閻朝華 張 旭 陳國權(quán) 周碧君，3*王開功，3 趙大杰 文 明，3* 張件軍

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽，550025；2.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴陽，550025；3.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽，550025)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是普遍存在于人和動物機體中的條件性致病菌[1]，自1990年中華竹鼠(Rhizomyssinensis)馴化圈養(yǎng)以來竹鼠大腸埃希氏菌病就偶有報道，屈孝初等[2]在2002年首次報道大腸埃希氏菌引發(fā)竹鼠水腫病，此后大腸埃希氏菌病在竹鼠養(yǎng)殖中時有發(fā)生，且具有發(fā)病快，死亡率高的特點，已成為近年來造成竹鼠養(yǎng)殖企業(yè)重大經(jīng)濟損失的細(xì)菌性疫病之一[3-4]。根據(jù)相關(guān)報道大腸埃希氏菌許多血清型都能夠使家畜、家禽發(fā)病，目前能夠引起竹鼠源大腸埃希氏菌病的血清型有O35、O111、O141等血清型[5-6]。

中華竹鼠又名竹貍、竹餾、竹根豬等，屬于哺乳綱(Mammalia)，嚙齒目(Rodentia)，竹鼠科(Rhizomyidae)，竹鼠屬，是中國南方珍貴的特種野生動物之一[7]。近年來隨著貴州省竹鼠養(yǎng)殖規(guī)不斷擴大，各類細(xì)菌性疫病也時常發(fā)生，因此對竹鼠疫病病原以及防控技術(shù)的研究也變得迫在眉睫[8]。2019年年初以來貴州省三穗縣某竹鼠養(yǎng)殖場陸續(xù)出現(xiàn)竹鼠發(fā)病死亡現(xiàn)象，其癥狀主要表現(xiàn)為竹鼠精神沉郁，被毛無光澤，厭食，體型消瘦，眼瞼腫脹，下牙脫落等。為查明此次竹鼠發(fā)病病因，筆者對病死竹鼠進(jìn)行病原菌分離鑒定、藥敏實驗、耐藥基因檢測、動物感染試驗和毒力基因檢測，以期為該病的防治與分子流行病學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 送檢材料

貴州省三穗縣某竹鼠養(yǎng)殖場送檢病死竹鼠2只，經(jīng)剖檢觀察發(fā)現(xiàn)病死竹鼠皮下有點狀出血點、腹水充盈、肺臟有白色斑塊、肝臟腫大、腸道內(nèi)容物有血塊。

1.2 試驗材料

10只昆明系雜交SPF級小白鼠，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；革蘭染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌藥敏片，購自杭州微生物試劑有限公司；鮮血瓊脂培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均由貴州大學(xué)動物疫病研究所獸醫(yī)實驗室自制；博檢革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定系統(tǒng)購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

剖檢觀察病死竹鼠，無菌操作取送檢病死竹鼠的心臟、肝臟、脾臟畫線接種于鮮血瓊脂平板，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)菌長出。取單個優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，進(jìn)行革蘭染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4 細(xì)菌生化鑒定

參照博檢革蘭氏陰性細(xì)菌(Gram negative bacteria)鑒定系統(tǒng)說明書對純培養(yǎng)菌進(jìn)行生化特性鑒定。

1.5 細(xì)菌16S rDNA基因檢測及序列分析

提取純培養(yǎng)菌DNA為模版，以細(xì)菌16S rDNA通用引物(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上、下游引物為：27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′1492R5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′；預(yù)計擴增片段大小為1 356 bp)進(jìn)行PCR擴增。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Markter Mix：12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，剩下用雙蒸水補足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測序，并將測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比分析，用 Mega 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 細(xì)菌藥敏實驗和耐藥基因檢測1.6.1 細(xì)菌藥敏實驗

采用制片擴散法(K-B法)，取200 μL純培養(yǎng)菌液均勻涂布于LB瓊脂平板后粘貼藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄抑菌圈直徑，判定菌株對不同藥物的敏感性。

1.6.2 細(xì)菌耐藥基因檢測

根據(jù)藥敏實驗參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]設(shè)計細(xì)菌常見耐藥基因引物，即I類整合子基因(Intl1)、四環(huán)素耐藥基因(tetA、tetB、tetD)，引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。對分離菌純培養(yǎng)物DNA進(jìn)行 PCR檢測，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并觀察判定結(jié)果。

表1 耐藥基因引物信息Tab.1 Primer information of drug resistance genes

1.7 細(xì)菌人工感染試驗與毒力基因檢測1.7.1 細(xì)菌人工動物感染試驗

將10只健康昆明系雜交SPF級小白鼠分為試驗組與對照組，每組各5只。試驗組每只腹腔注射分離菌懸液0.3 mL(用滅菌生理鹽水將分離菌配制成濃度2.12×109cfu/mL)，對照組每只腹腔注射0.3 mL無菌生理鹽水，連續(xù)觀察3 d，記錄小鼠的死亡情況并及時分離鑒定死亡小鼠體內(nèi)病原菌

1.7.2 細(xì)菌毒力基因檢測

參考文獻(xiàn)[11-12]設(shè)計并合成腸桿菌科常見8種毒力基因，即fyuA、irp-2、ompA、papA、papC、fimH、UidA、afa，引物序列見表2。

表2 毒力基因引物信息Tab.2 Virulence gene primer information

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

經(jīng)剖檢觀察發(fā)現(xiàn)病死竹鼠皮下有點狀出血點，腹水充盈，肺臟有白色斑塊，肝臟腫大，腸道內(nèi)容物有血塊。在無菌條件下取病死竹鼠心、肝、脾臟接種于鮮血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h可見細(xì)菌生長，形成圓形凸起、表面光滑、灰白色的菌落(圖1)；經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，菌體為革蘭氏陰性短小桿菌(Gram negativeCurtobacterium)，兩端鈍圓，多數(shù)呈單個規(guī)則排列(圖2)。

圖1 分離菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated bacteria

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢(100×)Fig.2 Gram staining microscopic examination of isolated bacteria(100×)

2.2 生化鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果顯示該細(xì)菌可利用ONPG、賴氨酸、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、蜜二糖，氧化酶、吲哚等反應(yīng)為陽性，蔗糖、苦杏仁甙、VP等反應(yīng)為陰性(表3)，將該生化試驗結(jié)果通過博檢革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定系統(tǒng)檢索為大腸桿菌，并命名為GZSS。

表3 分離菌生化鑒定結(jié)果Tab.3 Biochemical identification of isolated bacteria

2.3 細(xì)菌16S rDNA基因檢測及序列分析結(jié)果

細(xì)菌16S rDNA基因經(jīng)PCR擴增結(jié)果顯示，得到大小為1 356 bp 特異性片段(圖3)；將測序結(jié)果與 NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，分離菌株 GZSS與鴨源、雞源、牛源、羊源、貓源、鼠源性等13株大腸桿菌參考株相應(yīng)序列同源性達(dá)95%—99.4%(圖4)；通過MegAlign軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)分離菌GZSS與豬源大腸桿菌(swineE.coli)JF513979.1親緣關(guān)系最近(圖4)。綜合分離菌形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性鑒定及16S rDNA基因測序分析，判斷該分離菌為大腸桿菌(GZSS)。

圖4 分離菌株16S rDNA與其他分離株的同源性比對Fig.4 Homology comparison of 16S rDNA isolates with other isolates

圖3 分離菌16S rDNA基因序列 PCR 擴增結(jié)果Fig.3 Amplification of 16S rDNA genesequence of isolated bacteria by PCR

2.4 細(xì)菌藥敏實驗結(jié)果

藥敏實驗結(jié)果顯示，該分離菌對苯唑西林、慶大霉素、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、氟苯尼考、磺胺異噁唑、卡那霉素、氧氟沙星、妥布霉素、新霉素、羧芐西林、頭孢拉定、恩諾沙星、阿莫西林14種藥物敏感，對多黏菌素B中度敏感，對多西環(huán)素 、四環(huán)素、米諾環(huán)素3種藥物耐藥(表5)。

圖5 分離菌(GZSS)基于16S DNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic(GZSS)tree of isolated bacteria based on 16s DNA genesequence

表5 藥敏試驗結(jié)果Tab.5 Drug susceptibility test result

2.5 細(xì)菌耐藥基因檢測結(jié)果

根據(jù)藥敏實驗結(jié)果設(shè)計4種耐四環(huán)素類基因引物進(jìn)行PCR擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，分離菌攜帶有Intl1(146 bp)、tetA(831 bp)2種耐藥基因，未檢測出tetB、tetC2種耐藥基因(圖6)。

圖6 分離菌耐藥基因 PCR擴增電泳Fig.6 Amplified polymerase chain electrophoresis map of drug resistance genes of isolated bacteria M，DL2000 DNA Marker.1，Intl 1.2，tetA. 3，tetB.4，tetC

2.6 細(xì)菌人工感染試驗結(jié)果

經(jīng)動物感染試驗發(fā)現(xiàn)，對照小鼠在觀察期內(nèi)無明顯臨床癥狀和死亡，實驗組小鼠在注射24 h后開始出現(xiàn)精神沉郁，進(jìn)食減少，卷縮，嗜睡等癥狀，于36 h開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，至72 h小鼠全部死亡。從死亡小鼠肝臟、心臟等組織處均能分離到形態(tài)一致的菌落，對其進(jìn)行革蘭染色鏡檢、生化特性鑒定和 16S r RNA 同源性比對，結(jié)果顯示分離出的感染菌在外部形態(tài)、生理生化特性與初始分離得到的感染菌為同一種菌。對照組正常飲食，沒有死亡現(xiàn)象。

2.7 細(xì)菌毒力基因 PCR檢測結(jié)果

設(shè)計大腸桿菌8種毒力基因特異性引物進(jìn)行PCR擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，分離菌攜帶papA(761 bp)、UidA(264 bp)、afa(251 bp)3種毒力基因，未檢測出fyuA、irp-2、ompA、papC、fimH5種毒力基因(圖7)。

圖7 毒力因子PCR擴增結(jié)果Fig.7 Virulence factor PCR amplification results M，DL2000 DNA Marker；-，陰性對照Negative control；

3 討論

大腸埃希氏菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，正常情況下主要分布于人和動物的消化道、呼吸道、泌尿系統(tǒng)內(nèi)，當(dāng)人或動物免疫力低下時在某些部位會成為致病菌[13]，即條件性致病菌。致病性大腸桿菌主要有產(chǎn)腸毒素大腸桿(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)、產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌(shigalike toxinEscherichiacoli，SLTEC)、 腸道致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)、敗血性大腸桿菌(septicEscherichiacoli，SEPEC)及尿道致病性大腸桿菌 (urethral pathogenicEscherichiacoli，UPEC)，等，在動物群體中最常見的為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌[14-17]。實驗從竹鼠體內(nèi)分離到一株大腸埃希氏菌，在瓊脂平板上呈圓形凸起、表面光滑、灰白色的菌落，與曾喻兵等[18]報道一致。此外，不同分離源的大腸埃希氏菌生化戚特性具有差異。戚偉等[19]分離的豬源大腸桿菌能分解蔗糖、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。本實驗分離菌與宋越等[20]和余佳[21]禽源性大腸桿菌(avianEscherichiacoli，AEC)的生化特性基本一致，但葡萄糖分解不產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。因此在傳統(tǒng)的生化實驗上還需要通過16S rDNA基因序列分析鑒定才能得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

養(yǎng)殖場藥物的使用情況或來源不同(雞源、犬源)可使細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性不同，劉硯涵等[13]在對具有免疫程序的養(yǎng)雞場藥敏實驗結(jié)果顯示該雞源大腸桿菌對氨芐西林、氯霉素、四環(huán)素、氟苯尼考等耐藥。蘇玉珍[22]對寵物犬源分離的大腸桿菌藥敏實驗結(jié)果顯示其分離菌對頭孢曲松、頭孢他啶、氟苯尼考等耐藥。通過該竹鼠養(yǎng)殖場技術(shù)人員的反饋，由于該養(yǎng)殖場規(guī)模較小和講求“綠色生態(tài)”的原因，并未對竹鼠投喂任何藥物。據(jù)上述研究表明不同來源的大腸埃希氏菌和藥物的使用情況對個別藥物的敏感性具有差異性。耐藥基因檢測出Intl1和tetA2種耐藥基因，結(jié)合藥敏僅對四環(huán)素類藥物耐藥，表明本研究分離的大腸埃希氏菌對四環(huán)素類耐藥與基因型相符合。

細(xì)菌所帶的毒力基因與其致病性密切相關(guān)，細(xì)菌所攜帶毒力因子與其致病性緊密相關(guān)，papA、UidA、afa，fyuA、irp-2、ompA、papC、fimH是大腸埃希氏菌的重要致病基因。王紹紅等[23]和王洪彬等[24]研究中把papA、UidA、afa等因子作為大腸埃希氏菌病致死的主要毒力基因。綜合上述研究分析引起本次竹鼠死亡的原因與分離株攜帶有這3種毒力基因有關(guān)。

4 結(jié)論

試驗對從貴州省三穗縣某竹鼠養(yǎng)殖場送檢病死竹鼠體內(nèi)分離到1株攜帶3種毒力基因的竹鼠源大腸埃希氏菌致病菌，通過藥敏實驗、耐藥基因檢測顯示分離菌對磺胺異噁唑、阿莫西林、新霉素等藥物敏感，對四環(huán)素類藥物耐藥，建議養(yǎng)殖場用敏感藥物進(jìn)行該細(xì)菌病的防治。