張鉉哲，姜 萌，陳 梅，周子豪，李媛媛，趙 雪，任雪琦，徐浩然，陳蘇慧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

馬鈴薯作為第四大糧食作物，已成為重要經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。馬鈴薯晚疫病是影響馬鈴薯產(chǎn)量的嚴(yán)重病害之一[2-3]，與其他病害相比，其危害程度和防治難度更大，是一種爆發(fā)急、可循環(huán)發(fā)生的毀滅性病害[4]。馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）是半活體營養(yǎng)型異宗配合卵菌，大多數(shù)為二倍體[5-6]，而真菌以單倍體形式存在；卵菌細(xì)胞壁成分為葡聚糖、纖維素，無幾丁質(zhì)，真菌細(xì)胞壁共有成分為幾丁質(zhì)[7]。

馬鈴薯晚疫病存在有性生殖和無性繁殖兩種生殖方式，田間多以無性繁殖方式為主[8]，有性生殖方式為異宗配合，為完成有性生活史需正反交配型，即A1和A2[9]，兩種交配型同時(shí)存在可通過有性生殖發(fā)生基因重組[10]。在有性生殖階段，A1和A2交配型晚疫病菌交配后產(chǎn)生厚壁球形卵孢子，卵孢子能在土壤和植物殘?bào)w中越冬，在適宜條件下卵孢子萌發(fā)后侵染寄主[11]，造成下一年種植季節(jié)馬鈴薯晚疫病發(fā)生與流行。因此研究馬鈴薯晚疫病菌卵孢子形成及萌發(fā)條件尤為重要。

有性生殖是馬鈴薯晚疫病菌生命周期的重要特征，也是引起馬鈴薯晚疫病因素之一[12]。當(dāng)A1和A2交配型菌株同時(shí)存在時(shí)，兩種菌絲體受激素刺激，菌絲頂端腫脹，分別分化為卵原細(xì)胞（產(chǎn)生雌配子）和雄器（產(chǎn)生雄配子），通過受精管雄配子進(jìn)入卵原細(xì)胞，與雌配子核融合形成卵孢子[13]。卵孢子萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子囊，隨后釋放游動(dòng)孢子，游動(dòng)孢子可滲入土壤，感染與土壤接觸的莖和葉[14]。

卵孢子在其他疫霉菌引起的病害中也發(fā)揮重要作用，包括異宗配合卵菌引起的病害，如辣椒疫霉[15]和同宗配合卵菌引起的病害。卵孢子萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生芽管，芽管生長到一定程度時(shí)產(chǎn)生單個(gè)孢子囊，孢子囊可產(chǎn)生芽管，芽管再次產(chǎn)生孢子囊，芽管可從雄器上產(chǎn)生，也可從藏卵器壁上產(chǎn)生，藏卵器內(nèi)原生質(zhì)逐漸流向芽管[16]。

卵孢子具有厚壁，可抵御寒冷、微生物降解或化學(xué)熏蒸等惡劣環(huán)境條件。Cohen等發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍內(nèi)，馬鈴薯和番茄離體葉片上卵孢子數(shù)量隨溫度下降而增多，卵孢子在植物體內(nèi)形成的最適溫度為10℃，當(dāng)溫度過高時(shí)，卵孢子活性受抑制[17]。Han等將采集于甘肅地區(qū)的自育型晚疫病菌接種至馬鈴薯葉片上，30 d后在葉片上發(fā)現(xiàn)具有活力卵孢子，經(jīng)MTT法染色發(fā)現(xiàn)接種葉片內(nèi)產(chǎn)生的卵孢子有生物活性[18]。菌株組合、溫度、濕度、寄主組織部位、寄主抗性水平等均影響卵孢子數(shù)量。

在國內(nèi)外研究中，影響致病疫霉菌卵孢子萌發(fā)的重要條件有菌株組合、保存和培養(yǎng)時(shí)間、溫度、光照、營養(yǎng)物質(zhì)、化學(xué)處理和酶處理等。Stromberg等將無菌水和土壤浸出液以1∶10混合培養(yǎng)卵孢子，將其萌發(fā)率提高至16%[19]。KMnO4和H2O2均刺激卵孢子萌發(fā)，在卵孢子形成過程中，黑暗培養(yǎng)效果優(yōu)于光照培養(yǎng)，在卵孢子萌發(fā)階段，光照培養(yǎng)優(yōu)于黑暗培養(yǎng)，藍(lán)光培養(yǎng)顯著促進(jìn)卵孢子萌發(fā)[20]。Pittis等研究發(fā)現(xiàn)，在18℃條件下用NovoZym234處理卵孢子36 h以消解孢子囊，然后在無菌水中以白光為背景的藍(lán)光，18℃、16 h條件下培養(yǎng)，萌發(fā)率達(dá)20.6%[21]。

馬鈴薯晚疫病在無性階段可維持子代遺傳穩(wěn)定性，但近年來田間晚疫病菌交配型具有多樣性，有性生殖發(fā)生幾率極大提高，有性生殖產(chǎn)生的卵孢子為病原菌越冬主要形式，感染馬鈴薯晚疫病植株開始枯萎時(shí)，大量卵孢子進(jìn)入土壤中越冬，次年播種季節(jié)，卵孢子作為初侵染源，在適宜條件下萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊繼續(xù)侵染馬鈴薯，加大晚疫病防治難度，且卵孢子萌發(fā)加速晚疫病群體變異，使群體結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。研究馬鈴薯晚疫病菌卵孢子有助于深入了解晚疫病菌變異規(guī)律，為生產(chǎn)上防治及藥劑開發(fā)等提供理論依據(jù)。因此，近年來卵孢子萌發(fā)研究成為植物病理學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)，但目前并未形成完整的體系，確定影響疫霉菌卵孢子萌發(fā)的因素。因此，本研究旨在探索卵孢子形成及影響其萌發(fā)條件，為深入研究晚疫病菌遺傳變異規(guī)律及病害流行趨勢(shì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯晚疫病菌培養(yǎng)采用20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基。

20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基:200 mL蒸餾水，50 mL番茄汁，5 g瓊脂，1.2 g碳酸鈣。

選擇性培養(yǎng)基:在20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加氨芐青霉素500 mg·L-1，利福平50 mg·L-1，萬古霉素200 mg·L-1，匹馬霉素100 mg·L-1，PCNB 35 mg·L-1，苯菌靈10 mg·L-1。

1.0%水瓊脂培養(yǎng)基:在1 000 mL蒸餾水中加入10 g瓊脂，121℃高溫滅菌。

RSA（黑麥培養(yǎng)基）配方為:稱取60 g黑麥，洗凈后加入適量蒸餾水，榨汁機(jī)榨成糊狀，雙層紗布過濾，收集濾液，加水定容至1 000 mL，倒入鍋中，加入20 g蔗糖和20 g瓊脂，分裝于錐形瓶中，121℃高溫滅菌。

1.2 供試菌株

本試驗(yàn)所用馬鈴薯晚疫病菌均采集于黑龍江省[克山（KS）、依安（YA）]，內(nèi)蒙古[牙克石（YKS）、室韋（SW）]等地。本試驗(yàn)中卵孢子形成、活力和萌發(fā)中所用供試菌株表現(xiàn)型（瑞毒霉敏感性、交配型）和基因型（mtDNA單倍型、SSR基因型）信息見表1。

表1 馬鈴薯晚疫病菌株基因型和表現(xiàn)型Table 1 Genotype and phenotype of Phytophthora infestans

1.3 不同處理對(duì)卵孢子活力的影響

1.3.1 卵孢子收集

選擇不同交配型、瑞毒霉抗性、mtDNA單倍型、SSR基因型菌株對(duì)峙培養(yǎng)。

將同一時(shí)間在番茄培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)的A1、A2交配型菌株，21℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d后，分別用滅菌藍(lán)色槍頭沿菌絲邊緣打孔，將兩菌株菌餅接種至同一番茄培養(yǎng)基上，菌餅間隔2 cm，21℃黑暗條件培養(yǎng)。

取兩菌株菌落交界處（菌絲融合區(qū)域）培養(yǎng)基塊（4 cm×2 cm），滅菌刀刮除其表面菌絲，并放入滅菌小燒杯中，加入20 mL無菌水，高速勻漿機(jī)勻漿3 min，勻漿依次經(jīng)孔徑為76 μm（200目），40 μm（300目）、20 μm（600目）尼龍網(wǎng)過濾，20 mL無菌水沖洗孔徑為20 μm（600目）尼龍網(wǎng)于小燒杯中，收集卵孢子。

1.3.2 卵孢子活力測(cè)定

MTT染色法:MTT是活體染色劑，利用活細(xì)胞琥珀酸脫氫酶將MTT染色劑還原為不可溶性甲瓚，根據(jù)所呈現(xiàn)顏色反映活細(xì)胞代謝水平。若卵孢子已進(jìn)入萌發(fā)期，則被染成藍(lán)色；若卵孢子存活，但處于休眠期，則被染成玫瑰紅或紫色；若卵孢子無活力，則被染成黑色或不被染色。

將收集的卵孢子懸浮液與0.05%MTT溶液1∶1混合，在36℃下培養(yǎng)48 h，電子顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)不同顏色卵孢子數(shù)量，計(jì)算卵孢子活力率，每個(gè)菌株組合統(tǒng)計(jì)3次數(shù)據(jù)。

1.3.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)卵孢子活力的影響

綜合各菌株組合菌落融合情況，分別于15、18、21和24 d后收集卵孢子，測(cè)定卵孢子活力及數(shù)量。

1.3.4 菌株組合對(duì)卵孢子活力的影響

選擇不同交配型，不同瑞毒霉抗性，不同mtDNA單倍型和SSR基因型菌株作為親本，測(cè)定不同菌株組合培養(yǎng)15 d后產(chǎn)生的卵孢子數(shù)量和活力。

1.3.5 卵孢子保存溫度及保存時(shí)間對(duì)卵孢子活力的影響

取1 mL卵孢子懸浮液（菌株組合對(duì)峙培養(yǎng)15 d）測(cè)定卵孢子活力，并將剩余卵孢子懸浮液分別置于-20、4、21℃冰箱內(nèi)保存，分別于0、15和30 d后測(cè)定卵孢子活力。

1.4 不同復(fù)合處理對(duì)卵孢子萌發(fā)的影響

1.4.1 Novozyme 234消解孢子囊

將0.005 g·mL-1Novozyme 234溶液與卵孢子懸浮液（菌株組合對(duì)峙培養(yǎng)15 d）等量混合，21℃恒溫箱中靜置36 h，以消除卵孢子懸浮液中混有的菌絲和孢子囊。

1.4.2 不同濃度H2O2及混合培養(yǎng)時(shí)間對(duì)卵孢子萌發(fā)的影響

將經(jīng)Novozyme 234處理的卵孢子懸浮液離心（8 000 r·min-1）10 min，棄上清，加入適量無菌水，反復(fù)離心3次（去除殘留的Novozyme 234），將最終獲得的卵孢子懸浮液，分別與0.3%、0.5%、0.7%H2O2溶液于離心管中等量混合，將混合后卵孢子懸浮液放入21℃恒溫箱中，16 h交替藍(lán)光培養(yǎng)。分別于5、10和15 d后MTT染色，統(tǒng)計(jì)藍(lán)色卵孢子（卵孢子已度過休眠期）比率。

1.4.3 混合培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)卵孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用

在多年栽培馬鈴薯的大田中收集馬鈴薯根際土壤，將土壤過濾后與蒸餾水等量混勻，搖床上振蕩23.5 h（135 r·min-1）靜置0.5 h，經(jīng)尼龍網(wǎng)粗過濾，再濾紙過濾，收集濾液。將濾液分別與蒸餾水和黑麥培養(yǎng)基以1∶1混合，分別加入瓊脂粉（含量為混合溶液總量1.0%），高溫滅菌，分別作為培養(yǎng)基質(zhì)①、②。收集馬鈴薯根、莖和葉，分別將根、莖、葉與蒸餾水1∶10混合，榨汁機(jī)榨漿，經(jīng)尼龍網(wǎng)粗過濾，再濾紙過濾，收集濾液。將根、莖和葉濾液以2∶1∶1混合后，分別與蒸餾水和黑麥培養(yǎng)基以1∶4混合，加入瓊脂粉（含量為混合溶液總量1.0%），高溫滅菌，作為培養(yǎng)基質(zhì)③、④。瓊脂含量為1.0%水瓊脂培養(yǎng)基和黑麥培養(yǎng)基分別作為培養(yǎng)基質(zhì)⑤、⑥。以上混合培養(yǎng)基制作方法參照文獻(xiàn)[22]。

將與0.7%H2O2溶液1∶1混合的卵孢子，21℃16 h交替藍(lán)光培養(yǎng)5 d后，將卵孢子懸浮液離心（8 000 r·min-1）10 min，棄上清，加入適量無菌水，反復(fù)離心3次（洗凈殘留的H2O2），調(diào)節(jié)卵孢子懸浮液濃度為100個(gè)·mL-1，將上述6種培養(yǎng)基分別倒入培養(yǎng)皿中，將每皿劃分為10個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域滴入10 μL卵孢子懸浮液，并用涂布器涂勻，倒置顯微鏡鏡檢，標(biāo)記卵孢子位置，每個(gè)處理10次重復(fù)。21℃16 h交替藍(lán)光培養(yǎng)，待卵孢子萌發(fā)長出菌落后，調(diào)查其萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)卵孢子活力的影響

測(cè)定黑暗條件下，在培養(yǎng)基上不同交配型對(duì)峙培養(yǎng)15、18、21和24 d后卵孢子數(shù)量及活力（見表2）。測(cè)定結(jié)果表明，不同菌株組合和自育型菌株產(chǎn)生卵孢子的數(shù)量和活力均不同，但卵孢子數(shù)量和活力變化趨勢(shì)接近。隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)，卵孢子數(shù)量逐漸增多，但卵孢子活力逐漸下降。

此測(cè)定過程中，顯微鏡觀察MTT染色后卵孢子中，有紫色、豆沙紅、黑色卵孢子及未被染色的卵孢子（見圖1），未發(fā)現(xiàn)藍(lán)色卵孢子。

以上結(jié)果說明所測(cè)定卵孢子存活但處于休眠期。在黑暗條件下，A1和A2交配型菌株對(duì)峙培養(yǎng)15 d后卵孢子活力最高，培養(yǎng)24 d后卵孢子活力下降顯著。下一步試驗(yàn)中統(tǒng)一收集對(duì)峙培養(yǎng)15 d卵孢子懸浮液，對(duì)其復(fù)合處理，以提高卵孢子萌發(fā)率。

表2 不同菌株組合對(duì)峙培養(yǎng)產(chǎn)生卵孢子的數(shù)量與活力Table 2 Number and viability of oospores produced by different combinations of Phytophthora infestans strains

2.2 菌株組合對(duì)卵孢子活力的影響

測(cè)定不同菌株組合培養(yǎng)15 d后產(chǎn)生的卵孢子數(shù)量和活力（見表3）。測(cè)定結(jié)果表明，在相同條件下培養(yǎng)，不同菌株組合產(chǎn)生的卵孢子數(shù)量和活力差異較大，活力率0～80.9%，卵孢子數(shù)量0～4 867個(gè)·mL-1，同一菌株組合卵孢子數(shù)量與活力之間無相關(guān)性。產(chǎn)生卵孢子活力最高菌株組合為YKS-12×YKS-4，對(duì)峙培養(yǎng)15 d后活力率達(dá)80.9%。在所有供試菌株中，僅發(fā)現(xiàn)5個(gè)自育型菌株，自育型菌株產(chǎn)生的卵孢子活力普遍較低。菌株培養(yǎng)15 d后，卵孢子活力率最高達(dá)52.6%（見表2）。

綜合以上結(jié)果，選擇菌株組合KS-37×KS-25、KS-12×KS-49、KS-37×KS-49、YKS-12×YKS-4，YKS-15×YKS-4，自育型菌株KS-2、KS-48。分別收集每對(duì)菌株組合對(duì)峙培養(yǎng)15 d后及自育型菌株培養(yǎng)15 d后產(chǎn)生的卵孢子，用于下一步萌發(fā)試驗(yàn)。

表3 菌株組合對(duì)峙培養(yǎng)15 d后卵孢子活力及數(shù)量測(cè)定Table 3 Strain combinations were used to determine activity and the number of oospores cultured for 15 d

2.3 保存溫度及保存時(shí)間對(duì)卵孢子活力的影響

測(cè)定不同溫度下YKS12×YKS4雜交組合產(chǎn)生的卵孢子活力（見圖2），結(jié)果表明，0～15 d，卵孢子活力隨保存時(shí)間延續(xù)而下降，15～30 d，卵孢子活力隨保存時(shí)間延續(xù)而上升。-20、4、21℃保存15 d后，與對(duì)照相比（0 d），卵孢子活力均下降，-20、4、21℃保存的卵孢子活力率依次下降9.9%、26.6%、28.0%，且卵孢子仍處于休眠期，相比之下，-20℃保存15 d后卵孢子活力最高，21℃保存的卵孢子活力下降最多。30 d后，仍是-20℃保存的卵孢子活力最高，與對(duì)照相比（0 d），-20℃保存的卵孢子活力提高11.2%，但未發(fā)現(xiàn)度過休眠期的卵孢子，4℃保存的卵孢子活力比-20和21℃保存的卵孢子活力低且卵孢子均處于休眠期，21℃保存30 d的卵孢子活力略低于0 d卵孢子活力，但部分卵孢子進(jìn)入萌發(fā)期。與保存15 d后卵孢子相比，3個(gè)溫度保存30 d的卵孢子活力均顯著提高。

綜合以上結(jié)果，-20℃可保持卵孢子活力，21℃培養(yǎng)可促進(jìn)卵孢子進(jìn)入萌發(fā)期。因此，獲得卵孢子后可放置-20℃冰箱里保存，處理后用于萌發(fā)的卵孢子可放置21℃恒溫箱里培養(yǎng)。

2.4 不同復(fù)合處理對(duì)卵孢子萌發(fā)的影響

2.4.1 不同濃度H2O2溶液對(duì)卵孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用

不同濃度H2O2溶液對(duì)卵孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用結(jié)果見表4。采用MTT染色法，對(duì)不同濃度H2O2溶液處理后卵孢子作MTT染色，進(jìn)入萌發(fā)期卵孢子經(jīng)MTT溶液染色后變?yōu)樗{(lán)色（見圖3A）。結(jié)果表明，不同濃度H2O2溶液打破卵孢子休眠，卵孢子進(jìn)入萌發(fā)期比率隨H2O2溶液濃度增加而提高，21℃藍(lán)光培養(yǎng)5 d后，0.3%H2O2溶液對(duì)卵孢子萌發(fā)無促進(jìn)作用，0.7%H2O2溶液對(duì)卵孢子萌發(fā)促進(jìn)作用最佳，與對(duì)照相比，卵孢子進(jìn)入萌發(fā)期比率最高可增至95.9%，且部分卵孢子在0.7%H2O2溶液作用下，細(xì)胞壁變?。ㄗ?yōu)?層），原生質(zhì)外流，部分卵孢子在雄器上產(chǎn)生芽管（見圖3B）。隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)，0.3%和0.5%H2O2溶液對(duì)卵孢子促進(jìn)作用略增加，但0.7%H2O2溶液對(duì)卵孢子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，H2O2溶液對(duì)不同菌株組合卵孢子促進(jìn)作用不同，對(duì)KS-37×KS-25卵孢子促進(jìn)作用最佳。

綜合以上結(jié)果，本試驗(yàn)將0.7%H2O2溶液與卵孢子懸浮液1∶1混合，21℃藍(lán)光條件下培養(yǎng)5 d，再作下一步萌發(fā)處理。

表4 不同濃度H2O2及處理時(shí)間對(duì)不同雜交組合和自育型菌株產(chǎn)生的卵孢子萌發(fā)的影響Table 4 Effects of germination of different concentration and treatment time of H2O2to oospores produced by cross of different hybrid combinations and self-fertility strains of Phytophthora infestans

2.4.2 混合培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)卵孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用

培養(yǎng)基中瓊脂粉含量為1.0%，為卵孢子萌發(fā)提供充足水分，與對(duì)照（培養(yǎng)基⑤、⑥）相比，混合培養(yǎng)基對(duì)于提高卵孢子萌發(fā)率效果顯著，萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果表明（見表5），土壤和組織浸出液均為卵孢子萌發(fā)提供所需營養(yǎng)物質(zhì)，優(yōu)于瓊脂培養(yǎng)基促進(jìn)作用，其中土壤浸出液與黑麥培養(yǎng)基以1∶1混合的培養(yǎng)基對(duì)卵孢子萌發(fā)促進(jìn)效果最佳，最高萌發(fā)率為19%，與雜交組合產(chǎn)生的卵孢子相比，自育型菌株產(chǎn)生的卵孢子萌發(fā)率相對(duì)較低。

不同菌株組合雜交產(chǎn)生的卵孢子萌發(fā)率不同，部分菌株組合卵孢子即使經(jīng)一系列萌發(fā)處理卵孢子仍未萌發(fā)，如菌株組合KS-12×KS-49，自育型菌株KS-2，菌株組合KS-37×KS-49、YKS-15×YKS-4萌發(fā)率雖有所提高，但卵孢子萌發(fā)后成活率較低，后代菌絲生長薄弱，無法開展下一步研究。

以上研究結(jié)果顯示，菌株組合對(duì)卵孢子萌發(fā)的影響較大，篩選優(yōu)勢(shì)菌株組合也是提高卵孢子萌發(fā)率的關(guān)鍵。

表5 不同菌株組合在混合培養(yǎng)基上的卵孢子萌發(fā)率Table 5 Oospore germination rates of different strain combinations on mixed medium

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)在卵孢子形成過程研究中，采用MTT染色法分別測(cè)定馬鈴薯晚疫病菌培養(yǎng)時(shí)間、菌株組合、保存溫度及保存時(shí)間對(duì)卵孢子活力的影響，計(jì)算卵孢子活力率。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同菌株組合和自育型菌株產(chǎn)生的卵孢子數(shù)量和活力均不同。隨雜交時(shí)間延續(xù)，卵孢子數(shù)量逐漸增多，但卵孢子活力逐漸下降。菌株組合對(duì)峙培養(yǎng)15 d或自育型菌株培養(yǎng)15 d后，卵孢子活力最高。卵孢子活力率隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而降低，與楊芮等測(cè)定晚疫病菌卵孢子活力趨勢(shì)一致[23]。不同菌株組合產(chǎn)生的卵孢子活力不同，與Median等研究結(jié)果一致[24]。梁靜思等認(rèn)為這種差異源自A2交配型親本的差異性[25]。在活力測(cè)定過程中并未發(fā)現(xiàn)被染成藍(lán)色的卵孢子，方志國研究中發(fā)現(xiàn)相同現(xiàn)象[26]，并認(rèn)為這與培養(yǎng)時(shí)間短，或者卵孢子活力隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而完全失去活力有關(guān)。

在卵孢子萌發(fā)條件探索試驗(yàn)中，試驗(yàn)結(jié)果表明不同溫度對(duì)卵孢子活力影響不同，在0～15 d，卵孢子活力隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而下降，在15～30 d，隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)，卵孢子活力升高，-20℃可保持卵孢子活力，21℃培養(yǎng)可促進(jìn)卵孢子進(jìn)入萌發(fā)期。土壤和組織浸出液配制而成的混合培養(yǎng)基均促進(jìn)卵孢子萌發(fā)，其中土壤浸出液與黑麥培養(yǎng)基以1∶1混合而成的培養(yǎng)基對(duì)卵孢子萌發(fā)促進(jìn)作用最佳，卵孢子最高萌發(fā)率為19%。卵孢子懸浮液分別置于-20、4、21℃條件下培養(yǎng)0～15 d，卵孢子活力隨時(shí)間推移顯著下降，與Mayton等結(jié)果一致[27]。H2O2溶液促進(jìn)卵孢子進(jìn)入萌發(fā)期，卵孢子進(jìn)入萌發(fā)期比率隨H2O2溶液濃度增大而提高，這表明H2O2打破卵孢子休眠，與張艷菊等研究結(jié)果一致[28]，卵孢子經(jīng)0.7%H2O2溶液處理后，卵孢子進(jìn)入萌發(fā)期比率最高可達(dá)95.9%。卵孢子萌發(fā)率和菌株組合密切相關(guān)，與Pittis等報(bào)道一致[21]。土壤和組織浸出液配制而成的混合培養(yǎng)基均促進(jìn)卵孢子萌發(fā)，其中土壤浸出液與黑麥培養(yǎng)基以1:1混合而成的培養(yǎng)基對(duì)卵孢子萌發(fā)促進(jìn)作用最佳，通過一系列復(fù)合處理，卵孢子最高萌發(fā)率為19%，與雜交組合產(chǎn)生的卵孢子相比，自育型菌株產(chǎn)生的卵孢子萌發(fā)率相對(duì)較低。不同菌株組合對(duì)卵孢子形成、活力及萌發(fā)均有影響，主要原因是在本試驗(yàn)所用親本菌株活力和不同交配型菌株之間親和性密切相關(guān)。但這種影響與親本菌株基因型間無相關(guān)性。

綜上所述，研究明確培養(yǎng)時(shí)間、菌株組合、保存溫度及保存時(shí)間、不同濃度H2O2溶液、混合培養(yǎng)基質(zhì)等因素對(duì)馬鈴薯晚疫病菌卵孢子形成及萌發(fā)的影響，為進(jìn)一步開展晚疫病菌遺傳變異奠定基礎(chǔ)。