李樹瑋 趙暘 王華△

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 襄陽 441100；2.錦州醫(yī)科大學(xué)湖北醫(yī)藥學(xué)院襄陽市第一人民醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北 襄陽 441100)

宮頸癌是發(fā)病率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，全球平均每年有53萬新發(fā)宮頸癌病例，宮頸癌總體死亡率達(dá)50%，其中發(fā)展中國(guó)家的宮頸癌死亡率超過85%[1]。因此，尋找宮頸癌的驅(qū)動(dòng)基因、預(yù)后標(biāo)志物及可能的治療靶點(diǎn)是額待解決的重要工作。本課題中我們首先查詢oncomine數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme,UBE2C)在宮頸癌組織中的表達(dá)水平均遠(yuǎn)高于正常組織。接下來我們通過復(fù)習(xí)宮頸癌患者臨床和病理資料，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)UBE2C的在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，探討UBE2C的表達(dá)在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義，旨在尋找宮頸癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)基因、預(yù)后標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1通過 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)篩選出宮頸癌與慢性宮頸炎組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行整合分析，篩選出表達(dá)差異最顯著的基因進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2組織標(biāo)本及相關(guān)資料 收集隨訪資料完整的2010年6月至2018年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院婦科接受宮頸癌根治術(shù)、經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的原發(fā)性CSCC患者石蠟包埋的腫瘤組織標(biāo)本共109例，患者年齡<45歲者57例、≥45歲者52例；分化程度：高分化66例、低分化43例；病理類型：鱗癌89例、腺癌/腺鱗癌20例；腫瘤直徑：≥4 cm 57例、<4 cm 52例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅰb期64例、Ⅱa期45例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陽性48例、陰性61例；宮頸浸潤(rùn)：<1/2者39例、≥1/2者70例。所有患者術(shù)前無化療、放療或其他治療史，臨床分期參照2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO標(biāo)準(zhǔn)，另外收集正常宮頸鱗狀上皮組織標(biāo)本(因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù))117例作為對(duì)照研究。所有患者的臨床資料完整，病理資料由病理科專業(yè)主任醫(yī)師復(fù)習(xí)，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3主要試劑 鼠抗人UBE2C單克隆抗體(美國(guó)abcam公司，工作濃度為1∶500)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.4免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。染色前使用二甲苯常規(guī)脫蠟，然后梯度酒精脫水，抗原微波熱修復(fù)， 3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶， UBE2C(1∶500)一抗4 ℃過夜，聚合酶輔助劑室溫 孵育20 min，辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min， 二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，封片。

1.5結(jié)果判斷 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定：臨床和病理雙盲閱片。UBE2C主要在細(xì)胞核表達(dá)，陽性染色呈黃色或棕黃色。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率計(jì)算染色積分。染色強(qiáng)度：不著色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。陽性細(xì)胞百分率：0%，0分；1%～25%，1分；26%～50%，2分； 51%～75%，3分；76%～100%，4分。兩項(xiàng)相加分值即為每個(gè)視野的染色積分(0～7分)，染色積分0分(-)、1～3分(+)、4～5分(++)和6～7分(+++)，高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)不同視野求平均染色積分。染色積分>3分為高表達(dá)(+)，≤3分為低表達(dá)(-)。晾干的切片可以在顯微鏡下觀察或者采集圖像。

1.6隨訪 隨訪自手術(shù)當(dāng)日起開始計(jì)算生存時(shí)間， 通過門診電話及信訪等方式進(jìn)行隨訪，從確診之日起進(jìn)行隨訪，生存期以年為計(jì)算單位，隨訪時(shí)間為1～12年，中位隨訪時(shí)間為6年，最后一次隨訪時(shí)間2018年8月31日或失訪作為隨訪結(jié)束點(diǎn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，行χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Merier法建立以UBE2C表達(dá)為基礎(chǔ)的宮頸癌的生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線間的差異；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 結(jié)果顯示，UBE2C在宮頸癌組織中的表達(dá)水平均遠(yuǎn)高于正常組織。見圖1。

2.2UBE2C在宮頸癌組織及慢性宮頸炎組織中的表達(dá) UBE2C主要表達(dá)于宮頸鱗癌細(xì)胞胞核，細(xì)胞質(zhì)中少有表達(dá)，陽性染色呈棕黃色至棕褐色顆粒狀(圖2)。UBE2C在慢性宮頸炎組織中(子宮肌瘤行子宮全切后宮頸組織)陽性表達(dá)率為20.51% (24/117)，在宮頸鱗癌組中的陽性表達(dá)率為77.1%(84/109)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=72.33，P<0.01)。見圖2。

2.3UBE2C的表達(dá)與宮頸癌臨床病理因素之間的關(guān)系 以UBE2C低表達(dá)為對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)UBE2C高表達(dá)與宮頸浸潤(rùn)深度(χ2=30.027，P<0.01)、盆腔淋巴結(jié)狀態(tài)(χ2=11.472，P<0.01)、病理類型(χ2=4.786，P<0.05)、5年總生存率(P<0.01)和5年無進(jìn)展生存率 (P<0.01) 密切相關(guān)，而UBE2C高表達(dá)與分化程度以及陰道切緣之間的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 UBE2C陽性表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

2.4UBE2C 表達(dá)水平與宮頸癌診斷及預(yù)后的關(guān)系 UBE2C診斷宮頸癌的ROC曲線如圖 3 所示，AUC 為0.719 (95%CI：0.506～0.733，P=0.039)，生存分析結(jié)果顯示，UBE2C 基因高表達(dá)組患者的生存期明顯低于低表達(dá)組(P<0.05)(圖 4)。

3 討 論

宮頸癌是危及女性健康第二常見的惡性腫瘤。以手術(shù)、放療、化療相結(jié)合的三位一體的綜合治療大大提高了患者的生存率，但每年仍舊有23.3萬人死于宮頸癌，超過100萬的人面臨手術(shù)、放化療帶來的困擾及死亡的威脅[2]。

隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，將生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究與臨床結(jié)合的更為精密[3-4]。因此，本研究擬采用Oncomine 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)UBE2C在宮頸癌組織中的表達(dá)水平均遠(yuǎn)高于正常組織。人泛素偶聯(lián)酶UBE2C 屬于泛素偶聯(lián)酶家族成員之一[5-6]，通過對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等處的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化酶和蛋白酶體的調(diào)控而發(fā)揮作用[7-8]。UBE2C過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要功能蛋白質(zhì)的降解失常，使細(xì)胞染色體組的不穩(wěn)定性增加，提示UBE2C可能是腫瘤發(fā)生的觸發(fā)因子[9-10]。

研究[11]證實(shí)，UBE2C 基因在大多數(shù)正常組織中幾乎很難檢測(cè)到。通過基因表達(dá)譜交互分析(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)數(shù)據(jù)庫查詢 UBE2C基因，結(jié)果顯示在所有人體正常組織中均較少表達(dá)[12]；相反，UBE2C 基因在多種癌癥中高表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等[13-16]。

本研究用免疫組化的方法從臨床標(biāo)本中回顧性研究發(fā)現(xiàn)UBE2C在正常宮頸鱗狀上皮組織中表達(dá)明顯低于宮頸鱗癌中表達(dá)率(P<0.001)。本研究還發(fā)現(xiàn)UBE2C高表達(dá)與宮頸浸潤(rùn)深度、盆腔淋巴結(jié)狀態(tài)、5年總生存率和5年無進(jìn)展生存率密切相關(guān)；而UBE2C高表達(dá)與分化程度以及陰道切緣之間的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UBE2C診斷宮頸癌的ROC曲線AUC 為0.719，這提示我們可以用UBE2C診斷宮頸癌，從而提高檢測(cè)的靈敏度和精確度，為宮頸癌預(yù)防提供新的策略，也為宮頸癌的治療以及后期效果的評(píng)估提供新的依據(jù)。但是UBE2C 基因如何調(diào)控宮頸癌的發(fā)生發(fā)展尚待進(jìn)一步開展相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)行闡述。