李慧明 楊璧澤 池輝云 賴任燕 劉昌傳徐湛榮 朱秀芳 龔世平 陳金平*

(1.廣東省科學(xué)院，廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州，510260；2.廣東省云開山國家級自然保護區(qū)，信宜，525300)

1871年，Anderson將在云南龍川縣采集到的紅瘰疣螈(Tylototritonverrucosus)作為模式種建立了疣螈屬(Tylototriton)[1]。Dubois和Raffa?lli[2]基于形態(tài)特征將疣螈屬劃分為2個亞屬：瑤螈亞屬(subgenusYaotriton)和疣螈亞屬(subgenusTylototriton)。疣螈屬現(xiàn)存24個種。由于屬內(nèi)種類形態(tài)特征相似，地理分布區(qū)域重疊，一些物種的有效性一直存在許多爭議[1，3-5]。隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展與應(yīng)用，一些隱藏的生物多樣性被逐漸揭示出，一些新種被發(fā)現(xiàn)，一些被重新劃分或命名，也有同物異名被合并[6-7]。Wang等[6]在研究疣螈屬種類多樣性及其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系時，將這一進化支系中的24個種類均列入疣螈屬進行討論，基于2個線粒體基因(16S和ND2基因)和2個核基因(NCX1和BDNF基因)重建的串聯(lián)基因樹中將現(xiàn)存種類劃分為5個分支，并認為第4分支中細痣疣螈(Tylototritonasperrimus)種組存在隱種。

蔡氏疣螈首次被發(fā)現(xiàn)于越南北部的高平省的河江地區(qū)，曾被定種為Tylototritonasperrimus，Tylototritonvietnamensis和Tylototritoncf.vietnamensis[1，4，8-9]。后在中國云南麻栗坡縣被發(fā)現(xiàn)，但僅有線粒體基因組數(shù)據(jù)被報道，并沒有形態(tài)學(xué)描述[5]。從系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系來看，蔡氏疣螈與分布在熱帶亞熱帶地區(qū)的海南疣螈(Tylototritonhainanensis)、老撾疣螈(Tylototritonnotialis)、細痣疣螈聚為一支[4]，屬于細痣疣螈種組。蔡氏疣螈目前主要分布于與越南北部河江和高平省，分布區(qū)域緊鄰越南與中國廣西邊界。

中國地理范圍跨度大，生境多樣性豐富，具有維持兩棲類種類多樣性的生態(tài)條件。廣東云開山國家級自然保護區(qū)地處廣東省西南部(111°08′19″—111°23′48″E，22°13′58″—22°21′24″N)屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，為森林生態(tài)系統(tǒng)類型的自然保護區(qū)，具有較大面積完整的次生南亞熱帶常綠闊葉林和溝谷雨林，蘊藏著豐富的野生動物資源。疣螈多棲息于海拔650—2 500 m山區(qū)溪流或水塘邊，喜植被繁茂環(huán)境，云開山保護區(qū)為疣螈提供了良好的生存環(huán)境。目前，疣螈種類廣泛分布于中國中部和南部地區(qū)(廣東、廣西、四川、云南、貴州和甘肅省)。對疣螈的研究將使我們能從新的角度上認識分布區(qū)域的地理變遷和物種多樣性分化，對保護這一珍貴物種的遺傳多樣性提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究對廣東省信宜云開山國家級自然保護區(qū)采到的疣螈標(biāo)本進行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)綜合分析，討論了蔡氏疣螈的分類地位。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本的采集

2018年4月，在廣東省信宜云開山國家級自然保護區(qū)內(nèi)一臨時性水坑(111°11′38″E，22°16′23″N)采集到6只疣螈標(biāo)本(5只已死亡，1只活體)。將采集的標(biāo)本帶回實驗室進行體長測量、形態(tài)特征鑒定及分子標(biāo)記實驗。研究完成后將死亡個體存放于廣東省生物資源應(yīng)用研究所標(biāo)本館(編號：GIABR-A-U-2018-001，GIABR-A-U-2018-002，GIABR-A-U-2018-003，GIABR-A-U-2018-004，GIABR-A-U-2018-005)，1只活體帶回保護區(qū)進行放生。

1.2 ML系統(tǒng)發(fā)育樹重建

取6只疣螈尾尖少許肌肉作為DNA提取模板，以擴增獲得線粒體COI、Cytb、ND1和ND2基因序列，研究中所需的引物序列參考Zhang 等[10]。DNA提取方法按照美基生物(Magen)組織DNA小量提取試劑盒(Hipure Tissue DNA Mini Kit)流程操作?？偡磻?yīng)體系為30 μL，反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，此過程進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用SYBR染色，并于凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀察電泳結(jié)果。序列的純化和測定工作由天一輝遠生物公司完成。所得ABI源文件用DNAstar 6.0雙向拼接而成，使用MAFFT v 6.81b[11]、Mesquite(Maddison，2009)[12]和Finch TV 1.5.0對序列進行編輯、排序、手工修改顯見的錯誤。獲得的片段在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索序列同源性。

利用RAXML v.8.1.24軟件[13]，以鎮(zhèn)海棘螈(Echinotritonchinhaiensis)為外類群，將ND1、ND2、Cytb和COI基因序列進行串聯(lián)分析，使用最大似然法(ML)重建12種疣螈的系統(tǒng)發(fā)生樹。選擇執(zhí)行快速支持度分析并以搜索的GTRGAMMA為最佳模型，自舉檢驗1 000次。本研究中從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的12個疣螈種類的序列見表1。Figtree軟件查看樹圖。

表1 研究中從NCBI下載獲得的疣螈種類的序列號Tab.1 The downloaded sequences and numbers of Tylototriton species from NCBI database

2 結(jié)果

2.1 外部形態(tài)特征

2018年4月，于廣東省云開山自然保護區(qū)采集疣螈6只，5雌1雄。雄性個體全長為14.1 cm；雌性個體全長為11.8—12.5 cm，平均體長為(12.2±0.31)cm(n=5)。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)此種疣螈多分布在保護區(qū)海拔500 m以上樹林繁茂及布有水坑溪流區(qū)域，繁殖季節(jié)集中在水體中完成交配繁殖。

主要的形態(tài)特征(圖1)：身體周身黑色，軀干圓柱形略扁；頭部扁平，頭寬略大于或等于頭長；頭側(cè)脊棱明顯并向內(nèi)彎曲；吻端平，鼻孔近吻端；無唇褶；脊椎突出，分節(jié)，肋骨結(jié)節(jié)突出；皮膚粗糙，身體兩側(cè)脊棱顯著突起且各具一排球形疣粒(14—16粒)，彼此分界明顯且排成縱行，僅唇部、指趾末端和尾腹緣光滑；頸褶清晰；尾腹鰭褶延伸至泄殖孔后緣，尾末端鈍尖；四肢纖細，后肢略長于前肢，5趾4指，沒有蹼，趾長順序為3>4>2>5>1；雄性泄殖孔豎長狀，內(nèi)壁有小乳突，雌性泄殖孔略短隆起，無乳突；指、趾末端、泄殖孔周緣和尾下緣為橘紅色。

圖1 Tylototriton ziegleri外部形態(tài)特征Fig.2 The female morphology characteristics of Tylototriton ziegleri

2.2 聯(lián)合基因系統(tǒng)樹重建

基于ND1、ND2、Cytb和COI串聯(lián)基因序列重建了12種疣螈的系統(tǒng)發(fā)育ML樹(圖2)。ML系統(tǒng)發(fā)育樹主要分為兩支，其中本次采集發(fā)現(xiàn)的疣螈(SP1—6)與蔡氏疣螈聚在一支，這與傳統(tǒng)形態(tài)分類結(jié)果一致。因此，根據(jù)多重線粒體基因序列分析及外部形態(tài)特征鑒定，認為此次在云開山保護區(qū)發(fā)現(xiàn)的疣螈應(yīng)為蔡氏疣螈，為中國廣東省新紀(jì)錄種。NCBI上傳序列號為MH664279-MH664302。

圖2 基于ND 1、ND 2、Cyt b和COI基因串聯(lián)序列重建12種疣螈的ML系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Maximum likelihood tree(ML tree)based on the ND 1，ND 2，Cyt b and COI gene for Tylototriton and related species

3 討論

疣螈是中國重要的有尾兩棲類動物，隨著生境的喪失和破碎化其遺傳多樣性和種類多樣性明顯降低，種群數(shù)量急劇減少，目前部分疣螈種類(細痣疣螈、鎮(zhèn)海棘螈、貴州疣螈Tylototritonkweichowensis等)為我國Ⅱ級保護動物。根據(jù)本次研究的形態(tài)學(xué)特征與多重線粒體基因序列比對鑒定此次于廣東省云開山國家級自然保護區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的疣螈應(yīng)為蔡氏疣螈，是分布于中國疣螈屬中的第5個種，為細痣疣螈種組中的一種。目前蔡氏疣螈僅分布在越南北部河江省、中國云南省麻栗坡縣和廣東省云開山保護區(qū)。

細痣疣螈種組依托秦巴山系、大婁山系、大別山系、南嶺、粵桂山系及環(huán)北部灣山系分布[7]，其間仍有部分的盲點有待調(diào)查。曾有報道在云開山發(fā)現(xiàn)細痣疣螈的蹤跡，但此次調(diào)查并未采集到樣本，從分布特征來看，細痣疣螈與蔡氏疣螈可能出現(xiàn)同域分布，疣螈種類在此區(qū)域尚可存在更多的物種多樣性。根據(jù)疣螈屬種類系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，細痣疣螈、海南疣螈、老撾疣螈與蔡氏疣螈的親緣關(guān)系很近，且該分支處于系統(tǒng)樹基部，是較原始的一支[6，9，14]。說明疣螈在中國與周邊東南亞國家應(yīng)存在顯著基因交流和遷移擴散，周邊國家的物種可顯著影響中國疣螈種類多樣性；另一方面目前蔡氏疣螈獨立的分布于與越南北部與中國云南東部、廣東西南部，三者間空白的分布區(qū)域(比如廣西、海南等地)也可能有此種的分布，僅是尚未被發(fā)現(xiàn)，待日后工作進一步調(diào)查。

近年來，隨著疣螈屬中新種和隱種的不斷發(fā)現(xiàn)，對錯誤種類鑒定同時進行反復(fù)的修訂，這說明疣螈種類外部形態(tài)特征相似，地理分布區(qū)域重疊對準(zhǔn)確的種類鑒定帶來了巨大的困難[3，7]。目前，在《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》一書[15]和Wang等[6]發(fā)表的文章中均已將瑤螈亞屬和疣螈亞屬并為疣螈屬進行討論，但尚有多數(shù)文獻中仍使用亞屬或種組來描述疣螈屬的劃分已不妥當(dāng)。

因此在以后的工作中以重要外部形態(tài)特征為主，補充解剖學(xué)特征以及結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)輔助鑒定手段是十分必要的。但是在使用不同的分子標(biāo)記對基因序列進行比對及重建系統(tǒng)樹時，可能會出現(xiàn)不同或多個鑒定結(jié)果。在本研究中，當(dāng)進行ND2基因序列比對時，搜索結(jié)果中則出現(xiàn)原序列與細痣疣螈和蔡氏疣螈均具有相同的相似度和覆蓋率。因此在選用分子生物技術(shù)手段輔助種類鑒定時，應(yīng)選取較多分子標(biāo)記進行補充，單獨的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果可能出現(xiàn)偏差。

致謝：感謝此次參與野外調(diào)查的所有專家、學(xué)者以及廣東省云開山自然保護區(qū)的工作人員，特別感謝廣東省生物資源應(yīng)用研究所張亮、何向陽和李林妙博士對本研究中樣品采集、分子實驗及種類鑒定方面提供的幫助。