劉安娜 ，蘇 雅，馬紫瑤，彭屹峰，肖體喬，杜國浩，何 偉

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院放射科，上海 200062；2.中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，上海 200129；3.中國科學(xué)院北京高能物理研究所同步輻射實(shí)驗(yàn)室，北京 100049）

X射線是一種光，當(dāng)X射線穿過物質(zhì)并與物質(zhì)發(fā)生作用后，其折射率可寫成n=1-δ-iβ［1］，其中β 為吸收項(xiàng)，δ 為相位項(xiàng)，理論上在醫(yī)學(xué)診斷使用能段范圍，相位項(xiàng)比吸收項(xiàng)大1 000多倍，因此在吸收襯度很難探測(cè)的情況下仍有可能觀察到相位的襯度。傳統(tǒng)X射線成像混有折射和散射信息，因而降低了成像分辨力和襯度，而相位襯度成像利用X射線透過樣品后攜帶的相位信息對(duì)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，克服了傳統(tǒng)成像方法的不足。常見的相位襯度成像技術(shù)有：類同軸成像（1995年發(fā)現(xiàn)）、衍射增強(qiáng)成像（diffraction enhanced imaging，DEI，1995年發(fā)現(xiàn)）、干涉法成像（1971年發(fā)現(xiàn)）及光柵成像技術(shù)4種（2002年發(fā)現(xiàn)）［2-4］。同步輻射是速度接近光速的帶電粒子在作曲線運(yùn)動(dòng)時(shí)沿軌道切線方向發(fā)出的電磁輻射。由于同步輻射光的相干特性，其適于在相干襯度成像中應(yīng)用。目前國際上大多數(shù)的同步輻射裝置都有光束線能夠開展相位襯度成像研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用同步輻射光源對(duì)大鼠肝臟行相位襯度成像實(shí)驗(yàn)，以分辨率和襯度作為主要評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)4種不同相位襯度成像方法進(jìn)行比較，探討相位襯度成像技術(shù)在肝臟組織上的成像價(jià)值及臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇4只8個(gè)月大小的SD大鼠，處死后取出肝臟，經(jīng)35%～40%甲醛水溶液固定24 h后，取出干燥后置于樣品架上，固定前同時(shí)行病理學(xué)常規(guī)HE染色。動(dòng)物來源于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（滬2013-0055）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 成像方法 4種成像方法成像光路設(shè)計(jì)不同。類同軸成像光路通過X射線經(jīng)樣品后直接成像。衍射增強(qiáng)成像則是在樣品后方添加一塊分析晶體，獲得搖擺曲線（衍射強(qiáng)度隨角度的變化曲線）后，選擇在峰位和側(cè)位不同位置，曝光時(shí)間5～10 s（以總曝光量達(dá)到飽和曝光量的75%為宜，與掃描位置、光束能量的實(shí)際值有關(guān)）。干涉法成像是在樣品后方放置3塊平行的由一整塊硅單晶分割成的晶體。光柵成像是在樣品后方與探測(cè)器之間放置一塊自成像光柵和分析光柵。X射線能量范圍主要分布在3～22 keV，實(shí)驗(yàn)采用12 keV。

探測(cè)器使用X射線CCD（charge couple device，電荷耦合器件）成像系統(tǒng)采集圖像。

1.3 圖像評(píng)價(jià) 所獲得的圖像一方面與病理切片進(jìn)行對(duì)照；另一方面通過實(shí)物顯微放大的方法測(cè)定其分辨率，即最細(xì)血管直徑的平均值。使用NIH Image J program（version 1.37；National Institutes of Health，USA），血管顯示級(jí)數(shù)判斷：將主干血管作為初級(jí)，出現(xiàn)一次分支后升級(jí)成為2級(jí)，依次類推。

2 結(jié)果

4種相位襯度成像均可顯示肝臟的8級(jí)分支血管，血管直徑從主干到外周分支逐漸變細(xì)（圖1），經(jīng)顯微放大法測(cè)量最細(xì)血管直徑約30 μm。每種技術(shù)獲得的圖像具有不同特征：類同軸成像（圖1a），利用同步光源的相干性和高亮度等特性直接成像，其圖像分辨率較高但平面感偏強(qiáng)；光柵成像（圖1b）利用2塊光柵形成的角分辨能力來讀取樣品的折射角信號(hào)，造成豎直血管兩側(cè)的明暗變化，使血管凹陷下去，形成強(qiáng)烈的印痕效果；衍射增強(qiáng)成像（圖1c），通過折射襯度成像，可觀察到血管周圍很強(qiáng)的邊緣增強(qiáng)效應(yīng)，由于增強(qiáng)的襯度使得圖像有凸凹立體感、浮雕感；干涉法成像（圖1d）通過干涉條紋把相位信號(hào)轉(zhuǎn)變成可探測(cè)的強(qiáng)度信號(hào)，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)與周圍肝臟組織之間的灰白差異。

通過肝臟的類同軸成像效果（圖2a）與病理結(jié)果（圖2b）及組織學(xué)示意圖（圖2c）對(duì)照，證實(shí)與組織切片具有較好的匹配性：血管、膽管明顯顯示，肝小葉結(jié)構(gòu)（包括小葉間結(jié)構(gòu)及竇狀間隙血管）清晰顯示；肝細(xì)胞在圍繞竇狀間隙中呈板狀排列。

圖1 分別為大鼠肝臟的類同軸相襯像（圖1a）、光柵微分像（圖1b）、衍射增強(qiáng)折射像（圖1c）和干涉條紋像（圖1d），均可清晰顯示肝臟內(nèi)血管結(jié)構(gòu)主干及直至肝臟邊緣的分支圖2 類同軸成像（圖2a）顯示肝臟組織與病理示意圖（HE 4×10，圖2b，）及解剖線狀示意圖（圖2c）對(duì)照，肝小葉結(jié)構(gòu)中的中央靜脈及周圍呈放射狀分布的肝竇結(jié)構(gòu)均清晰顯示且具有較好的匹配性

3 討論

從微觀上講，常規(guī)的X線成像僅利用光波在穿透物質(zhì)時(shí)其振幅的改變，而相位襯度成像則是基于光波的相位變化，當(dāng)光波穿透物質(zhì)時(shí)，其相位隨密度變化的襯度比相應(yīng)的吸收變化的襯度高得多。因此，利用相位襯度信息有可能獲得更清晰的成像效果。

類同軸成像方法主要原理是：在類同軸成像中，均勻的相干光波通過界面非均勻的物體，光的強(qiáng)度不發(fā)生變化而波前將發(fā)生畸變，繼續(xù)傳播到一定距離，和未發(fā)生畸變的波面重疊而發(fā)生干涉，X射線通過物體后，傳播一定的距離即能將相位信息轉(zhuǎn)化為強(qiáng)度變化，即菲涅耳衍射成像——相位二階導(dǎo)數(shù)襯度成像，因此可見相位變化。類同軸方法具有大視野、高通量和實(shí)時(shí)成像的優(yōu)勢(shì)［5-7］，獲得的圖像和目前的臨床的X線圖像相似，因此容易解釋［8］。衍射增強(qiáng)成像原理［9］：X射線與物質(zhì)作用后，會(huì)發(fā)生吸收、折射和散射，其中折射和散射光的出射方向會(huì)偏離入射方向，而衍射增強(qiáng)成像最重要的是使用分析晶體將透射、折射和散射光對(duì)成像的作用分離，并將小角散射濾除，因此可大大提高成像的襯度和空間分辨力。干涉法成像由MOMOSE等［10-12］首先引入成像研究。干涉法是發(fā)現(xiàn)軟組織內(nèi)微小折射指數(shù)差異的最敏感的方法，但需精密復(fù)雜的干涉儀，且對(duì)干涉儀晶體準(zhǔn)直度和機(jī)械穩(wěn)定性要求高，加上受晶體尺寸和成像視野的限制，其應(yīng)用亦受到限制［11，13］。光柵成像是利用光柵干涉儀將由樣品引起的入射波前畸變信息轉(zhuǎn)化為莫爾條紋的畸變，應(yīng)用相階方法采集數(shù)據(jù)再通過探測(cè)器（CCD）記錄莫爾條紋［14］，對(duì)不同圖像的同一像素點(diǎn)進(jìn)行正弦曲線擬合，從而獲得成像結(jié)果。其可得到更好的成像結(jié)果和更加豐富的樣品信息，將會(huì)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更好的作用。上述各種方法對(duì)于微小血管的顯示均較清晰，分辨率可達(dá)微米量級(jí)。

與常規(guī)醫(yī)用檢查設(shè)備相比，同步輻射在肝臟組織成像中的主要優(yōu)勢(shì)為可在寬能范圍內(nèi)發(fā)出極高通量的單色準(zhǔn)直X射線束。理論依據(jù)包括：同步輻射X線的高亮度特性。同步輻射的相干性特性使其可行肝臟組織的相位襯度成像。同步輻射相位襯度成像技術(shù)空間分辨率可得到明顯提高達(dá)到微米量級(jí)，能夠顯示包括膽管、中央靜脈在內(nèi)的肝小葉結(jié)構(gòu)。

肝小葉是肝的基本結(jié)構(gòu)單位，呈多角棱柱體，長(zhǎng)約2 mm，寬約1 mm，成人肝臟有50萬～100萬個(gè)肝小葉。肝小葉中央有一條沿其長(zhǎng)軸走行的中央靜脈，肝索和肝血竇以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列。幾乎所有的肝臟疾病都能引起肝臟微細(xì)結(jié)構(gòu)的改變，因此小葉微細(xì)結(jié)構(gòu)的變化對(duì)于病變的診斷和評(píng)價(jià)特別重要。肝細(xì)胞癌是典型的多血管惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞的無節(jié)制性生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都是建立在腫瘤新生血管形成的基礎(chǔ)上的。因此，早期顯示微血管的改變，對(duì)其早期診斷和治療均具有重要臨床意義。李蓓蕾等［15］利用同步輻射衍射增強(qiáng)成像技術(shù)對(duì)離體人肝細(xì)胞癌新生血管進(jìn)行研究，結(jié)果表明該技術(shù)能夠獲得較滿意圖像，可顯示腫瘤呈膨脹性生長(zhǎng)、邊界清晰，腫瘤邊緣或周圍可見較粗大的血管受壓呈弧形移位；瘤內(nèi)微小血管較豐富，分布雜亂無章，形態(tài)無規(guī)則，測(cè)得的最細(xì)血管直徑約25 μm；在搖擺曲線不同位置記錄的肝細(xì)胞癌圖像的差異顯著。林慧敏等［16］通過光柵X線相襯成像法對(duì)動(dòng)物樣品進(jìn)行成像，結(jié)果顯示在無對(duì)比劑情況下，第3代同步輻射光柵X線相襯技術(shù)能對(duì)胃癌肺轉(zhuǎn)移灶及血管結(jié)構(gòu)清晰成像，顯示血管直徑達(dá)15～30 μm，接近低倍光學(xué)顯微鏡下的圖像，說明光柵X線相位襯度成像對(duì)顯示裸鼠胃癌肺轉(zhuǎn)移灶中的新生血管具有較高應(yīng)用價(jià)值。

本研究的不足：本研究未使用對(duì)比劑，無法根據(jù)增強(qiáng)掃描不同時(shí)相判斷是肝臟動(dòng)脈、靜脈還是門靜脈［17］。今后應(yīng)根據(jù)肝動(dòng)脈、靜脈及門靜脈血液內(nèi)成分含量的差異導(dǎo)致的折射率或熒光效進(jìn)行區(qū)分。盡管目前無法區(qū)分血管的類別，但也不能否認(rèn)血管的顯示對(duì)乳腺癌、肝癌、胃癌的成像研究結(jié)果均有幫助。李瑞敏等［18］在利用同步輻射類同軸相襯技術(shù)對(duì)人乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行成像，觀察乳腺癌腫瘤新生血管的形態(tài)和分布；在不應(yīng)用對(duì)比劑的情況下成功獲得微米量級(jí)的乳腺腫瘤新生血管，并能清晰顯示最小直徑約9 μm的腫瘤血管；本研究選取新鮮的乳腺癌標(biāo)本，手術(shù)取出后立即放入35%～40%甲醛水溶液中固定，保證了腫瘤血管內(nèi)的血液能及時(shí)固定而不被其他物質(zhì)影響，從而真實(shí)反映腫瘤新生血管的狀態(tài)，在無對(duì)比劑情況下即可實(shí)現(xiàn)腫瘤新生血管的成像，避免使用碘對(duì)比劑帶來的不良反應(yīng)，為不用對(duì)比劑行血管成像提供了一定思路。

綜上所述，相位襯度成像具有較高的組織襯度及較好的圖像分辨力，能夠顯示包括肝小葉在內(nèi)的微小結(jié)構(gòu)或多級(jí)血管分支結(jié)構(gòu)，有助于觀察肝臟腫瘤生長(zhǎng)過程中新生血管的形態(tài)、分布，以及肝臟組織細(xì)胞微觀層面的研究，有望在肝臟的生理、病理及病變機(jī)制的可視化研究上發(fā)揮重要作用。