董麗麗， 曹廣麗， 武繼文， 任南琪

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院 城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150090)

近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和人民生活水平的提高，我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展。同時(shí)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模不斷擴(kuò)大，集約化程度逐年增高，隨之而來(lái)產(chǎn)生了越來(lái)越多的有機(jī)固體廢棄物和高濃度有機(jī)廢水，給環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重污染和壓力。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年，我國(guó)全年禽畜排放糞便量(包括尿液量)達(dá)到65.54億t，其中牛糞 20.94億t[1]。預(yù)計(jì)到2020年我國(guó)畜禽糞污每年總排放量會(huì)超過(guò)40 億t[2-3]。畜禽糞污雖然是農(nóng)業(yè)環(huán)境的主要污染源，但也是蘊(yùn)含巨大能量的可再生能源，若能進(jìn)行合理開(kāi)發(fā)利用，可以創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益[4]。厭氧消化是畜禽糞污無(wú)害化和資源化處理應(yīng)用的最有效方式之一[5-6]。

沼氣工程生產(chǎn)大量甲烷的同時(shí)還產(chǎn)生了大量的沼液。沼液作為沼氣工程中的一種有價(jià)值的副產(chǎn)物，其含有多種生物活性物質(zhì)，如氨基酸、維生素、微量元素等，可防治害蟲(chóng)，提高抗病能力[7-8]。此外，沼液作為一種優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)肥料，可以肥沃土壤，改良作物品種，提高產(chǎn)量。但由于很多大型沼氣工程周邊土地配套不足、同時(shí)農(nóng)田分散、季節(jié)性耕種等原因，沼液還無(wú)法充分實(shí)現(xiàn)全量利用[9]。這就造成了造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和對(duì)環(huán)境的二次污染，不利于沼氣工程的建設(shè)和推廣。近年來(lái)，開(kāi)始有人研究將厭氧消化的沼液再回流到厭氧系統(tǒng)中，這樣不僅能夠提升進(jìn)料中的微生物含量，使底物得到更充分利用，又可減少沼液后續(xù)處理的負(fù)擔(dān)，從而保證了大中型沼氣工程的順利運(yùn)行和可持續(xù)發(fā)展[10-11]。同時(shí)沼液回流技術(shù)為大中型沼氣工程運(yùn)行過(guò)程中的減排和節(jié)約淡水資源提供重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。吳樹(shù)彪[12]在研究沼液回流對(duì)牛糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣特性能影響時(shí)得出的50%的沼液進(jìn)行回流時(shí)，能夠提高基質(zhì)產(chǎn)甲烷率，促進(jìn)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的合成代謝。Guo[13]等研究結(jié)果指出餐廚垃圾和豬糞在中溫條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)甲烷，回流能夠增加基質(zhì)的產(chǎn)甲烷率。王星[14]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低負(fù)荷條件下，提高消化液回流比可以使餐廚垃厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氣量明顯提高。完全混合式反應(yīng)器(Completely-stirred tank reactor, CSTR)和推流式反應(yīng)器(Plug-flow reactor, PFR)是厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣工藝中最常見(jiàn)的兩種反應(yīng)器[6]。相較于CSTR容易出現(xiàn)底物短流的現(xiàn)象，理想的PFR反應(yīng)器不將底物與所有污泥完全混合，而是與部分污泥混合后從反應(yīng)器的進(jìn)料端進(jìn)入反應(yīng)器，使其在反應(yīng)器長(zhǎng)度方向呈活塞方式依次向前推進(jìn)，直至反應(yīng)器的出料端出料，從而能夠避免短流現(xiàn)象，尤其是在處理高含固率有機(jī)物(如畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈)的發(fā)酵處理時(shí)，減小了動(dòng)力消耗，降低了運(yùn)行成本[15-16]。然而，對(duì)于沼液回流技術(shù)應(yīng)用在PFR厭氧發(fā)酵牛糞產(chǎn)沼氣方面缺乏相應(yīng)研究。

本文以牛糞為原料，在45 L半連續(xù)進(jìn)料PFR的厭氧反應(yīng)器中，設(shè)置未回流沼液和使用了回流進(jìn)料量50%的沼液的進(jìn)料方式，考察長(zhǎng)期消化過(guò)程中沼液回流對(duì)產(chǎn)甲烷效率和穩(wěn)定性參數(shù)的影響。在100 d的連續(xù)運(yùn)行中監(jiān)測(cè)每日的產(chǎn)氣量、氣體成分組成、進(jìn)出料pH值、進(jìn)出料的總干物質(zhì)含量(TS)和揮發(fā)性有機(jī)物含量(VS)、以及每隔3至7 d對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行取樣監(jiān)測(cè)pH值的變化。同時(shí)結(jié)合高通量測(cè)序給出沼液回流后反應(yīng)器處于穩(wěn)定運(yùn)行期內(nèi)的微生物群落狀態(tài)。這為以牛糞為原料在PFR內(nèi)提升厭氧發(fā)酵效率提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)，同時(shí)對(duì)大型沼氣工程運(yùn)行降低成本、減少沼液后續(xù)處理及利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 牛糞及接種物

實(shí)驗(yàn)中所用的牛糞取自哈爾濱完達(dá)山奶牛養(yǎng)殖有限公司(5000頭規(guī)模奶牛場(chǎng))的泌乳牛舍。新鮮的牛糞收集到密閉的容器中，放置在4 ℃的冰箱中儲(chǔ)存。為了防止牛糞長(zhǎng)時(shí)間存放導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，實(shí)驗(yàn)所用牛糞每7天重新取一次。反應(yīng)器啟動(dòng)過(guò)程中所用接種沼液取自現(xiàn)代牧業(yè)雙城糞污處理項(xiàng)目，該項(xiàng)目采用的是PFR厭氧發(fā)酵工藝，裝機(jī)容量為3MW[6]。該項(xiàng)目自建設(shè)投產(chǎn)使用至今已經(jīng)連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行5年，日產(chǎn)沼氣3.97萬(wàn)立方米。牛糞和接種沼液的主要理化指標(biāo)如表1所示。

表1 牛糞及接種沼液的特性( 質(zhì)量分?jǐn)?shù))

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置和運(yùn)行

實(shí)驗(yàn)采用1個(gè)體積為45 L的PFR反應(yīng)器(見(jiàn)圖 1)進(jìn)行半連續(xù)進(jìn)料厭氧發(fā)酵，有效發(fā)酵體積為36 L，水力停留時(shí)間(HRT)為20 d。在沼液回流運(yùn)行期，每天回流進(jìn)料量50%的沼液到進(jìn)料底物。

圖1 推流式(PFR)厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)裝置流程圖

實(shí)驗(yàn)具體過(guò)程如下:在38 ℃±1 ℃發(fā)酵溫度下，反應(yīng)器中接種36 L沼液開(kāi)始啟動(dòng)，啟動(dòng)期間為了保證反應(yīng)器內(nèi)微生物盡快適應(yīng)新環(huán)境，采用逐漸增加進(jìn)料量的進(jìn)料方式，每天定時(shí)用蒸餾水將牛糞稀釋到TS濃度為7%～10%，配好的料液加熱至38 ℃±1 ℃后混勻進(jìn)入反應(yīng)器。當(dāng)沼氣日產(chǎn)量、甲烷體積分?jǐn)?shù)穩(wěn)定后逐步提升進(jìn)料量直至設(shè)計(jì)負(fù)荷(反應(yīng)器啟動(dòng)的第1 天到18 天)，反應(yīng)器開(kāi)始進(jìn)入運(yùn)行階段(第19天到46 天)，反應(yīng)器從第47 天開(kāi)始回流沼液，具體步驟為:利用反應(yīng)器每日出料的沼液與進(jìn)料底物以 1∶2體積比混合均勻進(jìn)入反應(yīng)器，實(shí)驗(yàn)繼續(xù)運(yùn)行至第100 天結(jié)束。

1.3 檢測(cè)方法

為了檢測(cè)反應(yīng)器啟動(dòng)及運(yùn)行過(guò)程的各項(xiàng)參數(shù)，進(jìn)出料的樣品每天收集，取樣孔1，取樣孔2每隔5～7 d取樣一次。使用排水法記錄日產(chǎn)氣量。利用氣相色譜儀測(cè)定氣體組分和揮發(fā)酸(VFAs)(GC, 7890A, Agilent Cooperation, USA)；總固體含量(TS)與揮發(fā)性固體含量(VS)采用重量法測(cè)定；pH和化學(xué)需氧量(COD )用HACH-HQ40d multi和HACH-DRB 200測(cè)定。總氮(TN)和總磷(TP)用analytikjena multi N/C 2100s和Perkin Elmer Optima 8300測(cè)定。氧化還原電位用上海精密儀器公司生產(chǎn)的C220-ORP測(cè)定儀測(cè)定。

1.4 微生物Illumina MiSeq高通量測(cè)序

為了觀察回流沼液后反應(yīng)器內(nèi)微生物群落的狀態(tài)，在反應(yīng)器回流沼液運(yùn)行穩(wěn)定后分別從取樣孔1、取樣孔2取3～10 mL樣品于離心管中放置在-80 ℃的冰箱中作為DNA分析的樣品。

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；細(xì)菌擴(kuò)增引物為338F (5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。古菌的擴(kuò)增引物為524F (5' - TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3')對(duì)V4-V5可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20uL，4uL 5*FastPfu緩沖液，2uL 2.5mM dNTPs，0.8uL引物(5uM)，0.4ulFastPfu聚合酶；10ng DNA模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，27個(gè)循環(huán)(95℃ 變性30s，55℃ 退火30s, 72℃ 延伸30s)，最后72℃延伸10min (PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。純化后再送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。采用 Qiime軟件(version 1.17)和UCHIME對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、修剪并嵌合體序列。采用Uparse(version 7.1)進(jìn)行運(yùn)算分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚類分析(97%相似度)，并通過(guò)RDP Classifier(version 2.2)對(duì)OTU的代表序列作分類學(xué)分析(70%的相關(guān)系數(shù)閾值)?；?OTU 聚類分析結(jié)果，采用Mothur軟件(Mothur v.1.30.1)對(duì) OTU 進(jìn)行多樣性指數(shù)分析[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 沼液回流對(duì)日產(chǎn)氣量及氣體成份變化的影響

快速穩(wěn)定的啟動(dòng)對(duì)于一個(gè)厭氧反應(yīng)器十分必要。為了縮短反應(yīng)器啟動(dòng)期的時(shí)間，在啟動(dòng)階段(第1 ～18 天)采用100%的體積比沼液接種，同時(shí)根據(jù)日產(chǎn)氣量的情況逐漸增加進(jìn)料量來(lái)保證快速穩(wěn)定的啟動(dòng)。如圖2所示，反應(yīng)器運(yùn)行的前5天，產(chǎn)氣量一直處于較大的波動(dòng)狀態(tài)，造成這樣現(xiàn)象的原因主要是接種物剛進(jìn)入一個(gè)新環(huán)境，它有一個(gè)適應(yīng)期和延滯期。有研究結(jié)果表明，產(chǎn)甲烷菌的水力停留時(shí)間要超過(guò)5 d之后才能夠開(kāi)始利用揮發(fā)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)甲烷[18]。反應(yīng)器從第6 天開(kāi)始，日產(chǎn)氣量開(kāi)始逐漸上升，直至第18 天達(dá)到38.19 L·d-1，容積產(chǎn)氣率達(dá)到了1.06 L·L-1d-1。從第19 天 到 46 天的運(yùn)行，反應(yīng)器的容積產(chǎn)氣率變化不大，在一定范圍內(nèi)進(jìn)行波動(dòng)，這表明反應(yīng)器在第18 天時(shí)啟動(dòng)成功，內(nèi)部的厭氧微生物已經(jīng)適應(yīng)新的環(huán)境。

圖2 日產(chǎn)氣量變化曲線及每日沼液回流量

反應(yīng)器在成功啟動(dòng)后，進(jìn)入穩(wěn)定運(yùn)行期(第19 d～46天)，即每日不回流沼液到進(jìn)料中。如圖2所示，反應(yīng)器在穩(wěn)定運(yùn)行期內(nèi)，日產(chǎn)氣量在35.93 L·d-1～45.96 L·d-1之間波動(dòng)，平均日產(chǎn)氣量為40.79 L·d-1，但整體保持平穩(wěn)狀態(tài)。造成每日產(chǎn)氣量波動(dòng)的原因主要是因?yàn)槊咳者M(jìn)料底物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一直處于一個(gè)波動(dòng)的狀態(tài)，造成產(chǎn)氣量產(chǎn)生波動(dòng)。反應(yīng)器從第47天開(kāi)始，進(jìn)料底物中每日回流進(jìn)料量一半的沼液，從圖2中可以看出從回流沼液開(kāi)始，日產(chǎn)氣量逐漸上升，直至第52 天，日產(chǎn)氣量達(dá)到峰值57.92 L·d-1(容積產(chǎn)氣率為1.61 L·L-1d-1)。從第53 天開(kāi)始至運(yùn)行結(jié)束，日產(chǎn)氣量在48.45 L·d-1～57.92 L·d-1之間波動(dòng)，日均產(chǎn)氣量為52.52 L·d-1。相較于未回流沼液運(yùn)行階段，日產(chǎn)氣量提升了28.76%。由此表明沼液回流能夠提高反應(yīng)器整體的產(chǎn)氣量。在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，底物的水解程度關(guān)系到整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的效率，沼液回流能夠提升PFR厭氧反應(yīng)器前端的微生物濃度，強(qiáng)化牛糞水解酸化效果進(jìn)而提高沼氣產(chǎn)量。這與王文政[19]和盧艷娟[20]在研究沼液回流對(duì)玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣性能影響和沼液回流對(duì)厭氧沼氣工程的影響時(shí)得出的回流對(duì)日產(chǎn)氣量無(wú)明顯作用的結(jié)果不太相同。

沼氣當(dāng)中主要含有甲烷和二氧化碳。甲烷體積分?jǐn)?shù)是衡量厭氧消化系統(tǒng)運(yùn)行效率的基礎(chǔ)指標(biāo)[12]。在反應(yīng)器啟動(dòng)的前5 d，甲烷的含量低于50%且波動(dòng)較大(見(jiàn)圖3)。這是由于反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)氣室中充滿的是空氣，這些空氣會(huì)逐步隨著產(chǎn)生的沼氣排出，同時(shí)由于微生物處于適應(yīng)期，消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于自身繁殖，因此沼氣中甲烷含量較低，而二氧化碳的含量較高。從第6 天開(kāi)始，甲烷含量開(kāi)始升高，到第11天時(shí)，甲烷含量達(dá)到60.75%。在反應(yīng)器之后的運(yùn)行直至停止運(yùn)行，甲烷含量在58.32%～65.85%波動(dòng)，日產(chǎn)平均甲烷含量為61.16%。而在沼液回流運(yùn)行期間，每日產(chǎn)氣中的平均甲烷含量為61.15%。由此表明，沼液回流對(duì)產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量并未有所影響。

圖3 日產(chǎn)沼氣中氣體成分變化情況

2.2 進(jìn)料出料及取樣的pH值變化

在厭氧消化過(guò)程中，pH值是影響微生物生長(zhǎng)的重要參數(shù)[21]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甲烷菌對(duì) pH值較為敏感，其適宜生長(zhǎng)的pH值范圍為 6.5～7.8之間[22-23]。如圖4所示，反應(yīng)器每日進(jìn)料的pH值在6.30～7.93波動(dòng)，且波動(dòng)較大。這主要是牛糞的pH值是波動(dòng)的，造成每日進(jìn)料的pH值變化。然而在沼液回流運(yùn)行期間，進(jìn)料的pH值在6.30～6.98波動(dòng)。波動(dòng)的范圍明顯縮小，這表明沼液回流可以對(duì)進(jìn)料的pH值起到緩沖作用。進(jìn)料的pH值變化變小，對(duì)反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行極為有利。然而從出料的pH值可以看出，啟動(dòng)期間出料的pH值在7.28～7.96波動(dòng)，且在啟動(dòng)后5 d，pH值逐漸趨于穩(wěn)定。這表明反應(yīng)器在啟動(dòng)階段，微生物從進(jìn)入到新環(huán)境到逐漸適應(yīng)的過(guò)程。從圖4中可以得出，運(yùn)行階段出料的pH值波動(dòng)很小，一直處于7.73～7.86波動(dòng)。然而在第36 天出料的pH值為7.22，產(chǎn)生這種現(xiàn)象主要是由于PFR反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，PFR的進(jìn)料是先進(jìn)先出，造成這一天pH值較大幅度降低是由于一個(gè)停留期前當(dāng)天進(jìn)料的pH值較低。底物經(jīng)過(guò)一個(gè)水力停留期發(fā)酵，盡管產(chǎn)甲烷的過(guò)程中pH值升高，但是由于水解酸化后的pH值較低，以至于出料的pH值也低。但該數(shù)值也在甲烷發(fā)酵的正常范圍內(nèi)。在沼液回流運(yùn)行期，反應(yīng)器的出料pH值一直處于較小幅度的波動(dòng)，在7.18～7.34之間，這驗(yàn)證了沼液回流能夠緩沖進(jìn)料的pH值，進(jìn)而影響出料的pH值浮動(dòng)。同時(shí)也反映了反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行狀態(tài)。從對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中取樣的數(shù)值可以看出，在啟動(dòng)期和運(yùn)行期的波動(dòng)幅度較大，而沼液回流運(yùn)行期，pH值的波動(dòng)幅度較小。這說(shuō)明沼液回流能夠起到緩沖運(yùn)行過(guò)程中的pH值。

圖4 每日進(jìn)出料及取樣的pH值變化情況

2.3 原料產(chǎn)氣率

反應(yīng)器整個(gè)運(yùn)行期內(nèi)干物質(zhì)的產(chǎn)氣率和揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)氣率及產(chǎn)沼率如圖5和圖6所示。在啟動(dòng)期內(nèi)，揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)氣率在8.22 L·kg-1VS (7.06 L·g-1TS)～346.20 L·kg-1VS (294.29 L·kg-1TS)波動(dòng)較大。主要是由于啟動(dòng)期間原料的水力停留時(shí)間是從開(kāi)始的1天增長(zhǎng)到設(shè)計(jì)的20天，原料產(chǎn)氣率逐步提高；其次是在啟動(dòng)期間微生物在進(jìn)入新環(huán)境中還不穩(wěn)定。因此啟動(dòng)期原料產(chǎn)氣率波動(dòng)較大，并隨著啟動(dòng)期的進(jìn)行產(chǎn)氣率逐漸提高并穩(wěn)定。當(dāng)反應(yīng)器進(jìn)入運(yùn)行期，揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)氣率整體處于穩(wěn)定狀態(tài)，在平均值321.14 L·g-1VS (257.60 L·kg-1TS)上下波動(dòng)。平均揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)甲烷率為196.52 L·kg-1VS (157.70 L·kg-1TS)。在反應(yīng)器沼液回流運(yùn)行期內(nèi)，揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)氣率在小幅度波動(dòng)的下整體呈上升趨勢(shì)，在反應(yīng)器運(yùn)行到第96天 時(shí)，揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)氣率達(dá)到最大值502.78 L·kg-1VS (411.95 L·kg-1TS)。整個(gè)沼液回流運(yùn)行期內(nèi)，平均揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)氣率為433.03 L·kg-1VS (366.99 L·kg-1TS)，平均揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)甲烷率為265.18 L·kg-1VS (224.66 L·kg-1TS)，相比未回流沼液的運(yùn)行期的平均產(chǎn)氣率提升42.46%。這些結(jié)果說(shuō)明，沼液回流能夠有效提升反應(yīng)器內(nèi)底物的整體產(chǎn)氣效率。

圖6 每日原料產(chǎn)沼率變化曲線

圖5 每日原料產(chǎn)氣率變化曲線

2.4 原料降解率

圖7和圖8顯示的是牛糞厭氧消化過(guò)程總固體質(zhì)量和揮發(fā)性有機(jī)固體去除效率的變化情況。啟動(dòng)期內(nèi)，反應(yīng)器的出料是啟動(dòng)時(shí)加入的沼液，這個(gè)時(shí)期的原料降解率在圖7～圖8中不能真實(shí)反應(yīng)底物的降解效率。這是由于物料的先進(jìn)先出，只有在經(jīng)過(guò)一個(gè)水力停留期之后，反應(yīng)器的出料才能反映底物的降解程度。隨著反應(yīng)器的啟動(dòng)成功，運(yùn)行期內(nèi)，總固體質(zhì)量的去除率呈大幅度波動(dòng)且有下降趨勢(shì)，在12.45%～51.65%波動(dòng)。平均每日的總固體質(zhì)量的去除率僅為31.15%。然而在進(jìn)料中回流了沼液之后的運(yùn)行期，總固體質(zhì)量的去除率呈小幅的波動(dòng)，但總體呈逐漸上升趨勢(shì)?？偣腆w質(zhì)量的去除率在33.24%～56.76%波動(dòng)，平均每日的總固體質(zhì)量的去除率為47.25%。而且在反應(yīng)器運(yùn)行到第76 天，總固體質(zhì)量的去除率達(dá)到最大值56.76%。相較于未回流沼液的運(yùn)行期，在沼液回流后平均的總固體質(zhì)量的去除率提升16.1%。揮發(fā)性有機(jī)固體去除效率呈現(xiàn)相同的規(guī)律，在無(wú)回流運(yùn)行期平均去除率為31.15%。而在沼液回流運(yùn)行期，平均去除率開(kāi)始提升至48.99%。相較于未回流沼液的運(yùn)行期，揮發(fā)性有機(jī)固體去除效率提高17.84%。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，沼液回流能夠提升底物的降解效率。Chen et al.研究沼液回流對(duì)牛糞厭氧發(fā)酵的影響也得到了沼液回流能夠增加原料利用率，提高厭氧發(fā)酵效率，增強(qiáng)系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定性的結(jié)論[24]。

圖7 每日進(jìn)出料總干物質(zhì)質(zhì)量及去除率

圖8 每日進(jìn)出料總揮發(fā)有機(jī)物質(zhì)量及去除率

2.5 沼液回流運(yùn)行期的微生物群落狀態(tài)

2.5.1 微生物多樣性

對(duì)Miseq測(cè)序所得不同取樣位置樣品的微生物16S rRNA基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果匯總見(jiàn)表 2。從表2可以看出每個(gè)樣品良好的文庫(kù)覆蓋度表明所測(cè)序列量已經(jīng)基本上可以完整反應(yīng)該樣品實(shí)際序列信息。表征豐富度的ACE指數(shù)和 Chao1指數(shù)結(jié)果顯示反應(yīng)器后部的細(xì)菌豐富度要稍高于前部的，而古菌豐富度前部要高于后部的。表征多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)結(jié)果顯示，反應(yīng)器后部的細(xì)菌的多樣性要高于反應(yīng)器前部的，而古菌的多樣性則前后幾乎一樣。

表2 沼液回流運(yùn)行期應(yīng)器不同取樣位置樣品中微生物序列的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.5.2 發(fā)酵料液中細(xì)菌群落組成分析

將細(xì)菌的各菌群豐度占比1%以上的9類菌門(mén)作圖(見(jiàn)圖9，圖10)，從門(mén)的分類水平進(jìn)行分析，反應(yīng)器中無(wú)論前段還是后段擬桿菌門(mén)厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)占比最高，總比例超過(guò)了75%。同時(shí)還有較小比例的互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)，綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)，Parcubacteria門(mén)，變形菌門(mén)(Proteobacteria)以及疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)。同時(shí)在反應(yīng)器的后部還富集了1.12%的螺旋體菌門(mén)(Spirochaetes)。這些細(xì)菌門(mén)均是牛糞厭氧消化體系中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)[6,25]。主要負(fù)責(zé)牛糞的水解酸化等過(guò)程。Li[26]等研究結(jié)果顯示厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是糞便和秸稈共消化過(guò)程主要的水解酸化菌。Paredes-Sabja[27]等報(bào)道厚壁菌門(mén)對(duì)纖維類物質(zhì)的底物有較強(qiáng)的降解能力。另外，李海紅[28]在研究中發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(mén)有降解大分子碳水化合物產(chǎn)酸的功能。這些結(jié)果都表明，在本研究中的，經(jīng)過(guò)沼液回流后的反應(yīng)器中富集了大量的降解牛糞中纖維類物質(zhì)的功能菌群，致使獲得較高的底物轉(zhuǎn)化效率。

圖9 反應(yīng)器在沼液回流運(yùn)行期取樣孔1樣品細(xì)菌在綱水平的分類組成

圖10 反應(yīng)器在沼液回流運(yùn)行期取樣孔2樣品細(xì)菌在綱水平的分類組成

圖11顯示了細(xì)菌在屬水平的組成。在反應(yīng)器的前段和后段中，主要以厚壁菌門(mén)的梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)為主。研究發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等有機(jī)物降解的酶類，它同底物轉(zhuǎn)化成揮發(fā)酸密切相關(guān)。同時(shí)梭菌除水解酸化外，還涉及產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和乙酸氧化過(guò)程[29]。Weimer[30]等發(fā)現(xiàn)Clostridium能夠?qū)⒗w維素和半纖維素等大分子水解成葡萄糖。另外在反應(yīng)器前后段還含有豐度相當(dāng)?shù)腟edimentibacter屬,Proteiniphilum屬,Cloacibacillus屬,Parcubacteria_genera_incertae_sedis屬,Petrimonas屬,Ornatilinea屬,Syntrophomonas屬和Pelotomaculum屬。同時(shí)反應(yīng)器前段相比于反應(yīng)器后段還有一定量的Macellibacteroides屬,Aminivibrio屬和Phascolarctobacterium屬。這些細(xì)菌同樣在參與底物從大分子降解成小分子過(guò)程中起到重要的作用。例如，有文獻(xiàn)報(bào)道Sedimentibacter屬在物質(zhì)從產(chǎn)氫到轉(zhuǎn)化為甲烷的過(guò)程中起到連接的作用[31]。對(duì)于牛糞這種富含大量纖維類物質(zhì)的底物降解是一個(gè)復(fù)雜的代謝過(guò)程，需要多種功能微生物共同參與。而本文的研究結(jié)果顯示，回流沼液后的PFR厭氧反應(yīng)器中富集了優(yōu)勢(shì)的降解牛糞原料為底物的功能微生物，同時(shí)又存在著多種的其他水解酸化微生物進(jìn)行協(xié)同作用共同完成底物的有效降解，繼而獲得較高的產(chǎn)甲烷率。

圖11 反應(yīng)器在沼液回流運(yùn)行期取樣孔1，取樣孔2樣品細(xì)菌在屬水平的分類組成

2.5.3 發(fā)酵料液中古菌群落組成分析

古菌的各菌群豐度在門(mén)的分類水平上分析(見(jiàn)圖12，圖13)，產(chǎn)甲烷作用由一類特殊的微生物—產(chǎn)甲烷菌利用產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段的產(chǎn)物如乙酸，H2/CO2，以及甲酸、甲醇和甲胺類等簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物進(jìn)行產(chǎn)甲烷的過(guò)程[12]。在反應(yīng)器的前段中廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度為 75.32%。隨著底物從前向后推進(jìn)，反應(yīng)器的后段仍以廣古菌門(mén)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度為68.41%。而在反應(yīng)器的前端泉古菌門(mén)(Crenarchaeota)僅有14.16%的豐度，而在反應(yīng)器的后段，泉古菌門(mén)得到了富集，相對(duì)豐度為26.65%。廣古菌門(mén)內(nèi)的成員被發(fā)現(xiàn)是普遍存在多種厭氧反應(yīng)器中主要的產(chǎn)甲烷菌。而泉古菌門(mén)的成員在產(chǎn)甲烷過(guò)程中也起到重要的作用。

圖12 反應(yīng)器在沼液回流運(yùn)行期取樣孔1樣品古菌在綱水平的分類組成

圖13 反應(yīng)器在沼液回流運(yùn)行期取樣孔2樣品古菌在綱水平的分類組成

從圖14古菌屬的分類組成可以得出，在反應(yīng)器的前段和后段的主要產(chǎn)甲烷菌屬為甲烷絲菌屬(Methanothrix)和甲烷螺菌屬(Methanospirillum)以及少量的甲烷桿菌屬(Methanobacterium),甲烷八疊球菌(Methanosarcina)和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)。其中甲烷絲菌屬和甲烷螺菌屬的相對(duì)豐度含量超過(guò)了60%。而且在反應(yīng)器的前部甲烷絲菌屬的相對(duì)豐度要高于反應(yīng)器的后段。甲烷絲菌屬在前部的豐度為40.62%，相較于后部高1.23%。有文獻(xiàn)報(bào)道，甲烷絲菌是目前已知的僅有的兩種僅以乙酸鹽為能量來(lái)源、通過(guò)厭氧代謝生成甲烷而不利用氫氣和二氧化碳的產(chǎn)甲烷菌之一[32]。這主要是因?yàn)镻FR的前端是底物的大量水解酸化的過(guò)程，生成大量的乙酸，因此會(huì)促使乙酸型產(chǎn)甲烷的富集。在底物大量水解為乙酸的同時(shí)，伴隨著氫氣的生成，因此促使了甲烷螺菌這種氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌在系統(tǒng)內(nèi)的富集，它是主要的利用H2和CO2產(chǎn)生甲烷菌屬。然而隨著底物逐步推向出料端，可水解的物質(zhì)多為難降解的大分子物質(zhì)，因此水解過(guò)程逐漸變?nèi)?，同時(shí)水解的產(chǎn)物也復(fù)雜多樣，因此甲烷菌群在以甲烷絲菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群外，另外混合營(yíng)養(yǎng)型的甲烷八疊球菌、以及一些未分類的甲烷菌的豐度在升高，它們同樣在甲烷生成的過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。在專性產(chǎn)甲烷菌處于絕對(duì)主導(dǎo)地位的同時(shí)，含有兼性產(chǎn)甲烷菌，在這些產(chǎn)甲烷菌以及水解菌的共同作用下，使得反應(yīng)器高效穩(wěn)定的運(yùn)行。

圖14 反應(yīng)器在沼液回流運(yùn)行期取樣孔1，取樣孔2樣品古菌在屬水平的分類組成

3 結(jié)論

本研究利用牛糞作為發(fā)酵底物，考察了在PFR反應(yīng)器厭氧消化的過(guò)程中回流50%的沼液對(duì)反應(yīng)器的性能及底物轉(zhuǎn)化效率的影響。在沼液回流后，反應(yīng)器的日產(chǎn)氣量最高達(dá)到57.92 L·d-1，容積產(chǎn)氣率達(dá)到1.61 L·L-1d-1。平均日均產(chǎn)氣量為52.52 L·d-1，平均揮發(fā)性有機(jī)物的產(chǎn)氣率為433.03 L·kg-1VS (366.99 L·kg-1TS)，相比于未回流沼液的運(yùn)行期的平均干物質(zhì)產(chǎn)氣率提升42.46%，且平均甲烷含量為61.20%。同時(shí)在沼液回流運(yùn)行期，底物降解率達(dá)到48.99%。通過(guò)對(duì)微生物群落的分析，細(xì)菌主要以厚壁菌門(mén)的梭狀芽胞桿菌屬和擬桿菌門(mén)的功能菌為主。古菌群落則以甲烷絲菌屬和甲烷螺菌屬為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬?？梢?jiàn)，沼液回流能夠顯著提升牛糞在PFR厭氧消化性能。另外沼液回流還能減少后續(xù)沼液處理量。這一結(jié)論為沼氣工程長(zhǎng)期穩(wěn)定的運(yùn)行提供理論參考。