劉培勛，萬(wàn)洪深，鄭建敏，羅江陶，蒲宗君

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)侨蛑匾募Z食作物，中國(guó)作為世界上最大的小麥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，其生產(chǎn)對(duì)保障國(guó)家糧食安全具有重要意義。小麥籽粒硬度是國(guó)內(nèi)外小麥分類(lèi)和定價(jià)的重要因素之一，是當(dāng)前專(zhuān)用小麥育種的重要指標(biāo)。不同硬度小麥面粉用途不同，硬麥適用于制作面包和面條等，軟麥適用于制作餅干、糕點(diǎn)和釀酒等。明確小麥籽粒硬度遺傳基礎(chǔ)，對(duì)于改良小麥品質(zhì)，培育具有不同硬度的小麥品種具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究發(fā)現(xiàn)，小麥籽粒硬度受多個(gè)遺傳因子控制并受環(huán)境影響。GREENWELL等[1]首次用SDS方法從軟質(zhì)小麥水洗淀粉中分離獲得了與籽粒硬度相關(guān)的Friabilin蛋白，其分子量為15 kD，該蛋白位于小麥5DS染色體臂的Ha位點(diǎn)，在軟粒小麥中大量表達(dá)，在硬質(zhì)小麥中含量極少或者缺失[2]。小麥籽粒硬度受PIN（puroindoline）基因控制[3]，包括Pina和Pinb，2個(gè)基因的氨基酸序列相似性達(dá)60%，共同作用影響籽粒柔軟度。當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，小麥籽粒表現(xiàn)為軟質(zhì)，當(dāng)Pina缺失或Pinb發(fā)生變異時(shí)，小麥籽粒表現(xiàn)為硬質(zhì)。HEINZE等[4]將PIN基因轉(zhuǎn)入硬粒小麥（Triticum turgidumL.var.durum），導(dǎo)致其籽粒品質(zhì)發(fā)生改變并顯著降低了磨粉所需能量。GASPARIS等[5]運(yùn)用RNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)使PIN基因沉默，發(fā)現(xiàn)PIN蛋白顯著減少，小麥籽粒硬度增加。WILEY等[6]運(yùn)用組織印記等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)小麥PIN蛋白的合成和積累僅發(fā)生在籽粒胚乳細(xì)胞中。世界各地學(xué)者對(duì)不同地區(qū)小麥資源PIN基因的變異類(lèi)型開(kāi)展了研究并發(fā)現(xiàn)了大量變異類(lèi)型[7-10]。隨著對(duì)PIN基因研究的深入，與硬度相關(guān)的grain softness protein-1（gsp-1）也被分離出來(lái)，該基因與PIN基因高度同源，且共同存在于5DS染色體上，3個(gè)基因的物理順序?yàn)镻inB-PinA-Gsp1[11]。此外，WILKINSON等[12]在普通小麥cDNA中發(fā)現(xiàn)一種與puroindoline b核苷酸序列相似性高達(dá)70%的類(lèi)PIN基因，稱(chēng)為puroindoline b-2。陳鋒等[13]發(fā)現(xiàn)該基因有4種變異類(lèi)型，分別為Pinb-v1、Pinb-v2、Pinb-v3和Pinb-v4。利用缺體材料將其分別定位為7DL、7BL、7B和7AL上。研究表明，小麥籽粒硬度不僅由基因決定，還受環(huán)境及栽培措施等的影響。王月福等[14]研究了氮肥用量對(duì)不同小麥品種籽粒蛋白質(zhì)組分含量變化及加工品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，增施氮肥能夠顯著提高籽粒蛋白質(zhì)各組分的含量，提高濕面筋含量和沉降值，從而增加籽粒硬度。李友軍等[15]研究表明，氮鉀配合施用可降低小麥品種豫麥50和鄭麥9023的籽粒硬度。然而，其改變小麥籽粒硬度的分子遺傳基礎(chǔ)尚不明確?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)于小麥籽粒硬度的研究主要集中于PIN基因（Pina和Pinb），對(duì)其所屬基因家族的同源基因的研究尚不全面?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以小麥基因組參考序列（iwgsc_refseqv1.0 2018）為基礎(chǔ)，鑒定PIN基因家族成員，分析基因分布、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、順式作用元件和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等，明確小麥PIN家族基因在不同組織不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性和不同硬度小麥樣本中的表達(dá)模式，為解析該基因功能奠定基礎(chǔ)，為小麥遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理方法

小麥品種蜀麥969和川麥601來(lái)自于四川省。蜀麥969是筋力最強(qiáng)、硬度最高的四川主推品種之一，川麥601是筋力最弱、硬度最低的品種之一。于2018年10月至2019年5月種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院德陽(yáng)試驗(yàn)基地（31°14′N(xiāo)，104°24′E）。播種時(shí)各施75 kg·hm-2的磷肥（過(guò)磷酸鈣）和鉀肥（硫酸鉀）作為基肥，常規(guī)組施150 kg·hm-2的尿素，低氮組施75 kg·hm-2的尿素，尿素的施用分為2次，一半作為基肥施用；另一半作為拔節(jié)肥施用。在開(kāi)花30 d時(shí)，收取飽滿的種子，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆茫糜谔崛NA。使用單粒谷物測(cè)定儀KSCS4100檢測(cè)成熟小麥種子籽粒硬度指數(shù)，使用近紅外谷物品質(zhì)分析儀Infratec TM 1241檢測(cè)粗蛋白含量。

1.2 小麥PIN基因家族的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[16]下載小麥已知PIN蛋白序列[17]和大麥hordoindoline序列[18]，作為搜索小麥同源基因的探針序列（電子附表1）。小麥全基因組序列、蛋白序列和注釋文件來(lái)源于URGI[19]。根據(jù)小麥PIN蛋白序列和大麥hordoindoline序列，使用HMMER3.0軟件[20-21]建立HMM模型，在小麥全基因組蛋白序列中搜索同源序列。同時(shí)利用本地BLASTP程序[22]，同源比對(duì)小麥蛋白序列，進(jìn)行鑒定，同時(shí)滿足2種鑒定方法的被認(rèn)為是小麥PIN基因家族成員。對(duì)鑒定出的小麥PIN基因，利用Clustal X 2.0進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件[23]最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.3 小麥PIN基因的序列分析

使用PFAM和CDD和數(shù)據(jù)庫(kù)[24-25]對(duì)鑒定出的小麥PIN基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定。利用ExPASy進(jìn)行預(yù)測(cè)小麥PIN基因家族蛋白序列的分子量和等電點(diǎn)[26]。使用MEME在線程序[27]鑒定蛋白保守motif，通過(guò)GSDS在線軟件[28]分析基因結(jié)構(gòu)。此外，使用PlantCARE軟件[29]對(duì)每個(gè)基因編碼序列上游2 000 bp的DNA序列分析順式元件，并運(yùn)用TBtools工具[30]進(jìn)行可視化作圖。

1.4 小麥PIN基因的表達(dá)分析

從Wheat Expression Browser（powered by expVIP）[31-32]下載小麥品種中國(guó)春在不同時(shí)期不同組織的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，用于分析小麥PIN基因的表達(dá)模式，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)小麥PIN基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定。使用Omega biotek公司植物RNA提取試劑盒（R6827）提取開(kāi)花后30 d的小麥籽粒RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)小麥PIN基因序列，利用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）包括10 μL SYBR?Green Realtime PCR Master Mix、1 μL primer#1 (10 μmol·L-1)、1 μL primer #2 (10 μmol·L-1)、1 μL Template DNA和4 μL PCR grade water。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 2 min；95℃ 15 s，54℃ 30 s（同時(shí)收集信號(hào)值），40個(gè)循環(huán)，溶解曲線分析為54℃—95℃。使用β-Actin作為相對(duì)定量的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，基因的相對(duì)表達(dá)量使用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

表1 TaPINs實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析所用引物Table 1 Primer sequences used in quantitative real-time PCR analysis of TaPINs

2 結(jié)果

2.1 小麥PIN基因的鑒定和序列分析

通過(guò)BLAST和Hidden Markov Model方法從小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定到19個(gè)小麥PIN家族基因，并隨機(jī)命名為T(mén)aPIN1—TaPIN19，這些基因集中成簇分布于1B/1D、5A/5B/5D、7A/7B/7D染色體（電子附表2），編碼148—327個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為16.39—37.19 kD，等電點(diǎn)為6.35—9.34（電子附表3）。Conserved Domains search分析結(jié)果表明，所有TaPINs基因都包含AAI_SS結(jié)構(gòu)域（cl07890），該結(jié)構(gòu)域是AAI_LTSS超級(jí)家族的特征，因此，PINs基因?qū)儆贏AI_LTSS超級(jí)家族成員。AAI_LTSS超級(jí)家族為高等植物特有，包括谷物型阿爾法淀粉酶抑制劑（alpha amylase inhibitor）、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（lipid transfer protein）、種子儲(chǔ)存蛋白（seed storage protein）和其他類(lèi)似蛋白。Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析表明，19個(gè)PIN蛋白結(jié)構(gòu)域的Top Hit不同，其中，9個(gè)蛋白（TaPIN6—TaPIN10、TaPIN14—TaPIN16和TaPIN19）為T(mén)ryp_alpha_amyl（PF00234.22），剩下的10個(gè)（TaPIN1—TaPIN5、TaPIN11—TaPIN13、TaPIN17—TaPIN18）為Gliadin（PF13016.6）（電子附表4）。

2.2 小麥PIN基因的系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白保守結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)分析

19個(gè)TaPINs蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該基因家族可以分為A和B兩大類(lèi)，其中，作為參考的小麥PIN蛋白序列和大麥hordoindoline序列與A類(lèi)聚為同一類(lèi)。A類(lèi)又進(jìn)一步分為A1、A2和A3亞類(lèi)，A1包括TaPIN9和TaPIN10，A2包括TaPIN14、TaPIN15、TaPIN16和TaPIN19，A3包括TaPIN6、TaPIN7和TaPIN8；B類(lèi)可進(jìn)一步分為B1和B2亞類(lèi)，B1包括TaPIN11、TaPIN12、TaPIN13、TaPIN17和TaPIN18，B2包括TaPIN1、TaPIN2、TaPIN3、TaPIN4和TaPIN5（圖1）。為了研究小麥PIN基因的結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行保守motif分析，通過(guò)MEME數(shù)據(jù)庫(kù)共鑒定12個(gè)保守motif（圖2），所有序列均包含motif1、motif3、motif4和motif5，其中，屬于PIN基因特征之一的富色氨酸區(qū)域位于motif3。A類(lèi)中獨(dú)有motif6和motif7，而B(niǎo)類(lèi)中特有motif 8—motif12。如圖2所示，除TaPIN15有1個(gè)長(zhǎng)的內(nèi)含子和TaPIN1有2個(gè)短內(nèi)含子外，大部分TaPINs基因僅有1個(gè)外顯子，沒(méi)有內(nèi)含子。19個(gè)TaPINs基因上游序列含多個(gè)順式作用元件（圖3），包括與抗逆相關(guān)的脫落酸作用元件（ABRE）、茉莉酸甲酯作用元件（CGTCA-motif和TGACG- motif）、干旱脅迫反應(yīng)元件（MBS）、水楊酸作用元件（TCA-element）、抗逆元件（TC-rich repeats）、赤霉素反應(yīng)元件（P-box和GARE-motif）和低溫反應(yīng)元件（LTR）；與種子發(fā)育相關(guān)的胚乳發(fā)育元件（GCN4_motif）、蛋白代謝調(diào)控元件（O2-site）和種子特異調(diào)控元件（RY-element）。豐度最大的3種元件為ABRE、CGTCA和TGACG，均與抗逆性有關(guān)。

2.3 小麥PIN基因在不同組織、不同時(shí)期的表達(dá)分析

利用小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了小麥品種中國(guó)春在不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)（圖4和電子附表5），19個(gè)TaPINs基因在小麥籽粒中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織部位，而在根莖葉等組織中表達(dá)量低，幾乎不表達(dá)。在小麥拔節(jié)期和開(kāi)花期幾乎不表達(dá)，而在籽粒形成期在籽粒中大量表達(dá)表明TaPINs主要在籽粒發(fā)育過(guò)程中起作用。不同基因成員間表達(dá)差異顯著，TaPIN14、TaPIN15和TaPIN12等相對(duì)表達(dá)量較低。

2.4 小麥PIN基因在不同硬度小麥中的相對(duì)表達(dá)分析

選取了3個(gè)不同籽粒硬度的小麥樣品（SM969MN籽粒硬度指數(shù)為40.2，粗蛋白含量為13.4%；SM969LN硬度指數(shù)為35.3，粗蛋白含量為11.4%；CM601LN籽粒硬度指數(shù)為25.4，粗蛋白含量為10.7%），分析了TaPINs基因在不同硬度小麥中的表達(dá)模式（圖6），在3個(gè)樣品中，TaPIN9和TaPIN10均表達(dá)量較高，但隨著施氮量降低或是在弱筋小麥品種中，其他幾個(gè)基因表達(dá)量相對(duì)較低，而TaPIN9和TaPIN10表達(dá)比例非常高。比較幾個(gè)表達(dá)量相對(duì)較低的基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，僅有TaPIN9和TaPIN10的表達(dá)量隨籽粒硬度的減低，相對(duì)表達(dá)量上調(diào)。TaPIN16和TaPIN6則呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，隨籽粒硬度的降低，表達(dá)量下調(diào)。其他幾個(gè)基因（TaPIN14、TaPIN15和TaPIN19）相對(duì)表達(dá)量很低。

3 討論

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可將本研究鑒定出的19個(gè)小麥PIN基因分為A和B兩大類(lèi)，通過(guò)同源比對(duì)和查閱小麥基因組蛋白注釋可知，TaPIN9為Pina，TaPIN10為Pinb，屬于A類(lèi)。Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，19個(gè)PIN蛋白結(jié)構(gòu)域的Top Hit不同，A類(lèi)的9個(gè)基因?yàn)門(mén)ryp_alpha_amyl（protease inhibitor/seed storage/LTPfamily），B類(lèi)的10個(gè)基因?yàn)镚liadin（Cys-rich Gliadin N-terminal），推測(cè)至少A類(lèi)的9個(gè)基因在影響小麥籽粒硬度中發(fā)揮相似功能，而B(niǎo)類(lèi)則與另一類(lèi)與PIN基因高度同源的基因類(lèi)別Avenin-like b（AVNLB）高度相關(guān)[33]。A類(lèi)又分為3個(gè)亞類(lèi)，A1亞類(lèi)包含了Pina和Pinb。A2亞類(lèi)包括TaPIN16、TaPIN19、TaPIN14和TaPIN15，該亞類(lèi)與Pinb親緣關(guān)系較近，且與之前報(bào)道的Pinb的同源基因puroindoline b-2的變異類(lèi)型數(shù)量吻合，均為4個(gè)，推測(cè)其為已報(bào)道的puroindolineb-2。前人利用小麥中國(guó)春缺體材料對(duì)該類(lèi)基因進(jìn)行了定位，認(rèn)為Pinb-2v1位于7DL，Pinb-2v2位于7BL，Pinb-2v3位于7B，Pinb-2v4位于7AL[34]。本研究利用生物信息學(xué)方法，在小麥中國(guó)春的基因組中進(jìn)行鑒定，得出TaPIN14和TaPIN15均位于7A，TaPIN16位于7B，TaPIN19位于7D染色體，與前人研究略有差異。A3亞類(lèi)包括TaPIN6、TaPIN7和TaPIN8，分別位于5A、5B和5D染色體，蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TaPIN8為已報(bào)道的gsp-1，但位于5A和5B的同源序列TaPIN6和TaPIN7之前未見(jiàn)報(bào)道。A2和A3亞類(lèi)均在小麥的3套染色體中存在，而A1則只存在于5D染色體，這可能是由于小麥漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了大量基因重組（轉(zhuǎn)座因子插入、基因組缺失、重復(fù)和逆序）造成[35]。

圖1 TaPINs蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of TaPINs using the complete protein sequences

圖2 19個(gè)TaPINs蛋白的保守序列和基因結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The conserved motifs and gene structure analysis of 19 TaPINs

圖3 19個(gè)TaPINs基因順式作用元件分析Fig.3 Cis-acting element analysis of 19 TaPINs

圖4 TaPINs基因在小麥品種中國(guó)春不同發(fā)育時(shí)期不同組織中的表達(dá)情況Fig.4 Expression profiles of TaPINs in different growth stages and different tissues of Chinese Spring

圖5 TaPINs基因家族中A類(lèi)部分基因相對(duì)表達(dá)分析Fig.5 Relative expression of TaPINs belong to class A

鑒定出的19個(gè)小麥PIN基因與近緣種大麥、燕麥[36]、黑麥[37]中已報(bào)道的同源蛋白共同構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖1中A1亞類(lèi)?？梢?jiàn)，4個(gè)麥類(lèi)作物均含有該基因，其他麥類(lèi)未發(fā)布完整基因組，因此，其含有PIN同源基因的數(shù)量未知。PINA與粗山羊草中的EMT21351聚在一起，PINB與EMT21353聚在一起，且蛋白序列幾乎一致，再次驗(yàn)證了小麥D基因組來(lái)源于粗山羊草。從該基因的進(jìn)化分析來(lái)看，粗山羊草與小麥親緣關(guān)系最近，燕麥和黑麥次之，大麥與小麥親緣最遠(yuǎn)。

通過(guò)對(duì)該基因家族編碼區(qū)上游2 000 bp的DNA序列進(jìn)行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)除了種子發(fā)育相關(guān)元件外，還存在大量抗逆相關(guān)元件，推測(cè)該類(lèi)基因除影響籽粒硬度外，還參與小麥植株后期的抗性調(diào)控。DHATWALIA等[38]認(rèn)為puroindoline在植物種子中具有抗菌活性，可能是一種membranotoxin膜毒素，在植物抵御微生物病原體的防御機(jī)制中發(fā)揮作用。KIM等[39]研究表明，puroindoline具有體外抗菌活性，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行過(guò)表達(dá)，證明其是一種有效的抗真菌蛋白。HANEY等[40]對(duì)puroindoline抗菌活性進(jìn)行了檢測(cè)，表明puroindoline衍生的多肽均與DNA結(jié)合，阻斷體內(nèi)大分子的合成。雖然序列信息和前人研究均表明puroindoline參與抗菌活動(dòng)，但基于該基因家族僅限于在種子內(nèi)表達(dá)，其具體對(duì)哪些病害起作用，其調(diào)控方式等尚需進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)明確。

目前，對(duì)Pina和Pinb的研究尚不能完全解釋小麥籽粒硬度變異的機(jī)制。AYALA等[41]研究了西班牙南部安達(dá)魯西亞小麥地方品種puroindoline基因的分子特征，發(fā)現(xiàn)13個(gè)硬質(zhì)小麥樣本，僅有7個(gè)可以用Pina-D1或Pinb-D1突變來(lái)解釋。NIRMAL等[42]對(duì)硬籽粒小麥的基因型進(jìn)行了鑒定，表明除了Pina和Pinb變異，還存在其他基因影響小麥硬度。CHEN等[43]利用電子顯微鏡分析的硬質(zhì)和軟質(zhì)節(jié)節(jié)麥，不能用PIN等位基因的序列變異來(lái)解釋。DARLINGTON等[44]對(duì)3個(gè)硬質(zhì)大麥和3個(gè)軟質(zhì)大麥中的puroindoline的同源基因hordoindoline進(jìn)行了序列比對(duì)，大麥中硬質(zhì)與軟質(zhì)品種中該基因并沒(méi)有差異。這些研究表明硬度是受多基因控制的數(shù)量性狀。除Pina和Pinb表達(dá)量較高外，其他幾個(gè)同源基因表達(dá)量非常低，對(duì)籽粒硬度的影響有限。除Pina和Pinb之外，該基因家族其他成員同樣具有AAI_SS功能結(jié)構(gòu)域，其在籽粒硬度調(diào)控中也可能具有共同作用，如果這些基因的表達(dá)量提升到相近水平后，能否改良籽粒硬度性狀，尚需進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)明確。

4 結(jié)論

在小麥全基因組范圍中共鑒定出19個(gè)TaPINs基因家族成員，可分為兩大類(lèi)。與已報(bào)到的其他麥類(lèi)作物同源基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育表明，從該基因來(lái)看，小麥和粗山羊草親緣關(guān)系最近，其次是燕麥、黑麥和大麥。該基因家族均只在籽粒中表達(dá)，但部分基因表達(dá)量很低。小麥籽粒硬度的調(diào)節(jié)以Pina和Pinb為主，推測(cè)其他基因家族成員也具有相似功能，但受表達(dá)量低的限制，對(duì)籽粒硬度影響較小。