◆作者：林茂發(fā)

隨著畜禽和水產養(yǎng)殖業(yè)的日益工廠化和工業(yè)化，對配合飼料的質量要求不斷提高，優(yōu)質的配合飼料是養(yǎng)殖業(yè)取得成功的基礎，也是養(yǎng)殖企業(yè)為社會提供綠色安全肉類產品的基本保證。因此，生產出安全、高效、環(huán)保無公害的配合飼料是飼料生產企業(yè)的目標，飼料添加劑作為配合飼料的重要組成之一，對配合飼料的質量有重要的影響，在營養(yǎng)成分相當的條件下，合理使用添加劑可以改善配合飼料的適口性、增強誘食性、增強養(yǎng)殖動物的免疫力，減少抗生素等藥物的使用，實現養(yǎng)防結合，提高配合飼料的轉化率。

飼料添加劑開發(fā)技術經過多年的發(fā)展，尤其是中醫(yī)中藥學理論在飼料添加劑生產實踐的應用，大量以中草藥或者植物提取物為主要活性成分的綠色、高效的功能型飼料添加劑被開發(fā)出來并投入飼料加工及養(yǎng)殖中。養(yǎng)殖實踐證明，采用中藥或植物提取物作為飼料添加劑不會對動物體產生毒害和殘留，長期拌料喂養(yǎng)可以提高免疫力，促進畜禽和魚類生長，改善肉產品的品質，是理想的抗生素等獸藥的替代品。飼料添加劑的類型也由單一的成分向多種有效成分混合型的飼料添加劑發(fā)展，相對于市場上種類繁多的飼料添加劑產品，質量監(jiān)管部門提供的檢測方法顯得有些不足，這給飼料添加劑質量監(jiān)管帶來許多不便，因此有必要對各種新型飼料添加劑的檢測方法進行開發(fā)和研究。

本實驗研究對象為以山蒼子（Litsea cubeba）鮮果為原料提取出的山蒼子油（Litsea cubeba oil）為主要活性物，以碳酸氫鈣為載體，以大豆油（或其他同類型植物油）為稀釋劑按照一定比例混合均勻而成的飼料添加劑。山蒼子果油是一種天然植物精油，在日化、食品、醫(yī)藥、生物農藥等方面有著廣泛的應用。山蒼子果油具有對大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌等具有中、高度抑制作用，對多種真菌具有抑制作用且能降解黃曲霉素同時具有溫暖脾腎及健胃消食的功能，用作飼料添加劑可以治療動物的某些疾病，增強動物的免疫力，提高配合飼料的轉化率，且能改善畜禽和魚類的肉品質，是農業(yè)部《飼料添加劑使用目錄（2013）》允許使用的飼料添加劑之一。山蒼子果油組成較為復雜目前已發(fā)現的有20多種，其主要成分為檸檬醛（橙花醛和香葉醛）、檸檬烯、甲基庚烯酮等。對山蒼子果油的組成及其活性物的作用，國內學者已經開展了一定的研究，但對山蒼子果油作為飼料添加劑的應用方面研究成果比較少，主要是集中在山蒼子油防霉抑菌應用方面，對山蒼子果油作為飼料添加劑的檢測方法尚未見文獻報導。本研究開發(fā)出氣相色譜法(GC-FID) 檢測山蒼子果油飼料添加劑中的特征組分甲基庚烯酮（cas no 110-93-0）、檸檬烯（cas no 5989-27-5）、橙花醛(cas no 141-27-5)、香葉醛 (cas no 5392-40-5)（各化合物的分子結構式見圖1）。并對目標化合物采用氣相色譜串聯質譜法（GC/MS）進行確證。實驗表明該方法準確快捷，可以用于山蒼子果油混合飼料添加劑的檢測。

圖1 本實驗目標化合物的分子結構式

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

氣相色譜儀帶自動進樣系統聯FID檢測器及配套工作站（日本SHIMADZU 公司），石英毛細管柱（ZB-5，30m×0.32mm×0.25μm），美國Agilent 公司。6890N/5975N氣相色譜－質譜聯用儀，美國Agilent 公司；ZB-5MS 石英毛細柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美國Agilent 公司.BT224S分析天平，德國 Sartorius公司；XH－B 旋渦混均器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；調速多用振蕩器（上海永研超聲設備有限公司），高速冷凍離心機（美國 BeckmanCoulter 公司），10mL 具塞玻璃比色管，50mL具塞塑料離心管。

1.2 材料與試劑

乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈均為分析純，甲基庚烯酮標準品純度大于99.0%，D- 檸檬烯標準品純度大于98%，橙花醛標準品純度大于98%，香葉醛標準品純度大于98%,以上4 種標準品均購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司。稱取一定量的標準品，用乙酸乙酯溶解轉移到容量瓶中，并逐級稀釋成實驗所需的濃度，再配制成相應濃度的混標。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

進樣口溫度：250 ℃；色譜柱升溫程序：50 ℃保留 2 min，10 ℃/min 升至 150 ℃，20℃ /min 升至250 ℃保留 2min。檢測器（FID）溫度：280℃；載氣；氮氣（純度不小于99.999%）；燃氣；氫氣（純度不小于99.99%）；空氣（壓縮空氣）；氣體流量：柱流量，2.0 mL/min；氫氣 40 mL/min；空氣，400 mL/min；尾吹氣，30 mL/min；進樣量：1μL；分流比：30∶1。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取樣品1g（精確到0.0001g），置于塑料離心管中，加入4mL 乙酸乙酯渦旋混勻后，在調速振蕩器上以120 次/min 條件下振搖提取 5min, 經過5000r/min 離心3min 后，吸取上清液于具塞刻度管中，重復上述實驗一遍，再加入2mL 無水乙醇按照上述步驟操作一遍。定容到10mL，搖勻，在-18℃條件下速凍 1 小時，過 0.45μm 有機相濾膜后，上機測定。

1.3.3 測定

在上述選定的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，進行樣品空白、標準溶液和試樣溶液氣相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

色譜柱是影響檢測組分分離效果的主要因素，因此實驗所選擇色譜柱固定相類型，目標化合物的化學結構和組分極性是本文主要考慮的因素，根據相似相溶原則，本實驗目標化合物均為弱極性，所以弱極性色譜柱為本實驗首選色譜柱。同時兼顧研究對象為山蒼子果油、碳酸氫鈣、大豆油（其他植物油）等經過加工混合而成的因素。因此選擇色譜柱除了要考甲基庚烯酮、D-檸檬烯、橙花醛、香葉醛的分子結構外，還考慮減少基質的干擾等因素。本實驗采用了弱、中、強3 種不同極性的色譜柱，分別為ZB-5、ZB-35，ZB-WAX 毛 細 管色譜柱，綜合考慮靈敏度、峰形、分析時間、基線漂移等色譜分析因素，ZB-5 毛細管色譜柱效果最好，因此以ZB-5 毛細管色譜柱作為本試驗用色譜柱。

2.1.2 柱溫和柱流量的優(yōu)化及氣相色譜方法的確定

在確定優(yōu)選色譜柱后，氣相色譜法中能夠影響目標化合物分離效果的因素主要為色譜柱的升溫程序和色譜柱的氣體流量。由于甲基庚烯酮、D- 檸檬烯、橙花醛、香葉醛之間的沸點差異較大，同時考慮溶劑聚焦等因素，本研究反復實驗比較了不同的初始溫度、升溫速率、柱流量后，確定儀器參數為：進樣口溫度：250 ℃；色譜柱升溫程序:50 ℃保留 2 min，10 ℃ /min 升至150 ℃，20℃ /min 升至 250 ℃保留 2min。檢測器 （FID） 溫度280℃，分別取空白基質樣品，標準品和混合飼料添加劑樣品按上述前處理方法制備的溶液，按確定的色譜條件測定。結果空白基質樣品在目標化合物保留時間處無雜質峰干擾，見圖2、圖3和圖4，表明樣品中其他成分不干擾目標化合物測定，并且能夠在最短的時間實現目標化合物完全分離，方法特異性強，適用于山蒼子果油混合型飼料添加劑甲基庚烯酮、D- 檸檬烯、橙花醛、香葉醛含量測定。

圖2 空白基質氣相色譜圖

圖3 空白基質加標氣相色譜圖

圖4 山蒼子果油飼料添加劑產品氣相色譜圖

表1 不同溶劑對陽性樣品提取效果比較（n=6）

表2 四種目標化合物線性方程及定量限

2.2 前處理技術的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究實驗采用了乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈作為樣品的提取溶劑，對飼料添加劑樣品進行提取實驗（n=6）,實驗表明乙酸乙酯對4 種目標化合物的提取效果最為理想，所以本研究實驗選擇乙酸乙酯作為提取溶劑（見表1）。

2.2.2 提取溶劑體積和提取次數

樣品中目標化合物經過一次4 mL 提取5min 后，可以實現回收率80%以上，第二遍提取后回收率略有升，第三遍提取對回收率影響已經不顯著，因此本實驗采用提取三遍的方法及提取時間可以滿足檢測要求。

2.3 方法學考察

2.3.1 方法的線性范圍及定量限

將甲基庚烯酮、D- 檸檬烯、橙花醛、香葉醛混合標準溶液配制 為 0.010、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0mg/mL 系列標準工作溶液在上述的氣相色譜條件下進樣分析，以標準溶液濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，擬合標準曲線，結果表明4 種目標化合物在（0.01～10.0）mg/mL 范圍內均有良好線性，以三倍信噪比（S/N=3） 為 檢 出 限（LOD），S/N=10 為定量限（LQD）得到相應定量限在（0.2～0.4）mg/kg 之間，能夠滿足飼料添加劑的檢測需求（結果見表2）。

2.3.2 方法的回收率和精密度

向空白基質樣品中分別添加Ⅰ( 5g/kg) 、Ⅱ( 10g /kg) 、Ⅲ(50g/kg)三個濃度水平的混合標樣，每個水平進行6 次平行測定，回收率和精密度結果見表3。

表3 加標回收實驗結果(n =6)

表4 樣品溶液穩(wěn)定性 （單位：g/kg）

圖5 空白基質加標四種目標化合物標準品的總離子流圖

圖6 山蒼子果油混合型飼料添加劑產品總離子流圖

圖7 四種目標化合物質譜圖

2.4 溶液穩(wěn)定性試驗

按上述的前處理方法制備樣品溶液，用空白基質配制目標化合物濃度為50g/kg 的混合樣品溶液，按前述方法測定四種目標化合物含量，樣品溶液密封保存在室溫環(huán)境中，隔 2、4、8、24、48h 測定含量，結果見表4，結果表明樣品溶液在48h 內穩(wěn)定。

3 GC/MS 確證

同時稱取山蒼子果油混合型飼料添加劑產品2 份及樣品空白2 份，并在空白基質中添加濃度為50 mg/kg 水平的混標，按1.3.2 進行前處理后上機檢測。

質譜條件：載氣為高純氦氣，流速為1.5mL/min；采用分流進樣，分流比為40∶1；進樣口溫度為 250℃，50 ℃保留 2 min，10℃ /min 升至 150 ℃，20℃ /min升至250 保留2min。離子源為EI 源；電子能量為70eV；傳輸線溫度270 ℃；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；溶劑延遲5min。采用Scan 掃描模式，50～500 m/z 掃描?？傠x子流圖和質譜圖見圖5 和圖6。

圖8 山蒼子果油混合型飼料添加劑產品氣相色譜圖

4 實際樣品測定

對企業(yè)生產的山蒼子果油混合型飼料添加劑進行測定，準確稱取樣品 1g （精確至0.0001g），按照 1.3.2 前處理方法實驗。采用 GC-FID 測定，色譜譜圖見圖7、圖8，測定結果與產品明示值相符。

5 結論

本研究建立的氣相色譜法測定山蒼子果油混合飼料添加劑中甲基庚烯酮、D- 檸檬烯、橙花醛、香葉醛含量的方法，該方法具有前處理技術簡單和強特異性優(yōu)點，有較寬的線性范圍和顯著的線性關系，加標回收率高，重現性好，所使用儀器設備普及率高，可在山蒼子果油混合型飼料添加劑中甲基庚烯酮、D-檸檬烯、橙花醛、香葉醛的質量檢測及標準制定中加以推廣應用。

參考文獻：(略）