霍博，丁元鈞，蔡婧，張美霞

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西西安710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，陜西西安710032；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院護(hù)理部，陜西西安710032

前言

糖尿病是一種以機(jī)體葡萄糖代謝失衡為主要表現(xiàn)的代謝性的臨床疾病。全球約有超過4.2 億人飽受糖尿病折磨，而預(yù)期到2030年全球的糖尿病患者可能達(dá)到8 億多人。糖尿病主要包括1 型糖尿病和2型糖尿病兩類，其中2型糖尿病的患者人數(shù)占糖尿病總?cè)藬?shù)約90%。2 型糖尿病與遺傳學(xué)因素、生活方式和飲食結(jié)構(gòu)改變等密切相關(guān)，多發(fā)生于中老年人群［1‐2］。隨著我國人口老齡化進(jìn)程的加劇，2型糖尿病患者的人數(shù)也在逐年增加。2 型糖尿病潰瘍及創(chuàng)傷愈合困難問題一直是臨床上最為棘手的問題，嚴(yán)重影響著病患的生理和心理健康［3‐4］。而目前臨床上尚缺乏安全有效的加速2 型糖尿病組織損傷修復(fù)的治療方法。 低強(qiáng)度的脈沖電磁場（Pulsed Electromagnetic Fields,PEMF）作為一種安全、有效的物理治療方法，已于20 世紀(jì)80年代開始應(yīng)用于臨床骨折及骨不連的治療［5］。近年來的臨床和動物實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)，PEMF 能夠加速軟組織損傷的修復(fù)和愈合進(jìn)程［6‐7］。也有研究發(fā)現(xiàn)，PEMF對于鏈脲佐菌素誘發(fā)的1 型糖尿病軟組織損傷修復(fù)具有積極效果［8‐9］。但是，PEMF 對于人口比例最大的2 型糖尿病軟組織損傷的作用效果如何國內(nèi)外尚未見研究報道。在本研究中，通過使用瘦素受體缺陷誘導(dǎo)的自發(fā)型2型糖尿病db/db 小鼠，系統(tǒng)探究低強(qiáng)度PEMF 對于2 型糖尿病組織損傷修復(fù)的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

3月齡雄性2 型糖尿病db/db 小鼠（C57BKS 背景，BKS.Cg‐m+/+Leprdb/J）及與其同背景的野生型小鼠（美國Jackson lab）；用于麻醉的戊巴比妥鈉緩沖液（美國Sigma 公司）；便攜式血糖儀（美國Johnson ＆Johnson 公司）；生物組織力學(xué)測試系統(tǒng)（東莞昆侖儀器有限公司）；數(shù)碼照相機(jī)（日本Canon公司）；組織切片機(jī)（德國Leica 公司）；高斯計（美國Lakeshore 公司）；ELISA試劑盒（武漢華美生物公司）；有機(jī)玻璃小鼠飼養(yǎng)籠（電磁場研究專用），課題組自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計和分組

本研究中涉及的動物實(shí)驗(yàn)程序均由空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會授權(quán)批準(zhǔn)。動物飼養(yǎng)于恒定溫度（23 ℃）、濕度（50%～60%）和12 h/12 h光‐暗循環(huán)的房間內(nèi)。在整個實(shí)驗(yàn)期間，所有動物均可隨意攝取干凈自來水和標(biāo)準(zhǔn)鼠糧。動物適應(yīng)環(huán)境1周后，通過尾靜脈取血，使用血糖儀測量db/db 小鼠的隨機(jī)血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L的小鼠被納入實(shí)驗(yàn)。整個實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為Wild type野生型小鼠組（Wild type）、db/db小鼠組（db/db）及db/db施加以PEMF刺激組（db/db+PEMF），每組16只。分別于創(chuàng)傷模型構(gòu)建的第5、12、19天處死每組的4只小鼠，每組剩余的4只小鼠于傷口完全愈合的時間點(diǎn)處死。全部3組小鼠均構(gòu)建背部表皮創(chuàng)傷模型，僅db/db+PEMF組小鼠施加以全身的PEMF刺激，每天刺激2 h。

1.3 背部軟組織創(chuàng)傷模型的構(gòu)建

使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并用酒精刮除和清潔其背部。使用皮膚活檢針在每只小鼠的背部構(gòu)建直徑為1 cm 的圓形傷口，充分分離皮膚、皮下組織和肌纖膜組織，并覆蓋Tegaderm 透明傷口敷料，以保持傷口濕潤。術(shù)后注射青鏈霉素合劑以防止感染的發(fā)生。

1.4 低強(qiáng)度PEMF發(fā)生裝置

PEMF 發(fā)生裝置為課題組自行研制，整個系統(tǒng)主要包括電磁信號發(fā)生器和3‐Helmholtz線圈系統(tǒng)兩部分。PEMF 波形脈沖群波形，頻率為15 Hz，該波形已在課題組的先前研究中廣泛使用，且其對于機(jī)體的積極作用效果也已被大量研究證實(shí)［10‐12］。3 個線圈（直徑80 cm）同軸放置，彼此相距30.4 cm，中心線圈和外部線圈的匝數(shù)分別為266 和500，該三線圈結(jié)構(gòu)比兩個線圈的組裝具有更高的磁場均勻性［10］。塑料籠的底部與線圈的中心對齊，以確保小鼠位于電磁場的中心位置。使用高斯計測量線圈中的電磁場強(qiáng)度，線圈中的峰值磁場強(qiáng)度為2.0 mT，而背景電磁場為（50±2）μT。

1.5 傷口閉合率的檢測分析

使用數(shù)碼相機(jī)拍攝各時間點(diǎn)小鼠傷口。在拍攝照片前，動物被固定在觀察臺上，相機(jī)放置于觀察臺上方20 cm 處，數(shù)碼照片的水平和垂直分辨率分別為2 600 和2 000 像素。使用Matlab 軟件對傷口面積進(jìn)行分析計算。利用顏色閾值、邊緣提取等多種圖像分析算法對目標(biāo)信息進(jìn)行識別和提取。傷口愈合率作為評價傷口愈合過程的標(biāo)準(zhǔn)，按以下公式表示：傷口愈合率=（第0 天的原始傷口面積‐第n 天的傷口面積）/第0天的原始傷口面積。

1.6 傷口組織抗張強(qiáng)度、傷口組織病理和ELISA 檢測分析

在每個時間點(diǎn)的動物處死后，組織樣本被切成3塊：一塊用于生物力學(xué)測試，一塊用于組織病理性檢測分析，另一塊用于ELISA 檢測。將用于評估傷口抗張強(qiáng)度的組織樣本修剪成8 mm×8 mm 的方形條帶。實(shí)驗(yàn)前，將樣品浸泡在生理鹽水溶液中，以避免組織性能發(fā)生變化。采用生物力學(xué)材料測試系統(tǒng)進(jìn)行組織拉伸實(shí)驗(yàn)。皮膚條固定在張力計的兩個夾子之間，傷口部位位于兩個夾子的中線處。通過兩個夾鉗的20 mm/min移動，向條帶施加拉力。當(dāng)觀察到試樣的最終破裂時，記錄最大斷裂載荷。組織學(xué)研究的傷口標(biāo)本固定于10%中性福爾馬林中，隨后進(jìn)行石蠟包埋，用鋸片切片機(jī)切割5 μm 厚的切片。切片脫皮復(fù)水，梅耶爾蘇木精伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察載玻片。ELISA 檢測使用武漢華美生物公司的ELISA 商業(yè)試劑盒，檢測指標(biāo)分別為IL‐1β、TNF‐α、ⅤEGF 和IGF‐1，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒的說明執(zhí)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

使用Microsoft SPSS 22.0 計算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（ANOⅤA）評估3 組之間的差異。一旦發(fā)現(xiàn)顯著性差異，采用確定Benferoni 檢驗(yàn)確定兩組之間的差異顯著性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低強(qiáng)度的全身PEMF 刺激對于db/db 小鼠血糖和體質(zhì)量的影響

3組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建后的第5、12、19天的體質(zhì)量和血糖水平如圖1所示。db/db 組和db/db+PEMF組小鼠的體質(zhì)量值在術(shù)后的第5、12、19天均顯著高于Wild type 組小鼠（P＜0.01），但是db/db 組和db/db+PEMF 組小鼠的體質(zhì)量值在各時間點(diǎn)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與Wild type 組小鼠相比，db/db組和db/db+PEMF組小鼠的血糖值在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著升高（P＜0.01），但是db/db 組和db/db+PEMF 組小鼠的血糖值在各時間點(diǎn)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果顯示，低強(qiáng)度的全身PEMF 刺激并未對db/db小鼠的體質(zhì)量和血糖產(chǎn)生顯著性影響。

圖1 PEMF刺激對于db/db小鼠血糖和體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of pulsed electromagnetic field(PEMF)stimulation on blood glucose and body weight in db/db mice

2.2 低強(qiáng)度的全身PEMF 刺激對于db/db 小鼠傷口愈合速率和總愈合時間的影響

3組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建后的第5、12、19天的傷口愈合率以及傷口組織的創(chuàng)傷總愈合時間如圖2所示。結(jié)果顯示，2型糖尿病的db/db組在術(shù)后的第5、12、19 天的傷口愈合率均顯著低于Wild type 組（P＜0.01），而db/db+PEMF 組小鼠的傷口愈合率在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著高于db/db 組（分別增加101.9%、47.1%和39.4%）。db/db 組的創(chuàng)傷總愈合時間相比于Wild type 組增加了74.2%，而PEMF 刺激顯著降低了db/db 小鼠的傷口總愈合時間（總愈合時間減少31.3%）。

2.3 低強(qiáng)度的全身PEMF 刺激對于db/db 小鼠傷口組織抗張強(qiáng)度的影響

3組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建后的第5、12、19天的傷口組織抗張強(qiáng)度如圖3所示。結(jié)果顯示，db/db組小鼠創(chuàng)傷組織的生物力學(xué)的抗張強(qiáng)度在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著低于Wild type 組（P＜0.01），而db/db+PEMF 組小鼠的創(chuàng)傷組織的生物力學(xué)的抗張強(qiáng)度在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著高于db/db 組（分別增加97.8%、58.3%和69.2%）。

2.4 低強(qiáng)度的全身PEMF 刺激對于db/db 小鼠傷口組織病理學(xué)的影響

3 組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建后的第12 天的傷口組織病理性結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，db/db 組小鼠的組織創(chuàng)傷位置在術(shù)后的第12天仍可見大量的炎性細(xì)胞聚集，而Wild type 組小鼠的組織創(chuàng)傷位置的炎性細(xì)胞數(shù)量較少。而經(jīng)過低強(qiáng)度的PEMF 治療12 d 后，db/db 小鼠的組織創(chuàng)傷位置的炎性細(xì)胞在術(shù)后12 d顯著減少。

圖2 PEMF刺激對于db/db小鼠傷口愈合速率和總愈合時間的影響Fig.2 Effects of PEMF stimulation on the wound healing rate and overall wound healing period in db/db mice

圖3 PEMF刺激對于db/db小鼠傷口組織抗張強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of PEMF stimulation on the wound tensile strength in db/db mice

2.5 低強(qiáng)度PEMF 刺激對于db/db 小鼠傷口組織中重要細(xì)胞因子表達(dá)的影響

3組小鼠在組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建后的第5、12、19天的傷口組織中重要細(xì)胞因子表達(dá)水平如圖5所示。ELISA 結(jié)果顯示，Wild type 組的炎癥相關(guān)因子IL‐1β和TNF‐α 的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出先增后減的變化趨勢（以第12天最高）。而db/db組的IL‐1β和TNF‐α的蛋白表達(dá)水平在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著高于Wild type 組（P＜0.01）。而db/db+PEMF 組的IL‐1β 和TNF‐α 表達(dá)水平在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著低于db/db 組（P＜0.05），并且db/db 組和db/db+PEMF 組的IL‐1β 和TNF‐α 的表達(dá)水平在術(shù)后的第5、12、19 天無統(tǒng)計學(xué)差異。ELISA 結(jié)果進(jìn)一步顯示，db/db 組的ⅤEGF 和IGF‐1 的表達(dá)水平在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著低于Wild type 組（P＜0.01），而db/db+PEMF 組的ⅤEGF 和IGF‐1 表達(dá)水平在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著高于db/db組（P＜0.05）。

圖4 PEMF刺激對于db/db小鼠傷口組織病理學(xué)的影響（術(shù)后12 d，40倍鏡）Fig.4 Histopathological effects of PEMF stimulation on the wound tissues in db/db mice (on the 12nd day postoperatively,with 40×objective)

3 討論

3.1 PEMF 顯著改善db/db 小鼠創(chuàng)傷愈合能力，且與其對糖尿病體征的影響無關(guān)

圖5 通過ELISA檢測PEMF對db/db小鼠傷口組織中重要細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.5 Effects of PEMF stimulation on the expressions of critical cytokines in the wound tissues in db/db mice based on ELISA assay

目前糖尿病軟組織損傷的動物實(shí)驗(yàn)大多使用腹腔注射鏈脲佐菌素的方式構(gòu)建糖尿病動物模型，但是該方法構(gòu)建的糖尿病模型為典型的1 型糖尿病體征。在本研究中使用db/db小鼠作為2型糖尿病動物模型。db/db 小鼠是一種全身性瘦素受體缺陷小鼠，表現(xiàn)為攝食過度、肥胖、高血糖和高胰島素血癥等典型的2 型糖尿病體征。db/db 小鼠也是目前研究2 型糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥（如心血管疾病、腎病、神經(jīng)病變、骨骼肌病變、潰瘍等）最為理想的動物模型［13‐14］。

本文研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病的db/db 小鼠相比于非糖尿病小鼠在軟組織損傷模型構(gòu)建的第5、12、19天表現(xiàn)出傷口愈合修復(fù)的顯著延遲，并且db/db 小鼠的創(chuàng)傷總愈合時間也相比于非糖尿病小鼠顯著延長。上述特征與臨床上的2 型糖尿病患者的軟組織創(chuàng)傷愈合特征相似。本研究也進(jìn)一步揭示，低強(qiáng)度的PEMF 刺激從術(shù)后的第5 天開始即顯著加速了db/db小鼠軟組織創(chuàng)傷的修復(fù)進(jìn)程，使2型糖尿病的創(chuàng)傷修復(fù)速率進(jìn)程與非糖尿病小鼠類似，并且PEMF 將2型糖尿病小鼠的創(chuàng)傷總愈合時間縮短約30%。同時研究也發(fā)現(xiàn)，在治療的全過程中PEMF 并未對db/db小鼠的血糖和體質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，提示PEMF 對2型糖尿病動物軟組織損傷的修復(fù)效應(yīng)與其對糖尿病體征的影響無關(guān)。

3.2 PEMF 改善db/db 小鼠軟組織抗張強(qiáng)度，揭示了對膠原結(jié)構(gòu)的潛在優(yōu)化效應(yīng)

軟組織的抗張強(qiáng)度是評價傷口愈合的重要生物力學(xué)指標(biāo)，能夠反映新合成和沉積的膠原蛋白的數(shù)量、質(zhì)量和排列結(jié)構(gòu)特性［15］。在傷口愈合過程中，隨著組織的持續(xù)修復(fù)，皮膚的抗張強(qiáng)度會逐漸增加。本研究的生物力學(xué)檢測結(jié)果表明，2 型糖尿病大鼠在整個創(chuàng)面愈合全過程中，其軟組織的抗張強(qiáng)度明顯低于正常大鼠。先前的動物實(shí)驗(yàn)研究也報道了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［16］。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度的PEMF刺激在軟組織損傷模型構(gòu)建的第5、12、19天均顯著提升了db/db 小鼠軟組織的生物力學(xué)抗張強(qiáng)度。研究表明，PEMF 對于提升2 型糖尿病動物的膠原纖維數(shù)量、加速膠原纖維沉積、促進(jìn)膠原纖維的排布和定位具有積極效應(yīng)，從而有助于改善2型糖尿病軟組織的修復(fù)速率和修復(fù)質(zhì)量。

3.3 PEMF 抑制db/db 小鼠傷口組織炎性因子表達(dá)、促進(jìn)血管新生細(xì)胞因子表達(dá)

傷口愈合是一個系列化的復(fù)雜事件，涉及到成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的合作和相互作用［17］。組織病理學(xué)染色結(jié)果顯示，2 型糖尿病db/db 小鼠在組織損傷的修復(fù)進(jìn)程中（術(shù)后12 d）其炎性細(xì)胞數(shù)量顯著多于非糖尿病小鼠。本研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病小鼠在軟組織創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)相比于非糖尿病小鼠更為嚴(yán)重，而這種更為劇烈的炎性反應(yīng)也會進(jìn)一步阻礙軟組織的創(chuàng)傷修復(fù)進(jìn)程。ELISA 結(jié)果也進(jìn)一步揭示了2 型糖尿病db/db 小鼠損傷軟組織中促炎性因子IL‐1β 和TNF‐α的表達(dá)在術(shù)后的第5、12、19 天相比于非糖尿病小鼠均顯著增加。而組織病理性結(jié)果和ELISA 結(jié)果均揭示，低強(qiáng)度的PEMF刺激在組織創(chuàng)傷愈合的各階段均能夠抑制2型糖尿病小鼠的過度炎性反應(yīng)，從而在促進(jìn)db/db小鼠的組織損傷愈合中發(fā)揮積極效應(yīng)。

血管內(nèi)皮生長因子ⅤEGF 是一種組織創(chuàng)傷愈合的重要細(xì)胞因子，它參與血管生成并使毛細(xì)血管通透性增加，能夠反映創(chuàng)傷修復(fù)過程中的血管再生情況［18］。ELISA 結(jié)果顯示，db/db 小鼠損傷軟組織中的ⅤEGF表達(dá)水平在術(shù)后的第5、12、19天均顯著低于正常小鼠，提示2型糖尿病破壞了組織損傷修復(fù)過程中的血管再生能力。而PEMF刺激在術(shù)后的第5、12、19天均顯著增加了db/db 小鼠損傷組織中的ⅤEGF 表達(dá)，提示PEMF具有顯著的促新生血管再生潛能。其次，胰島素樣生長因子IGF‐1 作為機(jī)體中最重要的促組織生長和修復(fù)因子，而IGF‐1 同樣具有促血管再生的作用［19］。筆者同樣發(fā)現(xiàn)其在db/db 小鼠損傷軟組織中表達(dá)顯著降低。而本研究也發(fā)現(xiàn)，PEMF 治療在術(shù)后的第5、12、19 天均能夠顯著提升2 型糖尿病小鼠軟組織中的IGF‐1 表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)PEMF 的促組織再生和促血管新生的潛能。

3.4 結(jié)論

綜上所述，本研究首次揭示了低強(qiáng)度PEMF能夠顯著加速2型糖尿病db/db小鼠的軟組織修復(fù)速率并改善組織的生物力學(xué)彈性屬性，這一效應(yīng)可能與PEMF 的抗炎性反應(yīng)及促血管再生具有密切關(guān)系。本研究結(jié)果提示，低強(qiáng)度PEMF 作為一種安全、經(jīng)濟(jì)的物理作用方式，有望成為臨床治療2型糖尿病組織創(chuàng)傷愈合困難這一棘手問題的新治療手段。