李會(huì)濤，黃 濱，劉寶良，劉 濱，王蔚芳

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 2.山東百福生物科技有限公司，山東 濟(jì)寧 273200 )

大蒜素，是大蒜中活性成分的總稱，主要成分為二烯丙基三硫醚，天然存在于百合科植物大蒜的鱗莖中，具有抗菌消炎、驅(qū)蟲殺蟲、誘食促生長(zhǎng)、提高免疫力抗病力等功效，且具有在動(dòng)物體內(nèi)無積存、無耐藥性、無毒性等特點(diǎn)[1]。大蒜素因其存在于廣大民眾的日常生活中，作為飼料添加劑被認(rèn)為是天然無公害的抗生素替代物。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，應(yīng)用大蒜素作為飼料添加劑在淡水魚中開展了廣泛的研究，涉及鯉魚(Cyprinuscarpio)[2]、鯽魚(Carassiusauratus)[3]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[4]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[5]、暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[6]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[7]、羅非魚(Oreochromis)[8]等，研究?jī)?nèi)容涵蓋促生長(zhǎng)[5-7]、提高抗氧化機(jī)能[9]、提高非特異免疫力[3,5,9-10]、改善肌肉品質(zhì)[2,7,9]、防治腸炎病[11]、防治寄生蟲[12-14]等方面。在海水魚方面，僅見大蒜素防治大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腸炎病的生產(chǎn)性試驗(yàn)報(bào)道，其研究結(jié)果指出，大蒜素對(duì)預(yù)防大菱鲆腸炎病有明顯的療效，但對(duì)患病魚的治療效果不明顯[15]。

大菱鲆，是從歐洲引入我國(guó)的海水養(yǎng)殖名貴魚種，現(xiàn)已成為我國(guó)北方工廠化養(yǎng)殖的主要品種之一。然而，伴隨著養(yǎng)殖的快速發(fā)展，一些疾病也隨之而生，腸炎病是其主要病害之一，患病魚死亡率高，損失大[16-18]。為了減少養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗生素的使用，發(fā)展“綠色漁業(yè)”，筆者以大蒜素為研究對(duì)象，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，將其拌入飼料(黏性大蒜素主要應(yīng)用途徑是拌入飼料中)，研究其對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)、免疫力及抗病力的影響，以替代或減少抗生素的使用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與養(yǎng)殖管理

在山東省萊州市朱由養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行生產(chǎn)性的工廠化流水養(yǎng)殖試驗(yàn)，隨機(jī)選取15個(gè)規(guī)格為5.0 m×5.0 m×0.6 m的水泥養(yǎng)殖池，每池放養(yǎng)3600尾大菱鲆幼魚(采購(gòu)魚苗時(shí)按照數(shù)量投放)，為當(dāng)年孵化的同一批魚苗，規(guī)格勻稱，平均體質(zhì)量為(8.12±0.03) g(全池稱量計(jì)算)。

黏性大蒜素購(gòu)自北京漁經(jīng)生物技術(shù)有限公司，其中二烯丙基三硫醚含量為60%。大菱鲆商業(yè)配合飼料購(gòu)自青島七好營(yíng)養(yǎng)科技有限公司，水分含量10%，粗蛋白含量52%，粗脂肪含量10.5%，粗灰分8.1%。試驗(yàn)共分為5組，每組設(shè)3個(gè)平行，大蒜素的添加量為0(對(duì)照)、100、200、400、800 mg/kg，計(jì)算好飼料用量后，稱取大蒜素(以二烯丙基三硫醚含量計(jì)算)拌入飼料中即刻進(jìn)行投喂，進(jìn)行為期6周的養(yǎng)殖試驗(yàn)。因大菱鲆為搶食性魚類，飼料投入水體后即刻會(huì)被搶食，因此維持均勻的投餌速度可以保證餌料在入水的同時(shí)被魚攝食，避免拌入飼料中的大蒜素流失到水體中。

養(yǎng)殖期間，日投喂率為大菱鲆體質(zhì)量的1.5%，每日平均分3次(6:00、12:00和18:00)投喂，每周進(jìn)行1次抽樣檢測(cè)體質(zhì)量(每池魚隨機(jī)抽樣10次，每次撈取20尾魚，稱量質(zhì)量，計(jì)算平均體質(zhì)量)，及時(shí)調(diào)整投餌量。投喂前停水，投喂2 h后恢復(fù)流水，記錄每池魚的死亡數(shù)。試驗(yàn)期間，水流速5 L/min，水溫13～15 ℃，溶解氧>6 mg/L，鹽度30。

1.2 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，饑餓24 h后，全池稱量質(zhì)量。隨后每池隨機(jī)挑選10尾魚，自其尾靜脈采血，室溫下靜置1 h后于冰箱4 ℃保存過夜，次日離心(5000 r/min，4 ℃，30 min)分離血清，分裝并于冰箱-80 ℃保存待用。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

血清中補(bǔ)體C3含量、溶菌酶和超氧化物歧化酶活性分別采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法、比濁法和黃嘌呤氧化酶法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定所用的試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。

1.4 攻毒感染試驗(yàn)

攻毒感染試驗(yàn)用菌株為鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，菌株來自中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院[19]。鰻弧菌接種在2216E固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，用滅菌生理鹽水洗下，稀釋成108cfu/mL的活菌液，置于冰箱4 ℃待用。

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每池隨機(jī)挑選20尾魚，分別放在預(yù)先準(zhǔn)備好的58 cm×47 cm×33 cm泡沫箱中進(jìn)行攻毒感染試驗(yàn)，泡沫箱中水體的體積為60 L。每尾魚腹腔注射0.1 mL的活菌液后，連續(xù)觀察14 d，統(tǒng)計(jì)感染死亡率。攻毒期間正常投喂，每次投餌2 h后整箱換水，氣石充氧，記錄死亡數(shù)量。

1.5 計(jì)算公式

特定生長(zhǎng)率/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

存活率/%=nt/n0×100%

餌料系數(shù)=F/n1/(mt-m0)

感染死亡率/%=n2/n×100%

式中，m0為初始平均體質(zhì)量(g)，mt為終末平均體質(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)時(shí)間(d)，n0為初始魚數(shù)量(尾)，nt為終末魚數(shù)量(尾)，F(xiàn)為總投餌量(g)，n1為存活魚數(shù)量(尾)，n2為感染死亡魚數(shù)量(尾)，n為試驗(yàn)魚數(shù)量(尾)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)總體方差差異顯著時(shí)(P<0.05)，則進(jìn)行Tukey多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)的影響

大菱鲆幼魚的特定生長(zhǎng)率隨著飼料中大蒜素含量的增加而逐漸升高(表1)，并在大蒜素添加量為200 mg/kg及以上時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組的幼魚存活率顯著低于添加組(P<0.05)。飼料系數(shù)隨著大蒜素含量的增加而逐漸降低，并在大蒜素添加量為100 mg/kg及以上時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但在200 mg/kg及以上時(shí)保持穩(wěn)定。

2.2 大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚相關(guān)免疫指標(biāo)的影響

大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚非特異性免疫指標(biāo)的影響見圖1～3。血清補(bǔ)體C3含量隨著大蒜素含量的增加呈先升后降的趨勢(shì)，在200、400 mg/kg組達(dá)到最大值并顯著高于其他各組(P<0.05)。溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力則隨著大蒜素含量的增加而逐漸升高，并在大蒜素含量達(dá)到400 mg/kg及以上時(shí)不再有顯著變化(P>0.05)。

圖1 飼料中不同含量的大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚血清中補(bǔ)體C3含量的影響

圖2 飼料中不同含量的大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚血清中溶菌酶活力的影響

2.3 大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚抗病力的影響

大菱鲆人工感染試驗(yàn)表明，感染死亡率隨著飼料中大蒜素含量的增加而逐漸降低，并在攝食大蒜素含量為400、800 mg/kg時(shí)顯著低于其他各組(P<0.05)，但400、800 mg/kg組間差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖3 飼料中不同含量的大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚血清中超氧化物歧化酶活力的影響

圖4 飼喂不同含量大蒜素的大菱鲆幼魚經(jīng)攻毒后的感染死亡率

3 討 論

3.1 大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚生長(zhǎng)的影響

大蒜素作為一種安全的飼料添加劑，其味道可刺激動(dòng)物的嗅覺和味覺，提高動(dòng)物食欲，增加攝食量，促進(jìn)生長(zhǎng)。大蒜素對(duì)淡水魚類的促生長(zhǎng)作用研究較多，如鯉魚[2]、草魚[4]、虹鱒[5]、團(tuán)頭魴[7]、羅非魚[8]等，但海水魚的相關(guān)報(bào)道較少。本研究表明，飼料中添加大蒜素有利于大菱鲆幼魚的生長(zhǎng)，提高其成活率，并降低飼料效率，適宜的添加量為200 mg/kg。試驗(yàn)結(jié)果與淡水魚一致，并符合大菱鲆生產(chǎn)性試驗(yàn)結(jié)果[15]，但卻在大蒜素的應(yīng)用劑量上存在差異。飼料中大蒜素含量在15～100 mg/kg間可以促進(jìn)鯉魚、虹鱒、團(tuán)頭魴、羅非魚等生長(zhǎng)。在大菱鲆生產(chǎn)性試驗(yàn)中，則以25 kg冰鮮雜魚加24.75 kg大菱鲆專用粉末料再加0.25 kg大蒜素，攪拌均勻加工成餌料投喂以促進(jìn)其生長(zhǎng)[15]。本試驗(yàn)是在生產(chǎn)性的工廠化流水養(yǎng)殖條件下進(jìn)行的，這也是我國(guó)北方沿海養(yǎng)殖大菱鲆的常見模式，其養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖管理等與前述精細(xì)的養(yǎng)殖試驗(yàn)大為不同，這可能是導(dǎo)致劑量差異的一個(gè)原因。此外，應(yīng)用大蒜素作為飼料添加劑在海水魚中開展的研究比較少，無法參考比較海水魚和淡水魚對(duì)大蒜素的需求量差異。因此，大蒜素應(yīng)用劑量的差異可能受到了多種因素的影響，包括魚種、試驗(yàn)魚大小、飼養(yǎng)環(huán)境、大蒜素有效含量等。今后需結(jié)合實(shí)際應(yīng)用大蒜素進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)和養(yǎng)殖生產(chǎn)，并開展更多的海水魚相關(guān)應(yīng)用研究，為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用大蒜素提供依據(jù)，為綠色養(yǎng)殖提供借鑒。

3.2 大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚非特異性免疫力的影響

魚類是低等的脊椎動(dòng)物，其特異性免疫機(jī)制尚不完善，因此，非特異性免疫在其防御體系中發(fā)揮重要的作用。補(bǔ)體系統(tǒng)是魚體非特異免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最多的成分，能夠發(fā)揮溶菌殺菌、免疫調(diào)節(jié)、免疫復(fù)合物溶解和清除等生物學(xué)功效，在魚類抵抗微生物感染過程中扮演重要角色[20-21]。本研究中，血清補(bǔ)體C3含量在400 mg/kg組達(dá)到峰值，進(jìn)一步增加大蒜素含量反而顯著降低補(bǔ)體C3含量，但仍顯著高于對(duì)照組。這與鯽魚[3]的研究結(jié)果相似，飼料中添加250 mg/kg大蒜素能顯著提高其血清中補(bǔ)體C3含量，而500 mg/kg大蒜素則顯著抑制其含量，并且顯著低于對(duì)照組。筆者推測(cè)，這可能與高劑量大蒜素會(huì)影響炎性細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用有關(guān)，在鯽魚[3]的研究中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)500 mg/kg大蒜素組鯽魚在改投喂不含大蒜素的基礎(chǔ)飼料后，其補(bǔ)體C3含量升高并恢復(fù)到對(duì)照組水平。因此，大蒜素的劑量、動(dòng)物種類等會(huì)影響補(bǔ)體C3的合成。

溶菌酶廣泛存在于生物的黏液、血清和吞噬細(xì)胞的溶酶體顆粒中，能水解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁，使內(nèi)容物逸出進(jìn)而起到殺菌作用[22]，其活性在一定程度上能反映魚的非特異性免疫狀態(tài)。Fernandez-Trujillo等[23]指出，魚類的溶菌酶活性遠(yuǎn)強(qiáng)于高等脊椎動(dòng)物。在本試驗(yàn)中，血清溶菌酶活力隨著大蒜素含量的增加而顯著升高，并在大蒜素含量達(dá)到400 mg/kg時(shí)不再有顯著變化。結(jié)果與淡水魚類的研究一致，即飼料中添加大蒜素均能提高暗紋東方鲀、草魚、鏡鯉、虹鱒等淡水魚的溶菌酶活力[5,6,9,24]?？凳珂碌萚3]報(bào)道指出，停喂大蒜素后，鯽魚體內(nèi)溶菌酶活性在一段時(shí)間內(nèi)仍然保持較高水平。因此，大蒜素能夠增強(qiáng)魚類溶菌酶活性，提高魚類非特異性免疫能力，究其原因可能與大蒜素可激活組織中吞噬細(xì)胞的分泌功能有關(guān)，從而促進(jìn)溶菌酶大量釋放[25]。

超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)抗氧化酶系的重要酶類，是體內(nèi)以活性氧自由基為底物的酶類和自由基連鎖反應(yīng)的阻斷劑，檢測(cè)抗氧化指標(biāo)可以反映機(jī)體的抗氧化能力和免疫狀態(tài)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，血清超氧化物歧化酶活力隨大蒜素含量的增加而顯著升高并在大蒜素含量達(dá)到400 mg/kg時(shí)不再有顯著變化。李嬋等[5]報(bào)道，飼料中添加大蒜素能夠增加虹鱒腎臟、肝臟和血漿中超氧化物歧化酶活力。徐奇友等[9]對(duì)鏡鯉的研究表明，飼料中添加大蒜素增加了肝胰臟超氧化物歧化酶活力，但卻降低了血清中超氧化物歧化酶活力。超氧化物歧化酶活力在組織間的差異說明大蒜素的作用效果因魚種、組織等因素而不同。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中至少添加400 mg/kg的大蒜素能夠更有效提高大菱鲆幼魚的特異性免疫力，大蒜素的應(yīng)用劑量也高于淡水魚[3]。此外，相關(guān)研究報(bào)道指出，大蒜素能夠提高魚、蝦的非特異性免疫基因表達(dá)[26-27]。因此，今后可考慮進(jìn)一步從細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因等水平研究大蒜素的作用機(jī)制，并利用體內(nèi)和體外試驗(yàn)的對(duì)比研究來探討其作用機(jī)制，為進(jìn)一步利用大蒜素提供參考。

3.3 大蒜素對(duì)大菱鲆幼魚抗病力的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證大蒜素在提高大菱鲆幼魚機(jī)體非特異性免疫力基礎(chǔ)上是否能夠抵抗病害，在養(yǎng)殖結(jié)束時(shí)對(duì)大菱鲆幼魚進(jìn)行了人工細(xì)菌感染試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攝食大蒜素含量為400、800 mg/kg時(shí)，大菱鲆的感染死亡率顯著低于其他各組。說明飼料中至少添加400 mg/kg的大蒜素能夠顯著提高大菱鲆幼魚抗腸炎病的能力。相關(guān)研究報(bào)道也指出，大蒜素可以預(yù)防魚類的寄生蟲和細(xì)菌性疾病[12-14]，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。日后，進(jìn)一步應(yīng)用大蒜素防控魚病值得繼續(xù)研究和深入探討。

4 結(jié) 論

本研究表明，飼料中至少添加200 mg/kg的大蒜素有利于大菱鲆幼魚的生長(zhǎng)，而400 mg/kg的大蒜素能夠更有效地提高其免疫力及對(duì)抗腸炎病的能力。