婁夢函, 朱燕云, 朱 寧, 李冰青, 孔祥平, 葛繼文, 杜 靜, 靳紅梅,3,4
(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院循環(huán)農(nóng)業(yè)研究中心, 南京 210014; 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 南京 210095; 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室, 南京 210014; 4.江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210095; 5. 南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司, 南京 211102)
我國是畜禽養(yǎng)殖大國,年產(chǎn)糞便總量高達(dá)38億t,但其綜合利用率不足60%,嚴(yán)重制約了畜牧業(yè)的健康發(fā)展[1]。厭氧消化技術(shù)是畜禽養(yǎng)殖場糞便處理的重要手段,在規(guī)?;i和奶牛養(yǎng)殖場應(yīng)用十分普遍[2-3]。厭氧消化技術(shù)不僅能有效降低糞便中的主要污染物,而且產(chǎn)生的沼氣可作為清潔能源,厭氧消化殘留物(即沼液和沼渣)可作為肥料還田[4-5],是發(fā)展生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)的重要紐帶。
畜禽糞便中的腐殖質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性強(qiáng),難以在常規(guī)生物處理過程中被降解[6]。研究表明,腐殖質(zhì)在生物處理過程中基本上不能作為異養(yǎng)微生物的碳源,即使有部分腐殖質(zhì)被分解,微生物也只是改變了它們的部分結(jié)構(gòu)[7]。目前,國內(nèi)外對于畜禽糞便中腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化特性的研究多集中在好氧堆肥方面[8-10],而厭氧消化對腐殖質(zhì)含量和特性的影響尚缺乏細(xì)致的研究?,F(xiàn)有關(guān)于厭氧條件下腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究多集中在市政污水和污泥的處理過程中。例如,郝曉地[7]等研究了腐殖質(zhì)在污水處理單元的演變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腐殖酸(Humus, HS)的含量在不斷變化的同時各組分之間也存在著相互轉(zhuǎn)化關(guān)系,且污水的不同處理方式對富里酸(Fulvic acid, FA)和胡敏酸(Humic acid, HA)的去除效果有所不同。厭氧消化過程中腐殖質(zhì)不僅難以被生物降解,而且還可能因為腐殖質(zhì)結(jié)構(gòu)中羧基、酚羥基與水解酶結(jié)合而抑制水解過程,最終影響厭氧消化的速率和消化殘留物的品質(zhì)[6]。例如,唐興[11]等研究發(fā)現(xiàn),腐殖質(zhì)主要通過靜電網(wǎng)捕、共價鍵、化學(xué)平衡等作用方式影響污泥厭氧消化的水解過程。腐殖質(zhì)中豐富的官能團(tuán)是重(類)金屬及有機(jī)污染物在環(huán)境中遷移和轉(zhuǎn)化的重要載體[12],進(jìn)一步影響生態(tài)環(huán)境安全和人類健康[13],一直以來是環(huán)境地球化學(xué)研究領(lǐng)域的熱點[14-15]。
我國每年沼氣工程產(chǎn)生的消化殘留物數(shù)量已超過3億噸,農(nóng)田利用是其最主要的消納途徑[4]。闡明厭氧消化條件對畜禽糞便中腐殖質(zhì)變化特征的影響,對消化殘留物還田后的肥效及其環(huán)境效應(yīng)具有重要的意義。我國生豬和奶牛養(yǎng)殖量位居世界第一位和第四位,二者的糞便產(chǎn)生量占我國畜禽養(yǎng)殖糞便排放總量的65%以上[16],中溫厭氧消化工藝是豬、奶牛糞處理中最常用的手段之一。鑒于此,本研究通過室內(nèi)批次中溫35℃±1℃厭氧消化試驗,研究了豬、奶牛糞在不同進(jìn)料濃度條件下消化殘留物中HS,F(xiàn)A和HA含量的變化特征,進(jìn)一步結(jié)合傅里葉紅外光譜法(FTIR)解析了消化殘留物中官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的變化,以期為畜禽糞便沼液和沼渣后續(xù)的合理利用及環(huán)境風(fēng)險評估提供參考。
供試原料為豬糞和奶牛糞,分別取自本研究團(tuán)隊長期定位監(jiān)測的規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場和奶牛養(yǎng)殖場。取樣時間分別為2019年3月20日和3月2日,一次性取樣后置于0℃~4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩=臃N物為監(jiān)測豬場的發(fā)酵罐排出的污泥,在實驗室經(jīng)中溫35℃±1℃馴化至甲烷含量占總產(chǎn)氣量的55%以上后使用。各物料基本理化性質(zhì)詳見表1。
表1 物料基本理化性質(zhì)
厭氧消化試驗在180 mL血清瓶(有效容積為150 mL)中進(jìn)行。試驗設(shè)置5個處理,各處理的物料配比詳見表2。接種物接種量設(shè)為30%(w∶w)。根據(jù)各處理的進(jìn)料濃度和接種量,分別在血清瓶中加入相應(yīng)的物料,其余的用蒸餾水作為補(bǔ)充。裝料后立即通入高純氮氣(>99.99%)5 min,用以驅(qū)趕瓶內(nèi)空氣。通氣結(jié)束后立即用橡膠塞密封,并放置于恒溫水浴鍋35℃±1℃中進(jìn)行試驗。每天上午9:00和下午5:00手動搖勻物料兩次,隨后記錄日產(chǎn)氣量并測定氣體中的CH4含量。試驗進(jìn)行至反應(yīng)體系中日產(chǎn)氣量不足總產(chǎn)氣量1%時停止[17],共計34 d。每個處理設(shè)置3個重復(fù)(n=3)。
表2 試驗處理及物料配比
1.3.1 取樣方法
試驗結(jié)束后,稱量消化殘留物質(zhì)量,并充分混勻后取樣。樣品分為兩部分,一部分用于測定常規(guī)指標(biāo),另一部分采用真空冷凍干燥機(jī)(Alpha1-4/2-4LD Plus,北京五洲東方科技發(fā)展有限公司,北京)進(jìn)行冷凍干燥處理,用于測定腐殖質(zhì)含量和結(jié)構(gòu)。
1.3.2 測定方法
(1)日產(chǎn)氣量和甲烷含量:日產(chǎn)氣量采用排水法測定[18],甲烷含量采用氣相色譜儀(GC9890B,南京仁華色譜科技應(yīng)用開發(fā)中心,江蘇)測定;
(2)pH值:采用pH計(FE20,梅特勒-托利多儀器有限公司,上海)測定;
(3)TS含量:樣品用電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9076A, 上海精宏實驗設(shè)備有限公司,上海)于105℃溫度下烘干至恒重,冷卻至室溫后稱重;
(4)VS含量:樣品用馬弗爐(SRJX-4-13,天津市泰斯特儀器有限公司,天津)于550℃下灼燒3 h,冷卻至室溫后稱重[18];
(5)TOC和TN含量:參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY525-2012有機(jī)肥料》中的方法測定;
(6)腐殖質(zhì)含量:參照國際腐殖質(zhì)協(xié)會(International Humic Substances Society, IHSS)制定的方法提取,即用NaOH+Na4P2O7提取法提取總腐殖質(zhì)(HS),用“堿溶酸析”的方法提取FA和HA[19]。提取液分別采用TOC儀(MultiN/C3100,德國耶拿分析儀器股份公司,德國)測定其中的有機(jī)碳含量;
(7)基團(tuán)組成結(jié)構(gòu):取1~2 mg凍干固體,利用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet Is50,賽默飛世爾科技公司,美國)進(jìn)行紅外光譜分析,波數(shù)采集范圍為4000~400 cm-1。
試驗中所用藥品均為分析純。
干物質(zhì)計算公式為:
m=m0×TS
(1)
式中:m為物料干物質(zhì)重量,g;m0為物料總質(zhì)量;TS為總固體含量。
HS回收率計算公式為:
(2)
式中:R為HS的回收率,%;MFA為FA的質(zhì)量,mg;MHA為HA的質(zhì)量,mg;MHS為HS的質(zhì)量,mg。
物料中HS,FA,HA質(zhì)量(以干重計)計算公式為:
M=C×m
(3)
式中:M為HS或FA或HA的質(zhì)量,mg;C為HS或FA或HA的濃度,mg·g-1;m為物料干重,g。
紅外光譜數(shù)據(jù)處理采用OMNIC8.2v.軟件,首先將透過率轉(zhuǎn)化為吸光度,然后分別進(jìn)行自動基線校正、縱坐標(biāo)極差標(biāo)準(zhǔn)歸一化,在所得的樣品圖譜中根據(jù)峰面積計算方法,求得各吸收峰面積,以某一特定吸收峰面積與所有紅外吸收峰面積的比值表示這一組分的相對含量。
各指標(biāo)在不同處理間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多重比較采用最小顯著性差異法(LSD),同一處理發(fā)酵前后的差異采用獨立樣本T檢驗,統(tǒng)計分析軟件為SPSS19.0v.,圖形繪制軟件為Origin9.4v.。
整個中溫厭氧消化過程中的日產(chǎn)氣量、累積產(chǎn)氣量、日產(chǎn)甲烷量與累積產(chǎn)甲烷量變化如圖1~圖4所示。不同發(fā)酵濃度的豬糞和奶牛糞的日產(chǎn)量變化差異明顯,即:豬糞最大日產(chǎn)氣量出現(xiàn)在9 d以后,且在第12天和第25 天出現(xiàn)第2次產(chǎn)氣高峰。這可能是由于豬糞中可溶性有機(jī)物含量高,前期被分解產(chǎn)生大量的有機(jī)酸導(dǎo)致體系pH值下降,對產(chǎn)甲烷菌有一定的抑制作用,隨后微生物通過自身的緩沖調(diào)節(jié)恢復(fù)正常代謝水平[20];而奶牛糞在發(fā)酵4 d內(nèi)即達(dá)到最大日產(chǎn)氣量,隨后逐漸下降(見圖1)。從累積產(chǎn)氣量看(見圖2),豬糞處理組顯著(p<0.05)高于奶牛糞處理組,發(fā)酵濃度高的處理組高于發(fā)酵濃度低的處理組。日產(chǎn)甲烷量、累積產(chǎn)甲烷量變化趨勢與日產(chǎn)氣量、累積產(chǎn)氣量基本一致(見圖3和圖4)。各處理的甲烷含量最終穩(wěn)定在60%左右,累積產(chǎn)氣量達(dá)238.0~484.8 mL·g-1VS,這與團(tuán)隊前期利用相同原料進(jìn)行中溫厭氧消化的研究結(jié)果基本一致[18,21],說明本研究反應(yīng)體系正常,所得的消化殘留物具有代表性。
注:平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3),下同。
圖2 發(fā)酵過程中的累積產(chǎn)氣量
圖3 發(fā)酵過程中日產(chǎn)甲烷量
圖4 發(fā)酵過程中累積產(chǎn)甲烷量
豬糞和奶牛糞中溫厭氧消化前后的干物質(zhì)質(zhì)量變化如圖5所示。產(chǎn)氣結(jié)束后,各處理的干物質(zhì)質(zhì)量均有不同程度的降低,這是由于微生物利用了原料中糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸等物質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì),將其轉(zhuǎn)化為CH4,CO2等氣體排出發(fā)酵體系,最終導(dǎo)致發(fā)酵體系中干物質(zhì)質(zhì)量降低[22-23]。CK,PM1,PM2,DM1和DM2處理發(fā)酵后干物質(zhì)質(zhì)量降幅分別為5.3%,31.0%,31.7%,15.4%,17.9%。除CK外,各處理的降幅均達(dá)到顯著(p<0.01)水平。其中豬糞中溫厭氧消化后干物質(zhì)質(zhì)量降幅顯著(p<0.01)高于奶牛糞,同時,高濃度處理的干物質(zhì)質(zhì)量降幅高于低濃度處理。這也與前文所述產(chǎn)氣結(jié)果相一致,即產(chǎn)氣越多的處理組其干物質(zhì)損失也越多。
注:平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3);不同大、小寫字母分別表示發(fā)酵前后各處理間差異顯著(p<0.05);ns,**表示同一物料發(fā)酵前后無顯著性差異和差異顯著(p<0.01),下同。
根據(jù)HS在酸堿性水溶液中的溶解度的不同,可將其分為FA和HA和胡敏素(Humin,HM)。其中,F(xiàn)A既能溶于堿溶液,又可溶于酸溶液;HA可溶于堿溶液,但不能溶于酸溶液;而HM不能溶于酸或堿溶液中,因此不能用酸堿溶液提取[24-25]。由于HM成分復(fù)雜、分離純化較為困難,且其呈惰性幾乎不參與反應(yīng),因此本試驗主要探討了HS,FA和HA含量的變化特征。為保證試驗的準(zhǔn)確性,首先對HS的回收率進(jìn)行計算(詳見公式2)。從表3可以看出,利用IHSS方法提取所得HS的回收率在86%~112%,測定結(jié)果可靠。
表3 物料腐殖質(zhì)含量的回收率
中溫厭氧消化前后物料中HS,HA和FA的濃度變化如圖6~圖8所示。中溫厭氧消化后,除了DM1和CK處理外,其他處理的消化殘留物中HS和FA濃度均顯著(p<0.01)降低(圖6和圖7),這說明中溫厭氧消化會降低物料中HS和FA的濃度,二者被微生物部分降解或轉(zhuǎn)化為HA;豬糞和對照處理中HA濃度均顯著(p<0.01)降低,而其在奶牛糞處理中卻顯著(p<0.01)升高(圖8)。這與李琦等人進(jìn)行的污泥干式厭氧發(fā)酵后腐殖酸變化的研究結(jié)果相一致[26],說明厭氧消化體系中微生物分解利用可生物降解的有機(jī)質(zhì),產(chǎn)生許多中間代謝產(chǎn)物,如糖類、氨基酸和小分子有機(jī)酸等,微生物在適宜條件下利用這些代謝產(chǎn)物合成HA(即美拉德反應(yīng)),從而造成HA濃度上升[27]。HS,HA和FA的濃度隨發(fā)酵濃度的增加而增加;豬糞原料中HS,FA濃度顯著(p<0.05)高于奶牛糞,這主要與豬糞中腐殖質(zhì)含量較高有關(guān)[28]。
圖8 發(fā)酵前后物料中HA濃度變化
圖7 發(fā)酵前后物料中FA濃度變化
圖6 發(fā)酵前后物料中HS濃度變化
由于中溫厭氧消化過程中物料的質(zhì)量發(fā)生變化,因此將腐殖質(zhì)的濃度換算為質(zhì)量進(jìn)行分析(詳見公式3)。中溫厭氧消化前后物料中HS,HA和FA的總質(zhì)量變化如圖9~圖11所示。除奶牛糞中HA質(zhì)量及對照組FA質(zhì)量無明顯變化之外,其余處理組的腐殖質(zhì)質(zhì)量變化總體趨勢與濃度變化基本一致,即厭氧消化后HS,F(xiàn)A和HA的質(zhì)量均有顯著(p<0.01)降低,這主要是由于畜禽糞便經(jīng)厭氧發(fā)酵后消化殘留物中的干物質(zhì)含量下降所造成。厭氧消化對FA的去除效果優(yōu)于HA,主要是由于FA分子量(600~1500 Da)小于HA分子量(10000~100000 Da),且FA解離程度高而芳香化程度低,同時也說明了HA作為高分子聚合物難以被生物降解的特性[9]。
圖11 發(fā)酵前后物料HA質(zhì)量變化
圖9 發(fā)酵前后物料HS質(zhì)量變化
基于FTIR分析的中溫厭氧消化前后物料基團(tuán)組成結(jié)構(gòu)的變化特征詳見圖12。已有研究表明,峰1(3050~3570 cm-1)表征C-OH的伸縮振動,化合物來源主要為多糖、纖維素;峰2(2930~2840cm-1)表征脂肪族、脂質(zhì)類化合物的C-H伸縮振動吸收;峰3(1650~1630 cm-1)表征芳環(huán)的C=C骨架振動吸收、酰胺類物質(zhì)中的C=O伸縮振動(酰胺Ⅰ帶),多來源于苯環(huán)、芳香族化合物[29];峰4(1664~1515 cm-1)表征酰胺羧基C=O伸縮振動、酰胺類化合物中的N-H彎曲變形(酰胺Ⅱ帶),故將其指定為氨基類化合物、蛋白質(zhì)類物質(zhì);峰5(1410~1380 cm-1)表征酚羥基C-O的伸縮振動峰,可將其歸于酚醛類化合物[30];峰6(1280~1150 cm-1)表征芳香族化合物COOH的伸縮振動,化合物來源多為FA;峰7(1050~1000 cm-1)表征糖類C-O單鍵的伸縮振動,代表性物質(zhì)主要為多糖類化合物[31]。中溫厭氧消化前后各物料的FTIR圖譜形狀較為相似,吸收峰個數(shù)與吸收峰位置基本不變。這表明豬、奶牛糞中溫厭氧消化后,消化殘留物的結(jié)構(gòu)組分與官能團(tuán)種類未發(fā)生明顯的變化。
圖10 發(fā)酵前后物料FA質(zhì)量變化
圖12 發(fā)酵前后各處理物料的FTIR譜圖
中溫厭氧消化前后物料中各官能團(tuán)的相對含量詳見表4。結(jié)果表明,物料主要由糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、酚類等有機(jī)化合物組成,其中以多糖類(峰1、峰7)的占比最高,這與前人的文獻(xiàn)報道相似[31]。DM2,PM2處理厭氧消化前后各官能團(tuán)占比的變化幅度高于DM1,PM1處理,說明高濃度條件下厭氧消化反應(yīng)更為活躍,這與前文中產(chǎn)氣情況及干物質(zhì)質(zhì)量變化相一致。與原料相比,PM1,PM2處理中多糖類物質(zhì)占比有所升高,而DM1,DM2處理中多糖類物質(zhì)占比下降,表明奶牛糞在發(fā)酵過程中部分糖類作為營養(yǎng)物質(zhì)被微生物所利用;DM1,DM2處理中脂肪族、蛋白質(zhì)類、酚類化合物占比均下降,這是造成其多糖類物質(zhì)占比增加的主要原因。而DM1,DM2處理中脂肪族、脂質(zhì)、酚類化合物占比增加,主要是厭氧微生物代謝產(chǎn)物增加造成的;除PM2外,所有處理的芳香類化合物(峰3和峰6)占比均有所升高,可能是由于PM2處理厭氧消化過程最為活躍,使得少量芳香類化合物被微生物分解。綜合分析可以看出,厭氧微生物更容易利用脂肪族、酚類、蛋白質(zhì)等小分子有機(jī)物[26,31]。此外,腐殖質(zhì)中含氧官能團(tuán)的大量存在會增強(qiáng)氧化還原、絡(luò)合、離子交換等反應(yīng)性,最終影響厭氧發(fā)酵速率、發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)及其對土壤改良效果。
表4 發(fā)酵前后物料中各官能團(tuán)相對含量 (%)
(1)豬糞和奶牛糞中溫厭氧消化后,消化殘留物中的HS和FA含量顯著(p<0.01)降低。豬糞消化殘留物的HA含量顯著(p<0.01)降低,而奶牛糞中HA含量無明顯變化。
(2)豬糞消化殘留物的多糖類物質(zhì)含量占比升高,脂肪族、酚類、蛋白質(zhì)等化合物的占比減少;而奶牛糞消化殘留物中多糖類物質(zhì)含量占比均有所降低,脂肪族、脂質(zhì)、酚類化合物占比增加。芳香類物質(zhì)難以被分解,僅高濃度豬糞中溫厭氧消化后有少量芳香類化合物減少。