仔兔和成年兔各臟器做石蠟切片，染色觀察結(jié)果見圖4和圖5。

攻毒死亡仔兔肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)不甚清晰，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞胞核染色質(zhì)邊集，較多肝細(xì)胞胞質(zhì)中可見大小不一的脂肪空泡（圖4-E 綠色箭頭）; 較多肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，胞核碎裂、消失;個(gè)別匯管區(qū)周圍可見結(jié)締組織增生（圖4-E 藍(lán)色箭頭）。脾臟組織白髓數(shù)量明顯減少，殘留的白髓體積大小不一（圖4-D 黑色箭頭）;紅髓正常結(jié)構(gòu)消失，大量纖維組織增生（圖4-D 綠色箭頭），缺少紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。肺臟組織局部支氣管黏膜可見水腫和毛細(xì)血管充血，伴散在的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);可見

少數(shù)幾處肺泡腔出血（圖4-C黑色箭頭）。腎小球毛細(xì)血管瘀血，少量毛細(xì)血管袢玻璃樣變（圖4-B綠色箭頭）;少量腎小管壞死（圖4-B紅色箭頭）;多數(shù)腎小管可見刷狀緣脫落（圖4-B黃色箭頭）。十二指腸組織嚴(yán)重糜爛，黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落（圖4-A 綠色箭頭），固有層裸露，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張（圖4-A黑色箭頭）;較多腺體結(jié)構(gòu)消失（圖4-A藍(lán)色箭頭）;固有層底部可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4-A 黃色箭頭），心臟未見明顯病變。仔兔與成年兔主要組織病理學(xué)差異是僅在仔兔中發(fā)現(xiàn)腸道病變。

攻毒死亡成年兔肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)不甚清晰，較多肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死（圖5-E黑色箭頭），胞核碎裂、消失;少量肝竇可見瘀血、出血;匯管區(qū)局部可見結(jié)締組織增生，伴散在的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5-E綠色箭頭）。脾臟組織白髓數(shù)量明顯減少，殘留的白髓體積減小（圖5-D黑色箭頭）;紅髓正常結(jié)構(gòu)消失，可見大量嗜酸性纖維樣物質(zhì)。肺細(xì)支氣管中可見巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5-C 藍(lán)色箭頭）;廣泛肺泡腔輕度增厚（圖5-C黑色箭頭）;小血管周圍可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5-C綠色箭頭），有的可見血栓形成（圖5-C黃色箭頭）。腎小球毛細(xì)血管瘀血，少量毛細(xì)血管袢玻璃樣變（圖5-B綠色箭頭）;少量腎小管壞死（圖5-B紅色箭頭）;多數(shù)腎小管可見刷狀緣脫落，少量腎小管中可見嗜酸性細(xì)顆粒狀物質(zhì)。十二指腸（圖5-A）和心臟（圖5-F）未發(fā)現(xiàn)明顯病變。

3 討論

在本研究中，中國(guó)分離株SC2020/04（RHDV2/GI.2）引起的臨床癥狀和剖檢病變與GI.1毒株引起的經(jīng)典RHD非常相似，主要區(qū)別是40日齡以下家兔對(duì)經(jīng)典RHDV不易感，哺乳仔兔不發(fā)病[8]，而RHDV2可引起仔兔發(fā)病死亡，OIE出版的《陸生動(dòng)物疫苗和診斷手冊(cè)》指出7～15日齡的幼齡動(dòng)物中可以觀察到明顯的臨床癥狀和死亡率，Dalton KP等[9]研究發(fā)現(xiàn)，RHDV2對(duì)11日齡及以上家兔即可感染致死，死亡兔伴有黃疸癥狀，但是SC2020/04毒株攻毒死亡兔并未發(fā)現(xiàn)有黃疸癥狀，可能與毒株致病力相關(guān)。與GI.1毒株相比，Dalton KP等[9]和le Gall-Recule等[10]研究指出GI.2可引起幼兔死亡，死亡率可達(dá)50%，OIE官方數(shù)據(jù)病死率可達(dá)90%。本研究結(jié)果顯示，仔兔和成年兔均在72 h以內(nèi)全部死亡，仔兔平均死亡時(shí)間為25.6 h，成年兔平均死亡時(shí)間為54.8 h，死亡率均為5/5，說(shuō)明SC2020/04毒株比歐洲較早報(bào)道的GI.2菌株致病性更強(qiáng)。因此，可以推測(cè)，SC2020/04毒株一旦在中國(guó)流行，將對(duì)養(yǎng)兔業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重危害甚至造成毀滅性打擊，相關(guān)疫苗研究刻不容緩。

RHDV作為一種嗜肝病毒，對(duì)肝臟組織具有明顯的致病作用。與以往所有關(guān)于RHD的研究一致，肝臟是SC2020/04的靶器官，表現(xiàn)出嚴(yán)重的病理?yè)p傷，組織肝小葉結(jié)構(gòu)不甚清晰，較多肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞

死，胞核碎裂、消失?？傊?，在仔兔和成年兔引起了與GI.1病毒相同的肝損傷。在成年兔和仔兔脾臟組織白髓數(shù)量明顯減少，殘留的白髓體積大小不一，這可能與病毒感染造成的淋巴細(xì)胞減少有關(guān)。Marques等發(fā)現(xiàn)感染兔肝臟和脾臟的淋巴細(xì)胞明顯減少[11]，Teixeira等也發(fā)現(xiàn)成年兔急性RHDV致死性感染中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也減少[12]。另外，仔兔和成年兔組織病理病變的主要差異是仔兔的十二指腸有明顯的病理?yè)p傷，而成年家兔不明顯，這可能與病毒受體表達(dá)、仔兔先天性免疫和腸道功能的改變有關(guān)[13-15]。

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