吳 勝 項(xiàng) 勛 阮 謙 高 輝 俞偉輝 段 綱 常 華*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201；2.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，岳陽，414000)

葡萄球菌屬(Staphylococcus)在自然界廣泛存在，并且對(duì)生存條件無特殊要求，很難清除。共有28個(gè)種，部分種可以引起人和動(dòng)物的感染，是導(dǎo)致食源性疾病病原之一的人畜共患疾病[1-2]。葡萄球菌的分型有生物學(xué)分型和表型標(biāo)記分型[3]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的主要致病因子為凝固酶，是葡萄球菌中的主要病原菌[4]。

葡萄球菌的病例逐年升高，其中金黃色葡萄球菌發(fā)病率升高極其明顯[5]。感染嚴(yán)重甚至?xí)斐蓴⊙Y毒血癥。金黃色葡萄球菌易造成壞死性肺炎、血管內(nèi)感染、心內(nèi)膜感染等[6]。家禽在被金黃色葡萄球菌污染的環(huán)境中易感，表現(xiàn)為敗血型葡萄球菌病[7]。金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌[8]，小鼠在感染后會(huì)出現(xiàn)精神不振，皮膚出現(xiàn)了斑點(diǎn)。金黃色葡萄球菌還會(huì)引起人和鼠的腹膜炎、壞死性筋膜炎等[9]。這些有致病能力的金葡球菌會(huì)分泌外毒素和破壞細(xì)胞質(zhì)膜的多肽，其中溶血素和雙組分殺白細(xì)胞素等多種多肽也是由金黃色葡萄球菌分泌的[10]。

目前在畜禽細(xì)菌感染的治療中，廣譜抗生素的廣泛使用，造成細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，給疾病的防治帶來困擾。對(duì)于野生動(dòng)物的飼養(yǎng)及疾病的監(jiān)控防治方面也存在較大差異，抗生素的廣泛使用，也是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因。本研究對(duì)由送檢的西雙版納病死大象進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一株耐藥金黃色葡萄球菌，為此對(duì)其進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，再次分析該菌對(duì)其臟器的損害，同時(shí)通過藥敏試驗(yàn)的分析，為后續(xù)防治該疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

西雙版納亞洲象(Elephasmaximus)死后經(jīng)剖解將心、肝、脾、肺、腎、腸送檢，經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2 試劑

試驗(yàn)所需試劑耗材如表1。

表1 試劑Tab.1 The reagent

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 細(xì)菌分離純化及鏡檢

在超凈臺(tái)中，用無菌的剪刀和鑷子，將臟器病變區(qū)剪為綠豆大小，放入1.5 mL的離心管中，向離心管中加入1 mL的已高壓PBS，將組織剪碎，取菌液加入TSB培養(yǎng)基，置于37 ℃水浴搖床過夜培養(yǎng)。將此菌液接種于TSA平板上培養(yǎng)，挑取TSA平板單菌落轉(zhuǎn)接于TSB中過夜培養(yǎng)。取該菌液涂片、干燥、固定后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.3.2 生化鑒定

將篩選純化的菌液分別接種于生化鑒定管進(jìn)行檢測(cè)。分別包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、半乳糖、山梨醇、衛(wèi)茅醇、鼠李糖、肌醇、綿子糖、蛋白胨水、葡糖糖磷酸鹽胨水、葡萄糖胺、氰化鉀生長(zhǎng)試驗(yàn)管等加入之后放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約在24—72 h進(jìn)行觀察記錄結(jié)果。

1.3.3 16S rDNA 基因序列擴(kuò)增

計(jì)算時(shí)不考慮結(jié)構(gòu)自重產(chǎn)生的影響，荷載效應(yīng)全部來自于體外預(yù)應(yīng)力鋼束。將預(yù)應(yīng)力荷載等效為沿箱梁縱橋向作用的均布力作用于錨墊板上，所施加的荷載參數(shù)如表 1所示。

對(duì)細(xì)菌的DNA進(jìn)行粗提，在超凈臺(tái)中，取已純化的菌液10 μL，加90 μL的雙蒸水，放在沸水中煮沸10 min，得到細(xì)菌的DNA[11]。以此細(xì)菌DNA為模板，用16S rDNA引物27F：5′-3′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：5′-3′GGTTACCTTGTTACGACTT，擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度約為1 500 bp。反應(yīng)條件及反應(yīng)體系如表2、表3，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。將有目的條帶的樣品PCR體系擴(kuò)大為100 μL，按照試劑盒方法進(jìn)行膠回收目的條帶。取5 μL膠回收產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證膠回收后置于-20 ℃保存。

表2 PCR的反應(yīng)體系Tab.2 The PCR condition

表3 PCR的反應(yīng)條件Tab.3 The reaction condition of PCR

1.3.4 16S rDNA的TA克隆及驗(yàn)證

連接載體選用 pMD18-T(TaKaRa)，連接體系為4 μL細(xì)菌16S rDNA膠回收產(chǎn)物，1 μL pMD 18-T VECTOR，5 μL SOLUTION I，混勻并于16 ℃連接30 min，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布篩選白色單菌落，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，以重組質(zhì)粒1 μL為模板，引物及PCR反應(yīng)條件與上一步相同。取各編號(hào)PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳初步篩選驗(yàn)證，將驗(yàn)證克隆成功的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 藥敏試驗(yàn)

選擇的藥敏片為青霉素、新生霉素、新霉素、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮、頭孢氨芐、阿莫西林、恩諾沙星、利福平、大觀霉素、復(fù)方新諾明、 麥迪霉素、萬古霉素等，18 h后觀察藥敏結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)按照美國的臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCLLS，2009)實(shí)行。

1.3.6 致病性研究

通過半數(shù)致死量試驗(yàn)得出該分離株的LD50為1.26×107cfu/mL，以108cfu/mL的菌懸液注射試驗(yàn)組小白鼠5只，每只腹腔注射0.5 mL菌懸液；對(duì)照組每只腹腔注射0.5 mL滅菌生理鹽水，正常飼喂并觀察記錄發(fā)病及死亡情況。采集死亡小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸等組織置于4%多聚甲醛固定，病理組織經(jīng)包埋后制作切片[12]，切片經(jīng)伊紅染色后置于顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)分離篩選菌落后，對(duì)純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色。8號(hào)菌株在顯微鏡下呈紫色、球形，為革蘭氏陽性菌，結(jié)果見圖1。8號(hào)菌株在TSA平板上為黃色，表面光滑的圓形凸起菌落，生長(zhǎng)情況如圖2所示。

圖1 8號(hào)菌革蘭氏染色 1 000×Fig.1 No.8 bacterial strain of Gram stain

圖2 8號(hào)菌在TSA生長(zhǎng)Fig.2 No.8 strains grow in TSA

2.2 細(xì)菌的16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果

通過對(duì)純化后的細(xì)菌提取DNA并進(jìn)行TA克隆，抽提重組質(zhì)粒后進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶顯示片段大小為1 500 bp左右，與目的片段大小相符，結(jié)果如圖3所示。

圖3 克隆后PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The results of PCR amplification after cloning

將測(cè)序結(jié)果堿基序列于NCBI中進(jìn)行Blast比較，在GenBank上該序列與Staphylococcussp.16S rDNA序列同源性最高達(dá)到100%，與Staphylococcussp.ORG01 16S rRNA序列同源性最高達(dá)到99%，與Staphylococcussp.SW38 16S rDNA序列同源性高達(dá)到99%。

2.3 生化鑒定結(jié)果

利用新型微生物微量生化鑒定試劑對(duì)8號(hào)菌株進(jìn)行鑒定，該分離株對(duì)葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、山梨醇、水楊素、七葉苷、β-半乳糖苷(ONPG)、葡萄糖磷酸鹽胨水、葡萄糖銨、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、硝酸鹽、氰化鉀反應(yīng)呈陽性，對(duì)木糖、衛(wèi)矛醇、鼠李糖、肌醇、尿素、丙二酸鹽、西蒙氏枸櫞酸鹽、葡萄糖酸鹽、苯丙氨酸、綿子糖、硫化氫、明膠反應(yīng)呈陰性。鑒定結(jié)果見表4，圖4。

表4 生化鑒定結(jié)果Tab.4 Biochemical identification results

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將分離純化后的金黃色葡萄球菌涂布在TSA平板上，在平板上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明：該株金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)丙沙星、麥迪霉素、利福平、萬古霉素高度敏感；大觀霉素、新霉素中度敏感；對(duì)阿莫西林、頭孢氨芐、 林可霉素、青霉素G、新生霉素、呋喃唑酮、恩諾沙星、頭孢他啶、卡那霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥，藥敏結(jié)果如表5，判定標(biāo)準(zhǔn)如表6。

表5 葡萄球菌對(duì)不同藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Staphylococcus on different drug sensitivity test results /mm

表6 判定標(biāo)準(zhǔn)Tab.6 Drug sensitivity test criteria

2.5 致病性研究結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組小鼠在接種金黃色葡萄球菌初期表現(xiàn)為精神狀態(tài)差，少飲少食，被毛凌亂，隨后小鼠肛門粘著糞便，隨著病情加重小鼠出現(xiàn)死亡。將死亡小鼠解剖觀察發(fā)現(xiàn)肺臟淤血，腸道出血水腫及其嚴(yán)重，腎臟也出現(xiàn)水腫。病理切片顯示，實(shí)驗(yàn)組小白鼠的腸絨毛脫落，基本無正常形態(tài)，黏膜固有層充血出血，腸內(nèi)容物混有紅細(xì)胞，如圖5A；有的肺泡壁破裂而與相鄰肺泡溝通形成大空泡，肺泡腔充滿漿液，毛細(xì)血管充滿紅細(xì)胞，如圖5B；肝細(xì)胞腫脹，廣泛性變性，肝竇變窄，肝細(xì)胞核碎裂、溶解，淋巴細(xì)胞浸潤，如圖5C；腎臟間質(zhì)充滿紅細(xì)胞，腎小球縮小，腎小管上皮細(xì)胞破碎填充管腔，如圖5D；部分心肌纖維萎縮、斷裂，心肌纖維變性均質(zhì)，心肌纖維間隙有紅細(xì)胞，毛細(xì)血管有紅細(xì)胞充盈，如圖5E；對(duì)照組小鼠腸，肺，肝，腎，心的切片分別如圖5a，b，c，d，e。

圖5 小鼠攻毒分離菌株后病理組織觀察Fig.5 Pathological observation of mice after challenged bacteria

3 討論

本研究通過對(duì)西雙版納大象的臟器進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化、菌體形態(tài)學(xué)鑒定及PCR鑒定，從臟器中分離到金黃色葡萄球菌。將該株金葡球菌進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本分離株可造成小鼠臟器及腸道出血水腫，致病性較強(qiáng)，且癥狀與袁晨[13]的動(dòng)物回歸試驗(yàn)一致。

臨床治療時(shí)抗生素的大量使用，致使金黃色葡萄球菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性[14]，所以對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)是必要的。本試驗(yàn)所分離菌株對(duì)阿莫西林、頭孢氨芐、林可霉素、青霉素G、新生霉素、呋喃唑酮、恩諾沙星、頭孢他啶、卡那霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥，與劉穎等[15]從水產(chǎn)品中分離金黃色葡萄球菌耐青霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的結(jié)果大致相同。本株金黃色葡萄球菌耐藥性嚴(yán)重且存在多重耐藥現(xiàn)象，該結(jié)果與Shahbazian等[16]，Syed等[17]的分離株一致。分離株對(duì)大觀霉素、新霉素中度敏感。由于該株對(duì)β-內(nèi)酰胺類及頭孢類普遍產(chǎn)生耐藥，對(duì)氨基糖苷類藥物中度敏感部分耐藥，因此在臨床治療時(shí)盡量避免使用這幾類藥物。本試驗(yàn)中環(huán)丙沙星、麥迪霉素、利福平、萬古霉素都有良好的抗菌作用，建議用此種方法對(duì)西雙版納地區(qū)的大象進(jìn)行防治。

由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒頻繁發(fā)生，抗生素在養(yǎng)殖業(yè)的大量濫用，導(dǎo)致越來越多的食品中發(fā)現(xiàn)耐藥性金黃色葡萄球菌[18]，極易造成食物中毒，在獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)中引發(fā)關(guān)注。中國2003—2007年食物中毒的病例中有94起是由金黃色葡萄球菌引起的，感染人數(shù)達(dá)到了2 000多人[19]。該菌株不僅感染人，在海龜(Chelonia)、蝙蝠(Vespertilio)、海豹(Phoca)、綿羊(Ovisaries)、兔(Lepus)、嚙齒動(dòng)物(Rodentia)、貓(Felis)、狗(Canis)、豬(Suidae)、鳥(Aves)、馬(Equus)和牛(Bos)[20]中均可發(fā)生感染，大象[21]也易感染。最為可怕的是，自從耐萬古霉素金黃色葡萄球菌首次在美國病人中分離，越來越多的VRSA菌株被發(fā)現(xiàn)，再加上“超級(jí)細(xì)菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的發(fā)現(xiàn)及其導(dǎo)致嚴(yán)重的危害，引起了專家及社會(huì)大眾的關(guān)注[22-23]。這不僅增加了該病的治療難度，也對(duì)公共衛(wèi)生安全造成極大的隱患，因此，應(yīng)該謹(jǐn)慎使用抗生素，在進(jìn)行金黃色葡萄球菌病的治療給藥前先做藥敏試驗(yàn)篩選藥物，避免耐藥性的蔓延及轉(zhuǎn)移。同時(shí)，應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)多重耐藥菌株，避免產(chǎn)生VRSA及MRSA菌株，減少其對(duì)公共衛(wèi)生安全的危害。

4 結(jié)論

本研究對(duì)西雙版納送檢的病死大象進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定、分離鑒定，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一株金黃色葡萄球菌，藥敏試驗(yàn)檢測(cè)其為多重耐藥菌株，動(dòng)物回歸試驗(yàn)分析該菌對(duì)其臟器的損害，結(jié)果顯示該分離株菌對(duì)小鼠有很強(qiáng)的致病性。