高興祥，張悅麗，李美，李健，房鋒

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，濟(jì)南 250100）

0 引言

【研究意義】隨著雙氟磺草胺（florasulam）在我國冬小麥田的大面積應(yīng)用，部分區(qū)域已發(fā)現(xiàn)小麥田主要闊葉雜草播娘蒿（Descurainia sophia）對(duì)雙氟磺草胺的敏感性降低，在田間造成防治效果下降的現(xiàn)象，研究播娘蒿對(duì)雙氟磺草胺的抗性水平和抗性機(jī)理，對(duì)制定抗性雜草區(qū)域性治理技術(shù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】播娘蒿是我國小麥田常見的一種惡性闊葉雜草，在華東、華北、東北、西北等地區(qū)均有分布，是黃淮海冬小麥田最主要的越年生闊葉雜草，在河南[1]、山東[2]和河北[3]等省發(fā)生優(yōu)勢(shì)度均居于前三位。播娘蒿因其莖葉伸展侵占面積大，與禾本科作物小麥競爭有效資源占盡優(yōu)勢(shì)，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]，對(duì)播娘蒿的抗性研究主要集中于其對(duì)苯磺?。╰ribenuron-methyl）的抗性，據(jù)報(bào)道播娘蒿抗苯磺隆主要是基因位點(diǎn)突變，第197、376和574位發(fā)生突變，且以197位點(diǎn)發(fā)生突變?yōu)橹?，約占90%[6]。雙氟磺草胺是美國陶氏益農(nóng)公司在20世紀(jì)90年代中期開發(fā)成功的第5個(gè)三唑嘧啶磺酰胺類除草劑新品種[7]，對(duì)小麥田幾乎所有的闊葉雜草包括播娘蒿、薺菜、豬殃殃等均有很好的防除效果[8]，是繼苯磺隆之后在小麥田用量最大的除草劑[9]，并可與植物生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、其他除草劑等混用，現(xiàn)在黃淮海冬小麥田防除闊葉雜草的配方中幾乎都有雙氟磺草胺這一成分[10]，但該藥劑在我國應(yīng)用多年后，對(duì)部分區(qū)域播娘蒿等闊葉雜草防治效果已明顯下降。關(guān)于小麥田闊葉雜草對(duì)雙氟磺草胺抗性報(bào)道不多，馬鵬生[11]報(bào)道了部分豬殃殃種群對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生一定抗性，也有抗苯磺隆的薺菜種群對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生交互抗性的報(bào)道[12]，但均無抗性機(jī)理報(bào)道，而另一種重要闊葉雜草播娘蒿未見抗雙氟磺草胺報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】筆者在田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，因?yàn)殡p氟磺草胺具有殺草譜廣、用量少等優(yōu)點(diǎn)，近幾年在小麥田推廣面積很大，部分區(qū)域已發(fā)現(xiàn)用量在提高，防治效果下降現(xiàn)象，這很可能與播娘蒿對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生抗性有關(guān)。【擬解決的關(guān)鍵問題】在山東省冬小麥田主產(chǎn)區(qū)采集播娘蒿種子40份，采用整株生物測(cè)定法，研究播娘蒿種群對(duì)雙氟磺草胺和對(duì)比藥劑苯磺隆、2甲4氯（MCPA）3種除草劑的抗性水平，并對(duì)高抗雙氟磺草胺播娘蒿種群進(jìn)行靶標(biāo)抗性位點(diǎn)測(cè)定，為小麥田雜草抗藥性精準(zhǔn)治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

播娘蒿種子：2017年5月于山東省17地（市）小麥田采集自然成熟的播娘蒿種子，裝入牛皮紙袋，種子自然晾干后儲(chǔ)藏柜低溫儲(chǔ)藏。種群名稱以采集點(diǎn)所在地級(jí)市的首字母縮寫命名（表1）。

除草劑：98%雙氟磺草胺原藥，沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司；95%苯磺隆原藥，江蘇省激素研究所股份有限公司；95% 2甲4氯原藥，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗性水平測(cè)定 試驗(yàn)于2018年2—4月進(jìn)行，在玻璃溫室中進(jìn)行播娘蒿試材的培養(yǎng)，光照為自然光，溫度靠暖氣調(diào)整，試驗(yàn)期間溫室溫度為14—28℃。每個(gè)采集樣點(diǎn)的播娘蒿為一個(gè)種群，在直徑為9 cm的塑料盆中單獨(dú)種植，覆土1—2 mm，每個(gè)種群種植64盒，將塑料盒放入裝有水的搪瓷盤中，以盆缽底部滲灌方式澆水，每隔3 d澆水一次，保持土壤濕度。

表1 40個(gè)播娘蒿種群采集地點(diǎn)Table 1 Collection sites information of 40 D.sophia populations

抗性測(cè)定采用盆栽整株劑量-反應(yīng)測(cè)定法[4]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，每種除草劑設(shè)置5個(gè)劑量，其中雙氟磺草胺劑量為0.37、1.11、3.33、10.0、30.0 g·hm-2；苯磺隆劑量為5、20、80、320、1 280 g·hm-2；2甲4氯劑量為22.2、66.7、200、600、1 800 g·hm-2，每個(gè)種群均設(shè)置單獨(dú)空白對(duì)照，每處理4次重復(fù)，于播娘蒿3—6葉期，采用ASS-4型自動(dòng)控制噴灑系統(tǒng)進(jìn)行藥劑噴霧，噴頭為扇形噴頭，噴霧壓力為0.35 MPa，用水量按照每公頃450 L計(jì)算。

施藥后，觀察同一種藥劑下，40個(gè)播娘蒿種群的敏感差異，詳細(xì)記錄播娘蒿表現(xiàn)癥狀、表現(xiàn)時(shí)期以及不同種群的敏感差異。施藥后30 d，用剪刀剪取各種群各處理播娘蒿地上部分，稱量鮮重，每個(gè)種群根據(jù)相應(yīng)的空白對(duì)照鮮重，計(jì)算鮮重抑制率。鮮重抑制率（%）=100×（空白對(duì)照鮮草重-處理區(qū)鮮草重）/空白對(duì)照鮮草重。

1.2.2 ALS基因突變分析 根據(jù)播娘蒿ALS基因序列（GenBank：FJ715633），設(shè)計(jì)引物（DS-F 5′ GGTA TCAAATCCCGTGCTCT 3′和DS-R 5′ CATATGCA TACAATCACCGGTT 3′），擴(kuò)增片段包含目前已報(bào)道所有抗性相關(guān)位點(diǎn)。參照1.2.1的方法進(jìn)行播娘蒿高抗種群植株的種植，待播娘蒿長到3—4葉時(shí)，采集藥劑處理后存活植株的單株葉片，采用植物基因組提取試劑盒（TaKaRa）提取基因組DNA，具體提取方法參照試劑盒相關(guān)流程；PCR克?。?5 μL反應(yīng)體系，參數(shù)為94℃ 3 min；95℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min）其ALS基因序列，使用UNlQ-10 DNA純化試劑盒（上海生工生物工程有限公司）回收PCR產(chǎn)物并送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序后獲得序列與擬南芥敏感型ALS基因和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，查找相關(guān)突變位點(diǎn)。每個(gè)種群檢測(cè)10株。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用DPS 7.05軟件對(duì)藥劑劑量的對(duì)數(shù)值與鮮重抑制率的概率值進(jìn)行回歸分析，得到劑量-反應(yīng)曲線、相關(guān)系數(shù)、抑制雜草生長50%的除草劑劑量（GR50）及95%置信區(qū)間。由于不同種群本身種子活力、生長勢(shì)等有差異，所以相對(duì)抗性指數(shù)（resistance index，RI）＜5.00的均認(rèn)定為敏感種群，RI=GR50（R）/ GR50（S），其中GR50（R）為抗性種群的GR50值，GR50（S）為敏感種群的GR50值?？剐耘袛鄥⒖几吲d祥等[4]：1.00≤RI＜5.00為敏感種群，5.00≤RI＜10.00為低抗性種群，10.00≤RI＜50.00為中抗性種群，RI≥50.00為高抗性種群。

2 結(jié)果

2.1 播娘蒿對(duì)雙氟磺草胺抗性水平測(cè)定

雙氟磺草胺藥效表現(xiàn)較慢，施藥后7 d播娘蒿開始出現(xiàn)黃化，而后生長被抑制，至藥后15 d后開始死亡。40個(gè)播娘蒿種群中大部分種群對(duì)雙氟磺草胺敏感，但BZ-1、DZ-3、LC-3、LY-4、YT-1 5個(gè)種群敏感性明顯低于其他種群。

施藥后30 d調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計(jì)（表2）可見，雙氟磺草胺對(duì)大部分播娘蒿種群效果很好，最敏感種群是DY-1和JNI-4，GR50均為0.11 g·hm-2，敏感種群有32個(gè)，占80.00%，抗性種群有8個(gè)，占總種群數(shù)的20.00%，部分種群抗性已很明顯。其中低抗、中抗和高抗種群數(shù)量分別為3、3和2個(gè)，各自占總種群數(shù)的7.50%、7.50%和5.00%。從山東省不同區(qū)域來看，對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生抗性的播娘蒿種群分布無明顯規(guī)律，8個(gè)抗性種群分布于7個(gè)地（市），最高抗性種群為DZ-3，RI為194.00。

2.2 播娘蒿對(duì)對(duì)比藥劑苯磺隆和2甲4氯的抗性水平測(cè)定

苯磺隆藥效表現(xiàn)與雙氟磺草胺差別不大，施藥后7 d播娘蒿開始出現(xiàn)黃化，而后生長被抑制，至藥后15 d后開始死亡。表3為苯磺隆施藥后30 d調(diào)查結(jié)果。40個(gè)播娘蒿種群敏感性差異明顯，對(duì)苯磺隆最敏感的播娘蒿種群是HZ-1，GR50為0.56 g·hm-2，另外，DY-1、DZ-1、JN-2、WH-1等20個(gè)種群也比較敏感，RI＜5.00，敏感種群占52.50%；抗性種群有19個(gè)，占總種群數(shù)的47.50%，而且在抗性種群中，低抗、中抗、高抗種群分別為11、6、2個(gè)，分別占總種群數(shù)的27.50%、15.00%、5.00%。最高抗性種群是DZ-3，RI為244.75。

2甲4氯施藥后觀察，播娘蒿表現(xiàn)速度快，施藥后3 d時(shí)播娘蒿即開始出現(xiàn)扭曲，葉片不伸展，藥后7 d時(shí)莖葉開始黃化，而后逐漸死亡。40個(gè)播娘蒿種群對(duì)2甲4氯均敏感，效果無明顯差異。表4為2甲4氯施藥后30 d調(diào)查結(jié)果。2甲4氯對(duì)40個(gè)播娘蒿種群效果均很好，無明顯抗性產(chǎn)生，RI在1.00—5.00，且大部分在3.00以下。

表2 播娘蒿種群對(duì)雙氟磺草胺抗性水平測(cè)定Table 2 Resistance level of D.sophia populations to florasulam

表3 播娘蒿種群對(duì)苯磺隆抗性水平測(cè)定Table 3 Resistance level of D.sophia populations to tribenuron-methyl

表4 播娘蒿種群對(duì)2甲4氯抗性水平Table 4 Resistance level of D.sophia populations to MCPA

2.3 雙氟磺草胺高抗種群ALS基因突變分析

對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生高抗種群BZ-1和DZ-3進(jìn)行了ALS基因測(cè)序，測(cè)序分析結(jié)果顯示兩個(gè)高抗播娘蒿植株均發(fā)生了ALS基因功能位點(diǎn)的突變，但是突變位點(diǎn)或突變方向存在差異。BZ-1 ALS基因第197位氨基酸發(fā)生CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）的突變，DZ-3 ALS基因第574位氨基酸發(fā)生了TGG（Trp）到TTG（Leu）的突變（表5）。

表5 高抗種群ALS基因突變分析Table 5 Analysis of ALS gene mutations in highly resistant populations

3 討論

3.1 播娘蒿對(duì)雙氟磺草胺及對(duì)比藥劑苯磺隆、2甲4氯的抗性水平

1988年美國杜邦公司的苯磺隆在我國正式登記，我國小麥田除草劑進(jìn)入一個(gè)飛速發(fā)展期，但苯磺隆連續(xù)多年使用后，小麥田播娘蒿[13-16]、薺菜[17-20]、豬殃殃[21-23]、麥家公[24-25]等闊葉雜草的抗性逐年加重，苯磺隆單劑逐漸退出市場(chǎng)，僅作為復(fù)配制劑的成分之一。本研究中，播娘蒿對(duì)苯磺隆的抗性仍然很普遍，抗性種群占47.50%，最高相對(duì)抗性指數(shù)為244.75。

雙氟磺草胺是繼苯磺隆之后在小麥田應(yīng)用最廣的防除闊葉雜草的除草劑，該藥劑與苯磺隆一樣，均屬于ALS抑制劑類除草劑，目前市場(chǎng)上防除小麥田闊葉雜草的除草配方中，雙氟磺草胺已成為一種必不可少的成分，該藥劑由于用量低、活性高，且對(duì)小麥安全性高，已大面積應(yīng)用，國內(nèi)學(xué)者對(duì)雙氟磺草胺以及復(fù)配制劑的應(yīng)用進(jìn)行了大量報(bào)道[8,10]，但隨著用藥時(shí)間延長，效果逐漸下降，用藥量逐漸加大，已是最初登記用量的3倍甚至更高，已有報(bào)道小麥田豬殃殃對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生一定程度的抗性[11]，但未有小麥田主要雜草播娘蒿對(duì)雙氟磺草胺的抗性報(bào)道，對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生抗性也沒有引起足夠的重視。從本試驗(yàn)結(jié)果可見，雖然僅有20.00%的播娘蒿種群對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生抗性，但兩個(gè)高抗種群BZ-1和DZ-3的相對(duì)抗性指數(shù)分別達(dá)到了52.00和194.00。

本試驗(yàn)中播娘蒿種群未對(duì)對(duì)比藥劑2甲4氯產(chǎn)生抗藥性，2甲4氯在小麥田也主要應(yīng)用于防除播娘蒿、薺菜，因此以播娘蒿、薺菜為主的地塊，可以使用2甲4氯等不易產(chǎn)生抗藥性的激素類藥劑進(jìn)行防除，多種闊葉雜草混生地塊，可采用多種作用機(jī)制的除草劑混合使用或者交替使用[26-29]，減少雙氟磺草胺單一藥劑的使用。

綜合山東省播娘蒿40個(gè)種群對(duì)雙氟磺草胺和對(duì)比藥劑苯磺隆、2甲4氯的抗性水平測(cè)定結(jié)果，2甲4氯為激素類除草劑，40個(gè)播娘蒿種群未發(fā)現(xiàn)抗性產(chǎn)生，這也進(jìn)一步印證了激素類除草劑不易產(chǎn)生抗藥性。雙氟磺草胺和苯磺隆為ALS抑制劑類除草劑，也是容易產(chǎn)生抗性的除草劑類型，從結(jié)果可以看出，抗雙氟磺草胺和抗苯磺隆的播娘蒿種群存在著一定程度的一致性，但又不是完全一致?？闺p氟磺草胺種群有8個(gè)，抗苯磺隆種群有19個(gè)，其中抗雙氟磺草胺的8個(gè)種群中有7個(gè)也是抗苯磺隆種群，如高抗雙氟磺草胺的播娘蒿種群BZ-1和DZ-3同時(shí)也是中抗和高抗苯磺隆種群；中抗雙氟磺草胺種群LC-3、LY-4、YT-1同時(shí)分別為中抗、高抗和低抗苯磺隆種群；低抗雙氟磺草胺的種群JN-1、JNI-2同時(shí)也是中抗苯磺隆種群，只有低抗雙氟磺草胺的種群LY-2對(duì)苯磺隆沒有抗性。其他抗苯磺隆的12個(gè)種群未見對(duì)雙氟磺草胺的抗性。

3.2 播娘蒿對(duì)雙氟磺草胺的抗性機(jī)理

靶標(biāo)抗性機(jī)理和非靶標(biāo)抗性機(jī)理是雜草對(duì)ALS類除草劑產(chǎn)生抗性的兩大原因[6,30-31]。靶標(biāo)ALS基因突變或代謝作用增強(qiáng)是報(bào)道最多的ALS類除草劑抗性機(jī)理，國內(nèi)外大量研究證實(shí)ALS存在8個(gè)抗性突變位點(diǎn)，分別為第122位丙氨酸、第197位脯氨酸、第205位丙氨酸、第376位天冬氨酸、第377位精氨酸、第574位色氨酸、第653位絲氨酸和第654位甘氨酸[32-34]，任一位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替代均可導(dǎo)致雜草抗藥性的產(chǎn)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明，靶標(biāo)突變是播娘蒿種群BZ-1、DZ-3對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生高水平抗性的重要原因之一，種群BZ-1和DZ-3均發(fā)生ALS關(guān)鍵位點(diǎn)突變，但突變方式存在差異，這進(jìn)一步證實(shí)了ALS突變的多樣性[6]。BZ-1的ALS基因第197位氨基酸發(fā)生了CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）的突變，而DZ-3的ALS基因則是第574位氨基酸發(fā)生了TGG（Trp）到TTG（Leu）的突變，這一結(jié)果與鄧維[6]報(bào)道的關(guān)于播娘蒿對(duì)苯磺隆靶標(biāo)抗性突變的3個(gè)位點(diǎn)（197、376和574位）研究結(jié)果具有一定的一致性，但突變方式不一樣。至于二者抗性機(jī)理的關(guān)聯(lián)性，有待進(jìn)一步研究。非靶標(biāo)抗性機(jī)理比靶標(biāo)抗性復(fù)雜[28,35]，這方面的研究報(bào)道較少。非靶標(biāo)抗性機(jī)制是盡量減少除草劑到達(dá)目標(biāo)部位的數(shù)量，從而減少除草劑對(duì)雜草的損傷，目前有關(guān)非靶標(biāo)抗性機(jī)理報(bào)道最多的是植物代謝能力的增強(qiáng)。播娘蒿對(duì)雙氟磺草胺抗性機(jī)理除了主要的靶標(biāo)抗性外，是否還有非靶標(biāo)抗性是下一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。

4 結(jié)論

山東省40個(gè)播娘蒿種群中已有20.00%的種群對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生明顯抗性，其中高抗種群的BZ-1和DZ-3相對(duì)抗性指數(shù)已高達(dá)52.00和194.00，且主要為靶標(biāo)抗性。另外，播娘蒿種群對(duì)對(duì)比除草劑苯磺隆的抗性仍很普遍，對(duì)另一種激素類除草劑2甲4氯未產(chǎn)生抗性。因此，針對(duì)冬小麥田播娘蒿發(fā)生區(qū)域，不能單一使用雙氟磺草胺，應(yīng)推廣多種作用機(jī)理的除草劑交替、混和使用，從而延緩和控制雜草產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)擴(kuò)大殺草譜、降低除草劑使用量。