袁善奎，單煒力，周艷明，周欣欣，陳 朗

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

自2014年GB/T 31270《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》系列國家標(biāo)準(zhǔn)[1]發(fā)布以來，我國農(nóng)藥環(huán)境安全性測試相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法每年均以10項左右的速度增長。截止2019年9月，已制定用于農(nóng)藥登記的環(huán)境安全性測試標(biāo)準(zhǔn)試驗方法相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)47項，其中：環(huán)境歸趨類15項、生態(tài)毒理學(xué)類32項，已初步形成較為完善的標(biāo)準(zhǔn)方法體系，基本覆蓋現(xiàn)行《農(nóng)藥登記資料要求》[2]中的農(nóng)藥環(huán)境影響試驗項目，成為農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險評估體系的重要技術(shù)支撐。不同類型的環(huán)境生物及土壤試材是農(nóng)藥環(huán)境影響試驗中的基本試材。生物試材及土壤試材的質(zhì)量是獲得科學(xué)、可靠試驗數(shù)據(jù)的重要因素。不同實驗室間試驗試材的來源、飼育與培養(yǎng)設(shè)施、培養(yǎng)方法與環(huán)境等是否一致關(guān)系著數(shù)據(jù)的可重復(fù)性與可比性。歐洲實驗室動物科學(xué)協(xié)會聯(lián)合會于2007年專門發(fā)布了針對用于標(biāo)準(zhǔn)化測試和其他科學(xué)研究目的的動物飼育管理指南[3]。我國目前在農(nóng)藥環(huán)境影響試驗試材管理方面尚處于起步階段。

本文歸納總結(jié)了國內(nèi)外農(nóng)藥環(huán)境影響試驗準(zhǔn)則中對試驗試材的要求，并針對我國農(nóng)藥登記環(huán)境影響資料要求涉及的土壤試材和11類生物試材在國內(nèi)各相關(guān)實驗室的使用情況進行了調(diào)研，旨在分析農(nóng)藥環(huán)境影響試驗試材使用中存在的問題并提出解決方案，進一步提高生物試材和土壤試材的規(guī)范化水平，提高農(nóng)藥環(huán)境影響試驗數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

1 國內(nèi)外農(nóng)藥環(huán)境影響試驗試材基本要求

1.1 生物試材及其規(guī)范化要求 現(xiàn)行《農(nóng)藥登記資料要求》[3]中，生態(tài)毒理學(xué)試驗資料涉及鳥類、魚類、蜜蜂、家蠶、大型溞、綠藻、蚯蚓、赤眼蜂、瓢蟲、浮萍、穗狀狐尾藻等11個生物類型。在測試生物數(shù)量方面，由于現(xiàn)階段生態(tài)保護目標(biāo)的差異，我國要求測試的生物類型及測試物種均少于美國[4]及歐盟[5]的要求，比如暫未規(guī)定對底棲生物、海洋生物影響的資料要求，對魚類和鳥類的測試種類數(shù)量也相對較少。在測試物種方面，除中國特有生物物種(如家蠶)和部分天敵生物(如赤眼蜂)，魚類、鳥類、蜜蜂、蚯蚓、大型溞、綠藻等試材在物種方面國內(nèi)外要求基本一致。

客觀上，由于生態(tài)毒理學(xué)試驗涉及的生物試材種類多、個體小、繁殖快、部分品種貯存與運輸困難，在規(guī)范化管理方面不易像毒理試驗中類似小白鼠等試驗動物這樣進行標(biāo)準(zhǔn)化管理。為了提高試驗數(shù)據(jù)的可靠性、可比性和重復(fù)性，試驗準(zhǔn)則中[1，6]通常對試驗生物的健康狀況、體重、體長、雌雄比例(如鵪鶉)、生長季節(jié)(如蜜蜂)以及培養(yǎng)條件等進行規(guī)定。生物試材健康狀況良好，前述指標(biāo)在相關(guān)試驗準(zhǔn)則規(guī)定的范圍之內(nèi)，則理論上認(rèn)為其合乎要求。此外，OECD和國內(nèi)的試驗準(zhǔn)則[1，6]大多還規(guī)定了周期性參比物試驗作為質(zhì)控要求。例如，以重鉻酸鉀作為參比物，要求其對斑馬魚24h急性毒性LC50在200～400 mg/L之間，對大型溞24h急性毒性EC50在0.6～2.1 mg/L之間；以樂果作為參比物，其對蜜蜂48h急性經(jīng)口毒性LD50應(yīng)在0.20～0.30 μg/蜂之間，48h急性接觸毒性LD50應(yīng)在0.20～0.35 μg/蜂之間，0.2 g/ha施用量條件下對七星瓢蟲的急性致死率應(yīng)在40%～80%之間；以氯乙酰胺為參比物，對蚯蚓的14d急性毒性LC50應(yīng)在20～80 mg a.i./kg干土范圍內(nèi)。除上述試驗項目外，目前尚有10余個生態(tài)毒理試驗標(biāo)準(zhǔn)未推薦參比物，或未明確參比物的毒性終點范圍。國內(nèi)制定的意大利蜜蜂幼蟲發(fā)育試驗準(zhǔn)則中，推薦了樂果和苯氧威作為參比物，家蠶試驗也推薦了樂果作為參比物，但未給出可參考的參比物毒性范圍。

1.2 土壤試材及其規(guī)范化要求 OECD系列試驗準(zhǔn)則[6]中，土壤降解試驗要求土壤質(zhì)地為砂質(zhì)壤土、粉壤土、壤土或壤質(zhì)砂土；pH范圍為5.5～8.0；土壤有機碳含量為0.5%～2.5%；微生物量>總有機碳的1%。土壤吸附和土壤淋溶試驗對土壤的要求(表1、表2)。土壤表面光解試驗(草案)要求使用粉壤土或粘壤土。歐盟農(nóng)藥原藥資料要求(EC 283/2013)[5]中規(guī)定:用于降解、吸附/解吸附或遷移研究的供試土壤應(yīng)具有代表性，在有機碳含量、粒徑分布和pH方面具有一定差異；當(dāng)降解或遷移可能與pH有關(guān)時，供試土壤應(yīng)涵蓋特定的pH范圍(5～6、6～7、7～8)。

表1 OECD土壤吸附試驗準(zhǔn)則對土壤的要求[6]

表2 OECD土壤淋溶試驗準(zhǔn)則對土壤的要求[6]

美國EPA制定的環(huán)境歸趨試驗報告評審指南[7]中規(guī)定：土壤代謝試驗應(yīng)使用4種能代表農(nóng)藥使用區(qū)域的土壤，有機碳含量、pH、粘粒含量和微生物量應(yīng)有一定差異。土壤吸附試驗至少使用5種農(nóng)藥使用區(qū)域的代表性土壤或沉積物。其中一種土壤的有機質(zhì)含量低于1%。

我國現(xiàn)行《農(nóng)藥登記資料要求》[2]中，土壤好氧代謝、厭氧代謝、表面光解、吸附、淋溶試驗，以及農(nóng)藥在土壤中的分析方法與驗證等6項環(huán)境歸趨測試以及土壤微生物毒性測試需要使用土壤試材。根據(jù)GB/T 31270[1]，土壤降解試驗、表面光解試驗、吸附試驗、淋溶試驗和微生物毒性試驗等5個試驗均要求使用天然土壤，推薦使用紅壤土、水稻土、黑土、潮土、褐土等5類土壤。具體土壤類型及其理化性質(zhì)要求(表3)。

表3 我國農(nóng)藥登記環(huán)境歸趨試驗準(zhǔn)則對土壤的要求[1]

總體而言，有機碳含量、pH、粘粒含量和微生物量等4個土壤參數(shù)是影響試驗測定結(jié)果的重要因素，但由于微生物量的控制較難，國外的試驗準(zhǔn)則主要基于前3個因素進行規(guī)定，并要求試驗選擇的不同類型的土壤應(yīng)體現(xiàn)這3個因素的差異。歸納起來，OECD準(zhǔn)則中上述因素的取值范圍為：pH，(<4.0)～(>7.5)；有機質(zhì)含量，(<0.5%)～(>10%)；粘粒含量，(<10%)～ 80%。

2 我國農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗試材使用現(xiàn)狀

2.1 生物試材 我國農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗中常用的生物試材有11類25種[2]。對25家實驗室的問卷調(diào)查結(jié)果表明，除鳥類(日本鵪鶉)、蜜蜂(意大利蜜蜂)、溞類(大型溞)、穗狀狐尾藻、蚯蚓(赤子愛勝蚓)、捕食性天敵(七星瓢蟲)采用統(tǒng)一物種外，其他生物類別各實驗室采用的物種均有所不同。其中，魚類主要采用斑馬魚，占90%以上，其他測試物種包括鯉魚、虹鱒魚、稀有鮈鯽、日本青鳉等；淡水綠藻主要采用羊角月牙藻，其次為斜生柵列藻，少數(shù)使用普通小球藻；浮萍主要采用紫背浮萍(占64%)，其次是小浮萍，個別采用圓瘤浮萍；家蠶以菁松×皓月蠶種為主(占67%)，部分實驗室采用了春蕾×鎮(zhèn)珠、蘇菊×明虎等其他具有代表性的蠶種；寄生性天敵主要采用玉米螟赤眼蜂(占74%)，少數(shù)采用松毛蟲赤眼蜂、擬澳洲赤眼蜂、舟螟赤眼蜂、螟黃赤眼蜂等。

各實驗室試材來源渠道差異也較大，導(dǎo)致生物試材的生物學(xué)背景信息相差較大。大型溞、綠藻、浮萍、穗狀狐尾藻、蜜蜂、蚯蚓、瓢蟲、赤眼蜂及少數(shù)實驗室的斑馬魚等主要是通過外部引種后在實驗室內(nèi)自行擴繁；鳥類、魚類、家蠶等繁殖周期相對較長的試材通常為直接購買，驗收合格后用于試驗。具備資質(zhì)的專業(yè)的試材提供機構(gòu)通常能夠為實驗室出具試材品系證書，并提供詳細(xì)的培養(yǎng)過程，例如，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻類庫?？蒲袉挝换虼笮宛B(yǎng)殖機構(gòu)所提供的試材品種信息較為可靠，但無法提供品系證書，這是目前大多數(shù)外購試材的供應(yīng)渠道，例如，從中國農(nóng)科院植保所購買赤眼蜂和瓢蟲卵卡等。而從市場或者網(wǎng)絡(luò)購買的試材則生物學(xué)信息可靠性較差，例如，部分單位從市場上購買觀賞斑馬魚用于試驗、從天貓商城購買七星瓢蟲卵卡用于試驗。還有部分實驗室直接從野外采集試材，例如穗狀狐尾藻、瓢蟲、浮萍等，經(jīng)純化后在實驗室內(nèi)進行擴繁和試驗。此外，還存在實驗室之間相互提供試材的情況，例如大型溞、綠藻、瓢蟲等。

生物試材的價格也在一定程度上反映了試材的質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)的生物試材價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于市場上普通流通的試材，但不同地區(qū)、不同供貨機構(gòu)的價格客觀上也存在差異。

2.2 土壤試材 GB/T 31270[1]規(guī)定的紅壤、水稻土、黑土、潮土、褐土均屬于《中國土種志》[8]中耕型面積排前十的土類目前，國內(nèi)環(huán)境歸趨實驗室所采用的土壤試材基本都是實驗室間相互提供或委托其他單位采集，并委托專業(yè)機構(gòu)或自行進行理化參數(shù)測定。

3 試材規(guī)范化管理中存在的問題

3.1 生物試材 首先，大多數(shù)生物試材遺傳背景不清楚。從調(diào)查情況來看，各實驗室的生物試材來源渠道多樣化，僅少數(shù)生物試材有相關(guān)證書。這可能導(dǎo)致試驗數(shù)據(jù)的可比性和可重復(fù)性較差。例如，部分市場上的斑馬魚品種可能是為了增強觀賞價值而改造的雜交品種。

其次，一部分生態(tài)毒理學(xué)試驗尚未建立參比物測試方法。目前國內(nèi)現(xiàn)行生態(tài)毒性試驗準(zhǔn)則中僅有9個試驗推薦了參比物及其毒性終點范圍。其余試驗尚未建立參比物試驗方法，或推薦了參比物但缺少可參考的毒性終點范圍，從而無法對生物試材的質(zhì)量進行檢驗。

再次，缺少統(tǒng)一的生物試材培養(yǎng)方法指南。雖然現(xiàn)有的生態(tài)毒理學(xué)測試準(zhǔn)則中分別描述了各自使用的生物試材培養(yǎng)條件，但對培養(yǎng)的具體細(xì)節(jié)，尤其是對試材的健康檢驗檢查方面規(guī)定較少，客觀上造成了生物試材在不同實驗室內(nèi)的馴養(yǎng)條件差異較大，進而影響實驗室間毒性測試結(jié)果的可比性。

最后，對本土物種方面的研究和探索仍有待加強。從國內(nèi)現(xiàn)有試驗準(zhǔn)則和調(diào)研情況來看，雖然測試的生物物種與OECD準(zhǔn)則一致有利于未來推進政府間的數(shù)據(jù)互認(rèn)，但進行農(nóng)藥高級階段的環(huán)境風(fēng)險評估過程中，例如開展物種敏感性分布(SSD)測試時，應(yīng)增加本土物種的測試，以進一步明確農(nóng)藥在我國特定環(huán)境和場景下使用時的實際風(fēng)險。但是，從各實驗室目前飼養(yǎng)的生物試材種類來看，本土物種的儲備較少，不利于開展該類試驗。

3.2 土壤試材 首先，土壤類型缺少權(quán)威鑒定機構(gòu)。GB/T 31270[1]推薦的土壤是按GB/T 17296《中國土壤分類與代碼》[9]中的土類進行分類，目前尚無可出具檢測報告的有資質(zhì)單位，主要依靠專家個人經(jīng)驗判斷。其次，現(xiàn)有準(zhǔn)則未對土壤的機械組成指標(biāo)進行規(guī)定。按GB/T 17296[9]，同一土類中又分為若干亞類、土屬、土種，其土壤理化性質(zhì)會有差異。例如，不同成土母質(zhì)的紅壤的機械組成會存在顯著差異，而GB/T 31270[1]僅規(guī)定了土壤有機質(zhì)含量和pH，未規(guī)定土壤機械組成方面的要求。最后， GB/T 31270[1]中對土壤的個別指標(biāo)規(guī)定與我國典型土壤實際指標(biāo)不一致(例如，規(guī)定黑土有機質(zhì)含量為2%～3%，而黑土實際中有機質(zhì)含量一般均高于3%)，造成實際試驗過程中很難獲得在土壤類型和理化性質(zhì)參數(shù)方面均滿足準(zhǔn)則要求的樣品，導(dǎo)致各實驗室土壤樣品使用隨意、試驗結(jié)果可重復(fù)性差。此外，土壤理化參數(shù)的差異變化范圍太窄，不能全面反映不同pH和有機質(zhì)含量對農(nóng)藥環(huán)境歸趨行為的影響。

4 解決措施和建議

首先，應(yīng)規(guī)范或統(tǒng)一試材來源渠道。一是對各農(nóng)藥登記環(huán)境影響實驗室的生物試材引種提出遺傳背景方面的規(guī)范化要求；二是可行時，針對部分試材建立統(tǒng)一的供應(yīng)渠道，由有資質(zhì)的試材供應(yīng)單位提供試材，例如土壤試材，選擇符合要求的采樣位點作為固定地點，統(tǒng)一采樣供應(yīng)給實驗室，并提供理化參數(shù)證明。

其次，加強試驗試材的規(guī)范化研究。一是加快部分生態(tài)毒理學(xué)試驗的參比物測試方法研究，確定參比物種類及其毒性終點參考范圍；二是豐富測試物種，加強對底棲生物、海洋生物等的敏感性、試材培養(yǎng)與規(guī)范化研究，并積極探索典型本土物種的規(guī)范化飼養(yǎng)。

最后，繼續(xù)完善農(nóng)藥環(huán)境影響試驗方法體系。一是修訂現(xiàn)有試驗準(zhǔn)則，完善參比物試驗要求，參考國外經(jīng)驗修改土壤參數(shù)要求(僅要求所選擇的土壤能代表生產(chǎn)上的主要土壤類型，體現(xiàn)不同土壤在有機碳含量、pH、粘粒含量等參數(shù)方面的差異，而不應(yīng)將土壤類型與具體參數(shù)值相關(guān)聯(lián))等；二是加快制定生物試材規(guī)范化飼養(yǎng)與管理標(biāo)準(zhǔn)；三是必要時，針對新的保護物種(包括本土生物)，開發(fā)與建立標(biāo)準(zhǔn)化的毒性測試方法。