金正勛，王思宇，王 珊，王 劍，張忠臣，李鋼夑，樸鐘澤

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.韓國(guó)農(nóng)村振興廳農(nóng)業(yè)科學(xué)院，全羅北道 全州 54874，3.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，上海 201403）

淀粉和蛋白質(zhì)是水稻胚乳主要儲(chǔ)藏物質(zhì)，也是碳氮代謝最終產(chǎn)物，其含量和分子結(jié)構(gòu)等對(duì)稻米蒸煮食味品質(zhì)影響較大[1]。籽粒淀粉合成積累代謝過程復(fù)雜，經(jīng)一系列酶促反應(yīng)，參與酶種類較多，其中ADPG焦磷酸化酶（AGPase）、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SSs）、淀粉分支酶（BEs）、異淀粉酶（ISA）是參與該酶促反應(yīng)關(guān)鍵酶，酶活性強(qiáng)弱直接影響淀粉組分含量和精細(xì)結(jié)構(gòu)等，各關(guān)鍵酶均有很多同工酶和相應(yīng)同工型基因，OsGBSS1、OsAGPL2、OsSSSⅠ、OsSBEⅡb和OsISA1是在水稻胚乳中特異性表達(dá)且表達(dá)量較大的同工型基因之一，各種同工型基因表達(dá)均與淀粉組分含量和結(jié)構(gòu)關(guān)系密切[2-3]。OsRSR1（Rice starch regulator 1）基因編碼的蛋白是水稻眾多轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)，屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與淀粉合成調(diào)控，OsRSR1基因過表達(dá)使種子中淀粉合成基因下調(diào)表達(dá)，OsRSR1缺乏導(dǎo)致種子中淀粉合成基因表達(dá)量增加[4]。谷氨酰胺合成酶是調(diào)控蛋白質(zhì)合成代謝關(guān)鍵酶之一，OsGS1;3基因是GS同工型基因之一，在籽粒中表達(dá)量較高[5]。

DNA轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)重要調(diào)控節(jié)點(diǎn)，其轉(zhuǎn)錄速度和量影響酶活性，調(diào)控性狀表現(xiàn)。圍繞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道[6-7]，但外源激素對(duì)水稻籽粒碳氮代謝相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響報(bào)道較少。鑒于外源激素和氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)水稻生理特性、葉片衰老及活性氧代謝[8-9]、產(chǎn)量和品質(zhì)等產(chǎn)生較大影響，是水稻生產(chǎn)上廣泛使用的調(diào)控措施，且上述碳氮代謝相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)性狀影響較大，本試驗(yàn)選用不同類型粳稻品種比較分析灌漿成熟期籽粒碳氮代謝相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量對(duì)外源激素和氮素營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的響應(yīng)變化，旨在闡明外源激素與基因表達(dá)關(guān)系和淀粉品質(zhì)形成分子調(diào)控機(jī)理，為建立優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)選用寒地稻作區(qū)具有代表性穗數(shù)型國(guó)標(biāo)一級(jí)優(yōu)質(zhì)米中晚熟品種龍稻18號(hào)和穗重型晚熟超級(jí)稻品種松粳9號(hào)，供試的兩個(gè)不同類型品種在哈爾濱地區(qū)均安全成熟。

1.2 試驗(yàn)方法及處理

試驗(yàn)于2018年和2019年在黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院內(nèi)開展盆栽試驗(yàn)，盆規(guī)格為長(zhǎng)60 cm、寬40 cm、高40 cm，盆栽用土過篩混拌均勻后等量裝盆。4月5日播種，大缽體盤育苗，每孔單粒點(diǎn)播催芽籽，大棚旱育秧管理。5月15日選取長(zhǎng)勢(shì)一致秧苗插秧，行距30 cm，穴距10 cm，每穴插3棵苗，每盆插2行8穴，每個(gè)處理插3盆，每個(gè)品種各處理3次重復(fù)，正常水管理?？偸┑繛榧兊?0 kg·hm-2，以盆表面積折算成每盆施氮量和磷鉀肥施用量，N∶P2O5∶K2O比例為1∶0.5∶0.8。氮肥為尿素，磷肥為磷酸二銨，鉀肥為硫酸鉀。施肥方法為磷肥全作基肥施，鉀肥50%作基肥，50%作穗肥施，氮肥50%作基肥，30%作分蘗肥，20%作穗肥施。插秧前3 d施入基肥與上層20 cm土壤混拌均勻，然后灌水泡土，插秧后15 d施分蘗肥，幼穗分化始期施穗肥。

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為齊穗期至灌漿初期葉面噴外源激素6-芐氨基嘌呤（6-BA）和脫落酸（ABA）及齊穗期增施總施氮量20%氮肥（以下稱為增施氮肥處理N），以噴施等量清水作空白對(duì)照。其中地上部葉片表面噴施50 mg·L-16-BA、10 mg·L-1ABA，每盆每次噴液量為150 mL，自齊穗期開始每隔5 d噴施1次，共噴3次。為使激素附著于植株上，噴施前加入1%吐溫20。每次噴施6-BA和ABA溶液時(shí)，施氮處理和對(duì)照表面噴清水，以免水分干擾。抽穗前盆栽場(chǎng)搭建遮雨棚，以防降雨干擾，保證正常葉面噴施處理。

1.3 取樣方法

抽穗時(shí)每個(gè)品種各處理選取長(zhǎng)勢(shì)一致且在同一天抽出葉鞘3 cm稻穗掛牌標(biāo)記，自標(biāo)記后第10、20、30天取標(biāo)記穗，每個(gè)品種各處理每次取5個(gè)穗，迅速液氮處理后選取灌漿程度接近的穗中部籽粒于冰浴中去穎殼，放入凍存管密封，置于-80℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量測(cè)定

根據(jù)基因登陸號(hào)從NCBI上搜索并獲取淀粉合成相關(guān)酶同工型基因OsGBSS1、OsSSSI、OsISA1、OsAGPL2、OsSBEⅡb、OsRSR1和谷氨酰胺合成酶同工型基因OsGS1;3以及Ubi5內(nèi)參基因序列，然后通過BLAST確定各序列CDS區(qū)準(zhǔn)確性。分別將各基因CDS區(qū)序列輸入Primer Premier 5.0軟件中，限定所需引物和產(chǎn)物長(zhǎng)度等獲得一系列引物，從中選取長(zhǎng)度合適且無錯(cuò)配、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等引物，委托上海生工生物有限公司合成引物（見表1）。選用表1列出引物對(duì)灌漿不同時(shí)期各處理籽粒樣品cDNA檢測(cè)熒光定量PCR。本試驗(yàn)藥品選用愚公生命科技有限公司提供的NOVA?TaqSYB?Green qPCR Premix，儀器使用Roche LightCyclerTM。參照Delte-DelteCt法分析基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量[10]，①ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）；②ΔΔCt=ΔCt（試驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組）；③基因表達(dá)量=2-ΔΔCt。

基因上調(diào)率（%）=（各處理基因表達(dá)量-對(duì)照基因表達(dá)量）/對(duì)照基因表達(dá)量×100%。

基因衰減率（%）=（20 d基因表達(dá)量-30 d基因表達(dá)量）/20 d基因表達(dá)量×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2018年和2019年試驗(yàn)結(jié)果接近，本文主要根據(jù)2019年試驗(yàn)結(jié)果處理并分析數(shù)據(jù)，使用Excel 2007和SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)并生成圖表。

表1 RT-qPCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of RT-qPCR reaction primer

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素對(duì)灌漿不同時(shí)期籽粒OsGBSS1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的影響

不同類型品種灌漿不同時(shí)期籽粒OsGBSS1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量處理間多重比較結(jié)果列于表2。

供試的兩個(gè)不同類型品種在灌漿不同時(shí)期，葉面噴施6-BA和ABA及增施氮肥處理的籽粒OsGBSS1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于同時(shí)期噴水對(duì)照，其中抽穗后10和30 d葉面噴施6-BA和ABA處理的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量又顯著高于增施氮肥處理，而抽穗后20 d顯著低于增施氮肥處理。從抽穗后20 d的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)率比較可知，供試的穗重型超級(jí)稻品種松粳9號(hào)和穗數(shù)型優(yōu)質(zhì)品種龍稻18號(hào)均為增施氮肥處理的上調(diào)率最大，分別為133.22%和242.65%，其次6-BA分別為50.52%和154.36%，ABA上調(diào)率最小，分別為46.52%和123.85%，平均上調(diào)率優(yōu)質(zhì)品種龍稻18號(hào)為201.94%顯著大于超級(jí)稻品種松粳9號(hào)的112.54%（見表2）。說明葉面處理外源激素6-BA和ABA及增施氮肥處理均顯著上調(diào)灌漿過程中籽粒OsGBSS1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量受外源因素調(diào)控作用較大，且基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)程度因品種類型及灌漿時(shí)期不同而有顯著差異，優(yōu)質(zhì)品種基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量受外源調(diào)控因素影響大于超級(jí)稻品種。

在灌漿過程中供試的兩個(gè)不同類型品種各處理籽粒OsGBSS1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均呈單峰曲線變化，隨灌漿進(jìn)程基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸上升，抽穗后20 d達(dá)峰值，此后開始下降。但下降速率和程度不同外源因素間差異較大。從抽穗后20～30 d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量衰減率比較可知，松粳9號(hào)和龍稻18號(hào)兩個(gè)不同類型品種均為增施氮肥處理的衰減率最大，分別為62.79%和71.76%，明顯高于噴水對(duì)照的衰減率40.09%和30.51%，6-BA衰減率分別為13.46%和30.88%，ABA衰減率分別為22.43%和26.84%，均低于比噴水對(duì)照（見表2）。說明灌漿中后期籽粒OsGBSS1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量下降速率和程度與外源調(diào)控因素間關(guān)系密切，不同外源調(diào)控因素對(duì)灌漿中后期籽粒OsGBSS1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量調(diào)控作用機(jī)理差異明顯。

表2 灌漿不同時(shí)期處理間OsGBSS1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table 2 Comparition of mRNA transcription expression quantity of OsGBSS1 in rice sword between different fertility treatments during grain filling stage

2.2 外源激素對(duì)灌漿不同時(shí)期籽粒OsAGPL2和OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的影響

不同類型品種灌漿不同時(shí)期籽粒OsAGPL2和OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量處理間多重比較結(jié)果列于表3。兩個(gè)不同類型品種在灌漿不同時(shí)期，葉面噴施6-BA和ABA及增施氮肥處理的籽粒OsAGPL2和OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于同時(shí)期噴水對(duì)照，不同處理兩種基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量依次為6-BA＞ABA＞N＞CK，各時(shí)期不同處理間差異達(dá)顯著水平。從抽穗后20 d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)率比較可知，松粳9號(hào)和龍稻18號(hào)均為6-BA處理上調(diào)率最大，其次是ABA處理，而增施氮肥處理上調(diào)率最小，籽粒OsAGPL2和OsSSSⅠ基因平均上調(diào)率超級(jí)稻品種松粳9號(hào)分別為87.36%和208.58%，顯著大于優(yōu)質(zhì)品種龍稻18號(hào)的72.24%和64.87%（見表3）。說明葉面處理外源激素6-BA和ABA及增施氮肥處理均顯著上調(diào)灌漿過程中籽粒OsAGPL2和OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，其中外源激素調(diào)控作用又顯著優(yōu)于增施氮肥處理，且基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)程度因品種類型及灌漿時(shí)期不同而差異較大，超級(jí)稻品種基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量受外源調(diào)控因素影響高于優(yōu)質(zhì)品種。

在灌漿過程中供試的兩個(gè)不同類型品種各處理籽粒OsAGPL2和OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均呈單峰曲線變化，隨灌漿進(jìn)程基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸上升，抽穗后20 d達(dá)峰值，此后開始下降。但下降速率和程度不同外源因素間差異較大。從抽穗后20 d至30 d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量衰減率比較可知，對(duì)于OsAGPL2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量而言，松粳9號(hào)和龍稻18號(hào)均為6-BA衰減率最大，分別為61.06%和57.37%，其次是增施氮肥處理衰減率55.81%和ABA衰減率53.20%，再次是ABA衰減率53.19%和增施氮肥處理衰減率51.53%，噴水對(duì)照衰減率分別為41.48%和39.17%，各處理衰減率均高于噴水對(duì)照；對(duì)于OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量而言，松粳9號(hào)為6-BA處理衰減率最大，為71.47%，而龍稻18號(hào)ABA處理衰減率最大，為56.42%，松粳9號(hào)ABA和增施氮肥處理間及龍稻18號(hào)6-BA和增施氮肥處理間衰減率差異均較小，但均高于噴水對(duì)照，其中松粳9號(hào)處理與對(duì)照間差異較大（見表3）。說明灌漿中后期籽粒OsAGPL2和OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量下降速率和程度與外源調(diào)控因素間關(guān)系密切，不同外源調(diào)控因素對(duì)灌漿中后期籽粒OsAGPL2和OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量調(diào)控作用機(jī)理差異明顯。

表3 灌漿不同時(shí)期處理間OsAGPL2和OsSSSⅠ基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table 3 Comparition of mRNA transcription expression quantity of OsAGPL2 and OsSSSⅠin rice sword between different fertility treatments during grain filling stage

2.3 外源激素對(duì)灌漿不同時(shí)期籽粒OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的影響

不同類型品種灌漿不同時(shí)期籽粒OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量處理間多重比較結(jié)果見表4。

兩個(gè)不同類型品種在灌漿不同時(shí)期，葉面噴施6-BA和ABA及增施氮肥處理的籽粒OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均顯著高于同時(shí)期噴水對(duì)照，且各時(shí)期不同處理間差異均達(dá)顯著水平，灌漿不同時(shí)期OsSBEⅡb基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量依次是6-BA＞ABA＞N＞CK，OsISA1基因抽穗后10 d順序是ABA＞6-BA＞N＞CK，抽穗后20 d順序是N＞6-BA＞ABA＞CK，抽穗后30 d順序是6-BA＞N＞ABA＞CK。從抽穗后20 d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)率比較可知，OsSBEⅡb基因?yàn)樗删?號(hào)和龍稻18號(hào)均為6-BA處理的上調(diào)率最大，分別為498.69%和782.96%，其次是ABA處理，分別為266.48%和525.97%，而增施氮肥處理的上調(diào)率最小，分別為220.75%和364.20%；OsISA1基因?yàn)樵鍪┑侍幚淼纳险{(diào)率最大，分別為466.22%和284.79%，其次是6-BA處理，分別為194.43%和189.22%，ABA處理的上調(diào)率最小，分別為147.25%和148.03%。籽粒OsSBEⅡb和OsISA1基因平均上調(diào)率超級(jí)稻品種松粳9號(hào)分別為328.64%和269.30%，優(yōu)質(zhì)品種龍稻18號(hào)分別為557.71%和207.34%，不同類型品種和基因間上調(diào)率差異較大（見表4）。說明葉面處理外源激素6-BA和ABA及增施氮肥處理均顯著上調(diào)灌漿過程中籽粒OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，其中外源激素對(duì)籽粒OsSBEⅡb基因上調(diào)表達(dá)作用顯著大于增施氮肥處理，但OsISA1基因?yàn)樵鍪┑侍幚淼纳险{(diào)表達(dá)作用顯著大于外源激素，基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)程度因品種類型和基因及灌漿時(shí)期不同而差異較大。

在灌漿過程中供試的兩個(gè)不同類型品種各處理籽粒OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均呈單峰曲線變化，隨灌漿進(jìn)程基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸上升，抽穗后20 d達(dá)到峰值，之后開始下降。但下降速率和程度不同外源因素間差異較大。從抽穗后20 d至30 d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量衰減率比較可知，對(duì)于OsSBEⅡb基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量而言，松粳9號(hào)和龍稻18號(hào)均為6-BA衰減率最大，分別為73.29%和80.56%，其次是松粳9號(hào)增施氮肥處理和龍稻18號(hào)ABA處理的衰減率，分別為67.10%和75.40%，而松粳9號(hào)ABA處理和龍稻18號(hào)增施氮肥處理的衰減率最小，分別為57.16%和74.92%，噴水對(duì)照衰減率分別為5.45%和1.26%，各處理衰減率均高于噴水對(duì)照；對(duì)于OsISA1基因而言，松粳9號(hào)和龍稻18號(hào)均為增施氮肥處理的衰減率最大，分別為62.46%和59.38%，其次是ABA處理，分別為50.00%和49.13%，而6-BA處理衰減率最小，分別為21.90%和37.34%，噴水對(duì)照衰減率分別為7.74%和3.08%，各處理衰減率均高于噴水對(duì)照（見表4）。說明灌漿中后期籽粒OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量下降速率和程度與外源調(diào)控因素間關(guān)系密切，不同外源調(diào)控因素對(duì)灌漿中后期籽粒OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量調(diào)控作用機(jī)理差異明顯。

表4 灌漿不同時(shí)期處理間OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table 4 Comparition of mRNA transcription expression quantity of OsSBEⅡb and OsISA1 in rice sword between different fertility treatments during grain filling stage

2.4 外源激素對(duì)灌漿不同時(shí)期籽粒OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的影響

OsRSR1是調(diào)控淀粉合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因，不同類型品種灌漿不同時(shí)期籽粒OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量處理間多重比較結(jié)果見表5。

兩個(gè)不同類型品種在灌漿不同時(shí)期，葉面噴施6-BA和ABA及增施氮肥處理的籽粒OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均顯著低于同時(shí)期噴水對(duì)照，灌漿不同時(shí)期OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量依次是CK＞N＞ABA＞6-BA，且各時(shí)期不同處理間差異均達(dá)顯著水平。從抽穗后20 d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量下調(diào)率比較可知，松粳9號(hào)和穗數(shù)型優(yōu)質(zhì)品種龍稻18號(hào)均為6-BA處理的下調(diào)率最大，分別為27.93%和27.73%，其次是ABA處理，分別為11.00%和11.49%，增施氮肥處理的下調(diào)率最小，分別為3.86%和3.45%，平均下調(diào)率超級(jí)稻品種松粳9號(hào)為14.26%，優(yōu)質(zhì)品種龍稻18號(hào)為14.22%，兩品種間幾乎無差異（見表5）。說明葉面處理外源激素6-BA和ABA及增施氮肥處理顯著下調(diào)灌漿過程中籽粒OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，其受外源因素調(diào)控作用較大，且基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量下調(diào)程度不因品種類型發(fā)生較大變化。

在灌漿過程中供試的兩個(gè)不同類型品種各處理籽粒OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均隨灌漿進(jìn)程逐漸下降，抽穗后20 d達(dá)到最低谷后再逐漸上升，呈V字形變化動(dòng)態(tài)，但上升速率和程度不同外源調(diào)控因素間差異較大。從抽穗后20d至30d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上升率比較可知，松粳9號(hào)和龍稻18號(hào)均為6-BA處理的上升率最大，分別為65.15%和72.37%，明顯高于噴水對(duì)照的上升率44.87%和55.60%，增施氮肥處理的上升率分別為43.12%和46.28%，低于噴水對(duì)照，ABA處理的松粳9號(hào)為47.41%，高于噴水對(duì)照，龍稻18號(hào)為53.57%，低于噴水對(duì)照（見表5）。說明灌漿中后期籽粒OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上升速率和程度與外源調(diào)控因素間關(guān)系密切，不同外源調(diào)控因素對(duì)灌漿中后期籽粒OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量調(diào)控作用機(jī)理差異明顯。

2.5 外源激素對(duì)灌漿不同時(shí)期籽粒OsGS1;3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的影響

不同類型品種灌漿不同時(shí)期籽粒OsGS1;3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量處理間多重比較結(jié)果見表6。

表5 灌漿不同時(shí)期處理間OsRSR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table 5 Comparition of mRNA transcription expression quantity of OsRSR1 in rice sword between different fertility treatments during grain filling stage

表6 灌漿不同時(shí)期處理間OsGS1;3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較Table 6 Comparition of mRNA transcription expression quantity of OsGS1;3 in rice sword between different fertility treatments during grain filling stage

兩個(gè)不同類型品種在灌漿不同時(shí)期，葉面噴施6-BA和增施氮肥處理的籽粒OsGS1;3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均顯著高于同時(shí)期噴水對(duì)照，而ABA處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均顯著低于同時(shí)期噴水對(duì)照，灌漿不同時(shí)期基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量依次是N＞6-BA＞CK＞ABA，且各時(shí)期不同處理間差異均達(dá)顯著水平。從抽穗后20 d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)率和下調(diào)率比較可知，松粳9號(hào)和龍稻18號(hào)均為增施氮肥處理的上調(diào)率最大，分別為241.79%和457.24%，其次是6-BA處理的下調(diào)率分別為197.84%和249.62%，ABA處理的下調(diào)率分別為29.55%和13.12%，平均上調(diào)率龍稻18號(hào)為353.43%，顯著高于超級(jí)稻品種松粳9號(hào)219.82%，品種間下調(diào)率差異并不大（見表6）。說明葉面處理外源激素6-BA和增施氮肥處理顯著上調(diào)灌漿過程中籽粒OsGS1:3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，但ABA處理顯著下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，其受外源因素調(diào)控作用較大，且基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)程度因品種類型及灌漿時(shí)期不同而差異顯著，優(yōu)質(zhì)品種受外源調(diào)控因素影響高于超級(jí)稻品種。

在灌漿過程中供試的兩個(gè)不同類型品種各處理籽粒OsGS1;3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均呈單峰曲線變化，隨灌漿進(jìn)程基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸上升，抽穗后20 d達(dá)到峰值，之后開始下降。但下降速率和程度不同外源因素間差異較大。從抽穗后20～30 d基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量衰減率比較可知，品種間和外源因素間衰減率差異較大，松粳9號(hào)6-BA和增施氮肥處理的衰減率分別為75.75%和58.40%，顯著高于噴水對(duì)照的衰減率17.72%，ABA處理的衰減率為15.57%，低于噴水對(duì)照；優(yōu)質(zhì)品種龍稻18號(hào)6-BA和增施氮肥處理的衰減率分別為82.54%和82.34%，顯著高于噴水對(duì)照的衰減率40.14%，ABA處理的衰減率為38.99%，低于噴水對(duì)照（見表6）。說明灌漿中后期籽粒OsGS1;3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量下降速率和程度與外源調(diào)控因素間關(guān)系密切，不同外源調(diào)控因素對(duì)灌漿中后期籽粒OsGS1;3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的調(diào)控作用機(jī)理差異明顯。

3 討論與結(jié)論

基因轉(zhuǎn)錄為基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一，其表達(dá)量受遺傳因素控制，也受氮素營(yíng)養(yǎng)、溫度、水分等外源環(huán)境因素影響。在OsRSR1突變體中與淀粉合成有關(guān)的OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPS2、OsGBSSI、OsSSSI等15個(gè)基因表達(dá)均被上調(diào)[4]，其轉(zhuǎn)錄水平受干旱、高鹽[11]抑制，進(jìn)而調(diào)控下游逆境相關(guān)基因表達(dá)，以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境。研究表明，適當(dāng)增加氮肥濃度處理對(duì)水稻OsGBSS1、OsISAs和OsGS基因mRNA表達(dá)量起正向調(diào)控作用[12-13]。沈直等研究表明，增溫處理使籽粒中OsAGPase、OsSSS和OsSBE同工型酶基因表達(dá)水平上調(diào)，而OsGBSS同工型酶基因表達(dá)水平下調(diào)[14]。干旱脅迫下水稻胚乳中Wx基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照[15]，盧紅芳等則認(rèn)為干旱提高TaGBSS1表達(dá)[16]。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，噴施6-BA和ABA及齊穗期增施氮肥處理均顯著上調(diào)灌漿過程中籽粒OsGBSS1、OsAGPL2、OsSSSⅠ、OsSBEⅡb和OsISA1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子基因OsRSR1轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，且噴施外源激素上調(diào)或下調(diào)效果均強(qiáng)于增施氮肥；噴施6-BA和增施氮肥使OsGS1;3基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而噴施ABA使OsGS1;3轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。表明灌漿過程中籽粒碳氮代謝相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量受外源激素影響較大，其影響程度甚至超過增施氮肥處理，且不同作用性質(zhì)的激素對(duì)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量影響并不一致，既有正向調(diào)控激素，也有負(fù)向調(diào)控激素，同時(shí)不同基因?qū)ν庠醇に卣{(diào)控響應(yīng)也不同，既有上調(diào)表達(dá)基因，也有下調(diào)表達(dá)基因。本試驗(yàn)中噴施外源激素時(shí)基因上調(diào)或下調(diào)表達(dá)效果顯著，但一段時(shí)間后基因表達(dá)量顯著衰減，表明基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與植株體內(nèi)外源激素濃度關(guān)系密切，保持適當(dāng)濃度激素是基因持續(xù)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的必需條件。鑒于基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與酶活性線性關(guān)系密切，基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量高，酶活性強(qiáng)，否則酶活性低。酶活性直接影響性狀表現(xiàn)程度，酶活性高性狀表現(xiàn)強(qiáng)，反之表現(xiàn)弱?？芍蜣D(zhuǎn)錄表達(dá)量調(diào)控是外源激素和氮素營(yíng)養(yǎng)等對(duì)生物性狀調(diào)控作用的分子基礎(chǔ)，如何調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量有待深入研究。

圍繞肥料、外源激素、溫度等環(huán)境因素對(duì)稻米蒸煮食味品質(zhì)的影響國(guó)內(nèi)外從生理生化及分子水平上已開展大量研究，但基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控層面研究報(bào)道較少。劉海英研究結(jié)果表明，噴施6-BA加速籽粒中淀粉組分積累，調(diào)節(jié)支/直淀粉比例進(jìn)而改善籽粒淀粉品質(zhì)[17]。外源ABA調(diào)節(jié)籽粒灌漿過程，影響產(chǎn)量和稻米品質(zhì)[18]。金正勛等研究結(jié)果表明，齊穗期增施氮肥因顯著提高稻米蛋白質(zhì)含量而降低稻米蒸煮食味品質(zhì)[19]。OsGBSS1、OsAGPL2、OsSSSⅠ、OsSBEⅡb、OsISA1和OsGS1;3基因在水稻籽粒中特異性表達(dá)，是參與籽粒淀粉和蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵酶基因。顆粒結(jié)合淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶、ADPG焦磷酸化酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶、谷氨酰胺合成酶和轉(zhuǎn)錄因子OsRSR1參與籽粒淀粉和蛋白質(zhì)合成代謝，并影響淀粉組分含量和精細(xì)結(jié)構(gòu)等。水稻OsGBSSI表達(dá)受阻，導(dǎo)致胚乳中幾乎不含直鏈淀粉[20]，OsGBSS1基因mRNA表達(dá)量與直鏈淀粉含量同步變化[21]；SBE酶催化支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)，高溫導(dǎo)致水稻胚乳中SBE酶活性顯著下降，稻米支鏈淀粉長(zhǎng)B鏈比例有所降低[22]。而OsSBEⅡb和OsISA1表達(dá)影響支鏈淀粉含量與精細(xì)結(jié)構(gòu)，精細(xì)結(jié)構(gòu)和淀粉糊化特性影響稻米品質(zhì)，表現(xiàn)為支鏈淀粉中短鏈含量高，有利于糊化、米飯口感好[23]；谷氨酰胺合成酶活性提高有利于水稻籽粒灌漿過程[24]，OsGS1;3基因mRNA表達(dá)量與籽粒谷氨酰胺合成酶活性關(guān)系密切[25]。由本試驗(yàn)可知，淀粉及蛋白質(zhì)合成相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)受外源激素和氮素營(yíng)養(yǎng)調(diào)控影響較大，而基因轉(zhuǎn)錄為基因表達(dá)調(diào)控重要環(huán)節(jié)，表達(dá)量直接影響酶活性，影響表觀性狀或碳氮化合物合成積累。本試驗(yàn)選擇的碳氮代謝相關(guān)酶基因是眾多酶基因中的一小部分，但卻是參與淀粉和蛋白質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵酶基因，酶活性變化直接影響淀粉和蛋白質(zhì)含量及分子結(jié)構(gòu)，影響稻米蒸煮食味品質(zhì)。因此，外源激素或氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)稻米蒸煮食味品質(zhì)的影響通過籽粒碳氮代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量調(diào)控實(shí)現(xiàn)。由于淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)對(duì)稻米蒸煮食味品質(zhì)影響非常大，深入研究外源激素與各種基因表達(dá)調(diào)控及淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)間關(guān)系，對(duì)提高稻米蒸煮食味品質(zhì)及建立環(huán)保型高效優(yōu)質(zhì)水稻栽培技術(shù)具有重要實(shí)踐意義。