李政垚 劉潔穎 吳狄 王海 吳志宏 高鵬 王以朋* 趙宇*

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院1.骨科，2.醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，北京 100730）

骨折、截骨矯形治療的核心是使骨斷端保持穩(wěn)定，所以?xún)?nèi)固定物的性能對(duì)治療效果有著關(guān)鍵性的影響。理想的內(nèi)固定物具有高度生物相容性、足夠的機(jī)械強(qiáng)度和斷裂韌性。目前臨床獲批和最常用的是金屬內(nèi)固定物，材料包括不銹鋼、鈦和鈷鉻鉬合金。但是這些材料長(zhǎng)時(shí)間滯留體內(nèi)可能會(huì)造成永久性的物理刺激、慢性炎癥反應(yīng)，或釋放有毒元素，所有這些反應(yīng)都會(huì)損害機(jī)體健康[1,2]。同時(shí)，傳統(tǒng)金屬植入物與天然骨骼之間的彈性模量差異造成的應(yīng)力遮擋效應(yīng)會(huì)干擾骨的新陳代謝，從而導(dǎo)致骨丟失，并可能出現(xiàn)繼發(fā)性骨折[3]。傳統(tǒng)金屬材料不具有生物可降解性，必須進(jìn)行二次手術(shù)去除植入物，這會(huì)增加患者的疼痛、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和醫(yī)療費(fèi)用。因此，適用于骨科的可降解內(nèi)固定物的研發(fā)已成為生物醫(yī)學(xué)材料研究的熱點(diǎn)之一。

近年來(lái)，鎂及鎂合金作為骨科應(yīng)用的潛在材料受到越來(lái)越多的關(guān)注[4,5]。由于鎂及其合金在水溶液中的腐蝕敏感性而具有天然的生物降解能力，特別是在溶液中含有氯離子的情況下降解更加確切[6]。并且鎂具有良好的生物相容性[7]，在植入和降解過(guò)程中主要釋放的鎂離子（Mg2+）可用于人體正常代謝。與傳統(tǒng)金屬材料如不銹鋼（200 GPa）、鈷基合金（230 GPa）、鈦合金（115 GPa）相比，鎂（40～45 GPa）的彈性模量與天然骨的彈性模量（3～20 GPa）更匹配，從而能夠降低應(yīng)力遮擋效應(yīng)的發(fā)生概率[8]。

鎂及鎂合金材料降解過(guò)程中產(chǎn)生的局部高鎂環(huán)境直接作用于骨折周?chē)慕M織與細(xì)胞。在正常人體內(nèi)，血清中高鎂可直接導(dǎo)致心律失常甚至死亡，然而高鎂環(huán)境對(duì)組織、細(xì)胞的影響的研究目前較少。醫(yī)用材料研發(fā)中，已有很多關(guān)于鎂合金材料浸提液對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞影響的研究，但是在浸提過(guò)程中同時(shí)造成的浸提液pH值升高、Ca離子濃度下降等其他變化會(huì)在人體緩沖系統(tǒng)作用下被減弱。為剔除上述影響因素，本研究通過(guò)對(duì)常用鎂合金材料進(jìn)行浸提處理，測(cè)定浸提液中鎂離子含量，以此為依據(jù)配置含有相應(yīng)濃度鎂離子的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。以高于人體血清鎂正常值上限為“高鎂離子環(huán)境”，研究單純細(xì)胞外高鎂離子環(huán)境對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞的影響，從而為反向進(jìn)一步研發(fā)具有合適降解速率的、適合作為醫(yī)用材料的鎂合金/含鎂復(fù)合材料提供參考。

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mes?enchymal stem cells,hBMSCs）的增殖與分化在骨折愈合的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，所以細(xì)胞外高鎂環(huán)境對(duì)hBMSCs 的影響則顯得至關(guān)重要，故本研究以此細(xì)胞為研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（蘇州，賽業(yè)），成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（蘇州，賽業(yè)），TrypLE胰蛋白酶替代物（美國(guó)，Gibco公司），CCK試劑盒（日本，同仁公司），DMSO（美國(guó)，Sigma公司），硫酸鎂七水（北京，索萊寶），堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（上海，碧云天），BCA蛋白定量試劑盒（北京，索萊寶），Western及IP細(xì)胞裂解液（無(wú)抑制劑）（上海，碧云天），4%組織細(xì)胞固定液（北京，索萊寶），堿性磷酸酶染色液（北京，索萊寶），茜素紅染色液（蘇州，賽業(yè)），D-PBS緩沖液（四環(huán)陽(yáng)生），氯化十六烷基吡啶（北京，索萊寶）。

超純水機(jī)（美國(guó)，Aquapro 公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)，Thermo公司），電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜分析儀（inductively coupled plasma atomic emis?sion spectroscopy,ICP-AES）（日本，島津公司）。

1.2 鎂及鎂合金浸提液的制備及鎂離子濃度分析

根據(jù)ISO-10993 標(biāo)準(zhǔn)，按照材料表面積/浸提液1.25 cm2/ml的比例，使用成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基作為浸提液，制作純鎂Mg9999（99.99% Mg，河南宇航金屬材料有限公司）、鎂合金B(yǎng)M ZG 20（Mg-2.5%Zn-0.05%Ca，西安卓恰醫(yī)療器械有限公司），鎂合金AZ31B（Mg-2.5-3.5%Al-0.6-1.4%Zn-0.2-1%Mn，營(yíng)口銀河金屬材料有限公司），鎂合金WE43（Mg-3.85%Y-0.48%Zr-2.14%Nd，貴州安吉有色鑄造有限公司）浸提液。具體方法為：將裝有上述鎂及鎂合金材料的容器中加入相應(yīng)體積細(xì)胞培養(yǎng)基，放置于37℃CO2培養(yǎng)箱中浸泡24 h，提取出的浸提液置于4℃條件保存，24 h 內(nèi)送檢，利用ICPAES分析浸提液中鎂離子濃度。

1.3 不同濃度高鎂濃度細(xì)胞培養(yǎng)液的配置

根據(jù)ICP-AES 對(duì)鎂及鎂合金浸提液離子濃度分析的結(jié)果，分別在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基加入硫酸鎂七水，配置為最終鎂離子濃度分別為2、4、6、8、10mmol/L 的完全培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，保存于4℃冰箱中盡快使用。

1.4 HBMSCs的培養(yǎng)

HBMSCs 購(gòu)買(mǎi)自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司。細(xì)胞復(fù)蘇于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37℃5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每48 小時(shí)更換骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合至90%進(jìn)行傳代，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

將培養(yǎng)至第3代的hBMSCs 使用TrypLE 消化，于15 ml 離心管中1400 r/min 離心5 min，去除上清液后使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以5×103/孔密度將細(xì)胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 待細(xì)胞貼壁、形態(tài)穩(wěn)定后，將培養(yǎng)液更換為鎂離子濃度為2、4、6、8、10 mmol/L的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)液每48 小時(shí)更換1 次。分別于培養(yǎng)后1、3、6、12 d棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入100 μl培養(yǎng)液和10 μl CCK-8試劑，向無(wú)細(xì)胞孔中加入100 μl培養(yǎng)液和10 μl CCK-8試劑作為空白組，而后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)60 min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔在450 nm 處的吸光度（optical density,OD）值。按照公式計(jì)算：相對(duì)增殖率（%）=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD 值-空白組OD 值)]×100%，以此數(shù)值評(píng)價(jià)細(xì)胞外高鎂環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖的影響。本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.6 堿性磷酸酶活性檢測(cè)與堿性磷酸酶染色

將培養(yǎng)至第3代的hBMSCs 以1×104/孔密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 待細(xì)胞貼壁、形態(tài)穩(wěn)定后，將培養(yǎng)液更換為鎂離子濃度為2、4、6、8、10 mmol/L 的成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對(duì)照組加入普通成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)液每48 小時(shí)更換1 次。分別于培養(yǎng)后7、14 d 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測(cè)，應(yīng)用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)加入顯色底物，并同時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，37℃孵育10 min，后于405 nm 測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定堿性磷酸酶活性，單位為二乙醇胺（diethanolamine,DEA）酶活力單位，并同時(shí)利用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）測(cè)定法測(cè)定每孔蛋白質(zhì)含量，以DEA 酶活力單位（U）/蛋白質(zhì)總量（μg）表示堿性磷酸酶活性。在相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行堿性磷酸酶染色，并使用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)并拍照。本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.7 茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)第21天，吸去96孔板中培養(yǎng)基，D-PBS溶液洗滌2 次，每孔加入100 μl 4%組織細(xì)胞固定液固定30 min，使用去離子水洗滌2 次，每孔加入50 μl染色5 min，吸去茜素紅染料，去離子水洗滌3 次，使用倒置顯微鏡觀(guān)察鈣結(jié)節(jié)形成情況并拍照。然后在每孔中加入100 μl 10%氯化十六烷基吡啶于37℃條件下充分溶解30 min，在562 nm 測(cè)定吸光度。本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鎂及鎂合金浸提液鎂離子濃度

鎂及鎂合金在細(xì)胞培養(yǎng)基24小時(shí)浸提液中鎂離子濃度見(jiàn)表1。細(xì)胞培養(yǎng)基中鎂離子含量約為0.72 mmol/L，所有浸提液中鎂離子含量均顯著上升，其中AZ31B 降解最慢，浸提液鎂離子含量為3.71 mmol/L，而WE43降解最快，含量為5.95 mmol/L。根據(jù)以上測(cè)定結(jié)果，配置含有2、4、6、8、10 mmol/L 鎂離子的完全培養(yǎng)基及成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用以模擬可降解鎂基金屬材料內(nèi)置物在體內(nèi)降解造成的局部高鎂環(huán)境對(duì)BMSCs增殖及分化的影響。

2.2 細(xì)胞外高鎂離子環(huán)境對(duì)hBMSCs增殖的影響

培養(yǎng)第1天時(shí)，所有細(xì)胞外鎂離子濃度均不利于hBMSCs 增殖，2mmol/L 組（77.5%±11.7%，P＜0.01）、4mmol/L 組（78.2%±12.3%，P＜0.01）、6mmol/L 組（71.5%±12.3%，P＜0.01）、8 mmol/L 組（73.8%±7.3%，P＜0.01）、10mmol/L 組（81.6%±8.4%，P＜0.05）相對(duì)增殖率均顯著下降，表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，但各組之間相對(duì)增殖率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。

表1 浸提液鎂離子濃度測(cè)定（mmol/L）

圖1 細(xì)胞外鎂離子濃度對(duì)細(xì)胞增殖率的影響

培養(yǎng)第3天，細(xì)胞外高鎂離子環(huán)境不再體現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，且2mmol/L 組（140.1%±22.8%，P＜0.01）和10mmol/L 組（132.9%±11.9%，P＜0.05）培養(yǎng)后提高了細(xì)胞相對(duì)增殖率，而4 mmol/L 組（117.7%±16.6%，P=0.384）、6mmol/L 組（107.5%±17.8%，P=0.959）、8mmol/L 組（114.3%±9.3%，P=0.673）較對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較，僅2mmol/L組與6mmol/L組之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

培養(yǎng)至第6 天，4mmol/L 組（157.3%±12.2%，P＜0.01）和6mmol/L 組（138.4%±21.3%，P＜0.05）hBMSCs相對(duì)增殖率顯著提高，而2 mmol/L 組（101.2%±27.8%，P=1.00）與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8mmol/L 組（81.2%±20.8%，P=0.576）、10mmol/L 組（91.1%±17.5%，P=0.968）細(xì)胞增殖率出現(xiàn)下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4mmol/L 組與6mmol/L 組hBMSCs相對(duì)增殖率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.615）；4mmol/L 組、6mmol/L 組與2mmol/L 組、8mmol/L 組、10mmol/L 組分別比較，hBMSCs 相對(duì)生殖率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

培養(yǎng)至第12 天時(shí)，2mmol/L 組（195.6%±36.5%，P＜0.01）、4mmol/L 組（292.6% ± 52.6%，P＜0.01）、6mmol/L 組（296.3%±52.1%，P＜0.01）hBMSCs 相對(duì)增殖率顯著提高，且4mmol/L 組和6mmol/L 組提高幅度很大，相對(duì)增殖率將近300%。而8mmol/L 組（134.1%±48.6%，P=0.671）、10 mmol/L 組（128.1%±20.1%，P=0.671）對(duì)細(xì)胞相對(duì)增殖率未產(chǎn)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響，但也未表現(xiàn)出明確細(xì)胞毒性。4mmol/L組和6mmol/L組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=1.000），但4mmol/L 組、6mmol/L 組與2mmol/L 組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。4mmol/L 組、6mmol/L 組與8mmol/L 組、10mmol/L 組的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但2mmol/L 組與8mmol/L 組（P=0.115）、10mmol/L組（P=0.067）的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 高鎂環(huán)境對(duì)hBMSCs堿性磷酸酶活性的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)的第7 天，2mmol/L 組[（18.7±2.6）U/μg，P＜0.01]、4mmol/L 組[（35.9±6.3）U/μg，P＜0.01]、10mmol/L 組[（30.7±4.1）U/μg，P＜0.05]堿性磷酸酶活性較對(duì)照組[（18.7±2.6）U/μg]均顯著提高，而6mmol/L組[（26.1±4.8）U/μg，P=0.171]、8mmol/L 組[（27.6±5.8）U/μg，P=0.059]與對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組組間比較時(shí)，僅4mmol/L 組與6mmol/L 組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 高鎂環(huán)境培養(yǎng)后hBMSCs堿性磷酸酶活性

培養(yǎng)至第14 天，2、4、6、8、10mmol/L 組[（105.3±29.7）U/μg，（96.7±18.8）U/μg，（92.9±8.3）U/μg，（100.4±10.6）U/μg，（104.6±13.5）U/μg，P＜0.01]堿性磷酸酶活性較對(duì)照組[（26.6±3.3）U/μg]高表達(dá)更加顯著，均達(dá)到3倍以上，而實(shí)驗(yàn)組組間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在培養(yǎng)至第7天時(shí)，各組細(xì)胞密度接近，4mmol/L組、6mmol/L 組可以看到細(xì)胞質(zhì)中較多堿性磷酸酶。培養(yǎng)至第14 天時(shí)，與對(duì)照組相比，高鎂環(huán)境使hBM?SCs大量表達(dá)堿性磷酸酶（圖3）。

2.4 細(xì)胞外高鎂離子環(huán)境對(duì)hBMSCs 細(xì)胞外基質(zhì)礦化的影響

茜素紅對(duì)hBMSCs 細(xì)胞外基質(zhì)中鈣結(jié)節(jié)染色的結(jié)果見(jiàn)圖4，對(duì)照組中可見(jiàn)散在成塊的鈣結(jié)節(jié)，并且在細(xì)胞外基質(zhì)中可觀(guān)察到均勻分布的紅染鈣顆粒區(qū)。而在所有細(xì)胞外高鎂離子濃度組只可見(jiàn)少量細(xì)小顆粒狀鈣化結(jié)節(jié)形成。將鈣結(jié)節(jié)溶解后，圖5可見(jiàn)高鎂環(huán)境組OD 值較對(duì)照組均有顯著下降（P＜0.01），其阻礙了hBMSCs細(xì)胞外基質(zhì)礦化的過(guò)程，但高鎂離子各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

3.1 鎂及鎂合金浸提液鎂離子濃度測(cè)定及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖3 高鎂環(huán)境培養(yǎng)后7 d、14 d各組hBMSCs堿性磷酸酶染色結(jié)果，圖中藍(lán)染部分為堿性磷酸酶

在鎂和鎂合金降解實(shí)驗(yàn)中，我們采用符合ISO-10993標(biāo)準(zhǔn)的浸提材料表面積/浸提液體積的比例，這也與我國(guó)現(xiàn)行使用的國(guó)標(biāo)相匹配，被認(rèn)為能夠比較真實(shí)地反映其在體內(nèi)降解的情況。但是，目前對(duì)于可降解鎂合金材料的浸提液選擇仍存在爭(zhēng)議。在醫(yī)療器械評(píng)價(jià)時(shí)，經(jīng)常選用一些緩沖液，例如PBS 作為浸提液，但是這種浸提液與實(shí)際臨床情況相差甚遠(yuǎn)。鎂合金等金屬材料的降解不可以單純以金屬與水反應(yīng)的化學(xué)公式而評(píng)估，由于體液中含有鈣離子、碳酸根、磷酸根、蛋白質(zhì)、生物小分子、細(xì)胞甚至細(xì)菌等多種物質(zhì)的共同參與，在體內(nèi)鎂合金的降解會(huì)在金屬表面最終形成MgxCay(PO4)z(OH)n的復(fù)雜化合物，同吸附在這種化合物表面的蛋白質(zhì)等有機(jī)分子共同形成“保護(hù)膜”共同延緩鎂合金的降解[9,10]。而之前的研究已經(jīng)證實(shí)利用細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)條件下對(duì)鎂合金進(jìn)行浸提更加接近人體體內(nèi)降解過(guò)程[11,12]。所以在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，我們選用了細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)條件下對(duì)目前最常用的鎂及鎂合金材料進(jìn)行浸提。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同鎂及鎂合金材料的浸提液中，鎂離子的含量在3～6 mmol/L 之間。本實(shí)驗(yàn)中釋放鎂離子最快的金屬是WE43，最慢的是AZ31B，純鎂釋放速率在兩者之間。鎂及鎂合金的降解速率受到純度、工藝、鑄造方法及鎂合金成分等多種因素的影響，實(shí)際運(yùn)用中可以對(duì)上述任一因素進(jìn)行調(diào)整獲取適宜降解速率的鎂合金，所以我們選取幾種常用的鎂合金材料測(cè)定結(jié)果作為一種評(píng)價(jià)鎂合金普遍降解速率的預(yù)估。

圖4 高鎂環(huán)境培養(yǎng)后21 d各組hBMSCs茜素紅染色結(jié)果

多數(shù)學(xué)者在對(duì)鎂及鎂合金進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，均采用ISO-10993中提到的方法獲得24 h的浸提液，認(rèn)為是對(duì)體內(nèi)降解后材料周?chē)h(huán)境的大致模擬。但鎂/鎂合金在降解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生表面保護(hù)層抑制腐蝕，并同時(shí)具有容易發(fā)生點(diǎn)蝕的特點(diǎn)，所以其在體內(nèi)的降解速率并非一個(gè)勻速的過(guò)程，而是時(shí)刻變化、波動(dòng)的。本研究采用剛進(jìn)行完表面處理的材料，其置入浸提液中的反應(yīng)是非常迅速的，所以第一個(gè)24 小時(shí)浸提液鎂離子濃度是比較高的。據(jù)此向下向上分別設(shè)置濃度梯度，用以模擬其在體內(nèi)不同時(shí)期降解產(chǎn)生的高鎂離子微環(huán)境，以求更真實(shí)地反映體內(nèi)降解情況。本研究的目的是通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)尋找適合hBM?SCs增殖與分化的細(xì)胞外高鎂離子濃度的范圍，以期為研發(fā)具有合適降解速率的鎂合金材料及合適鎂離子釋放速率的復(fù)合材料提供參考。同前所述，我們?cè)诮嵋鹤罡邼舛鹊幕A(chǔ)上繼續(xù)向上設(shè)置鎂離子梯度至10 mmol/L，由于在體內(nèi)材料降解更加緩慢，且存在體液交換系統(tǒng)，此濃度應(yīng)已高于體內(nèi)局部鎂離子濃度上限，同時(shí)已有研究表明高于10 mmol/L 的細(xì)胞外鎂離子濃度不利于hBMSCs增殖[13]。所以在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，我們選定了2、4、6、8、10 mmol/L 的細(xì)胞外鎂離子濃度來(lái)模擬體內(nèi)鎂合金降解產(chǎn)生的局部高鎂環(huán)境。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4～6 mmol/L 細(xì)胞外鎂離子濃度對(duì)hBMSCs 增殖的促進(jìn)作用已經(jīng)達(dá)到頂峰，故亦未繼續(xù)擴(kuò)大鎂離子濃度梯度范圍。

圖5 高鎂環(huán)境培養(yǎng)后21 d各組hBMSCs茜素紅染色后使用10%氯化十六烷基吡啶溶解后562 nm處OD值

3.2 2～6 mmol/L細(xì)胞外鎂離子濃度促進(jìn)hBMSCs的增殖

鎂和鎂合金降解產(chǎn)物在局部形成的高鎂離子環(huán)境對(duì)hBMSCs的影響尤為重要。骨折愈合的過(guò)程中，hBMSCs 的成骨分化，和進(jìn)一步細(xì)胞外基質(zhì)礦化起到了至關(guān)重要的作用，是產(chǎn)生骨性骨痂的重要條件，如果內(nèi)置物造成其增殖能力的降低顯然不利于骨折愈合。在醫(yī)療器械的評(píng)價(jià)中，如果體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖率小于80%，則認(rèn)為醫(yī)療器械存在細(xì)胞毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，高鎂離子環(huán)境在細(xì)胞培養(yǎng)后第1天體現(xiàn)出了一定的毒性，各組細(xì)胞增殖率均出現(xiàn)部分下降，但在第3天細(xì)胞增殖率已經(jīng)與對(duì)照組相當(dāng)，培養(yǎng)至第6天時(shí)8 mmol/L 組和10 mmol/L 組細(xì)胞增殖率少許下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。hBMSCs培養(yǎng)至第12天時(shí)，不僅高鎂離子環(huán)境已無(wú)細(xì)胞毒性，2～6 mmol/L濃度的細(xì)胞外高鎂離子環(huán)境顯著提高了hBMSCs的增殖率，其中以4～6 mmol/L促進(jìn)作用最強(qiáng)，此濃度范圍在其他研究中尚未報(bào)道過(guò)。而我們目前常用的鎂合金材料浸提液濃度恰好在此范圍中，這無(wú)疑是具有積極意義的。在之前的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞[14]和微血管內(nèi)皮細(xì)胞[15]在5～10 mmol/L細(xì)胞外鎂離子環(huán)境中能夠達(dá)到最高生殖率，與本研究接近。有學(xué)者利用純鎂在傳統(tǒng)內(nèi)置物材料表面形成一層鍍膜，實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)hBMSCs 增殖，與本實(shí)驗(yàn)相符，機(jī)制可能是降解產(chǎn)生的局部高鎂環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生了積極影響[16]。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)處理為多孔的鎂合金材料能夠顯著提高h(yuǎn)BMSCs 的增殖率。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L、100 mmol/L 的細(xì)胞外鎂離子濃度將對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生不利影響[13]。此外有研究提示[18]，在鎂合金中應(yīng)用不同成分對(duì)hBMSCs黏附有影響，鎂合金中含有鈣并裸露于材料表面有利于細(xì)胞黏附。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拓展分析，將鎂合金材料降解速度維持在一定范圍內(nèi)，或在復(fù)合材料中添加合理劑量的鎂成分并釋放，在周?chē)M織產(chǎn)生合適的鎂離子濃度，是鎂基內(nèi)置物材料設(shè)計(jì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3.3 2～10 mmol/L 細(xì)胞外鎂離子濃度促進(jìn)hBMSCs堿性磷酸酶活性

本研究發(fā)現(xiàn)，2～10 mmol/L 濃度的細(xì)胞外鎂離子濃度都能夠顯著提高堿性磷酸酶的活性，在第14 天時(shí)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)堿性磷酸酶染色可以看到細(xì)胞質(zhì)中有大量堿性磷酸酶沉積，兩者共同驗(yàn)證了細(xì)胞外高鎂環(huán)境有助于促進(jìn)hBMSCs 的成骨分化。與本研究相印證的是，先前已有多宗研究[13,19-23]報(bào)道鈣離子和鎂離子在細(xì)胞培養(yǎng)中有助于細(xì)胞的成骨分化及貼附。在實(shí)際的新材料研發(fā)中，Lu等[24]也發(fā)現(xiàn)加入可以釋放鎂的羥基磷灰石水泥后，MG63細(xì)胞的堿性磷酸酶活性增強(qiáng)。所以，鎂基材料釋放的鎂離子在周?chē)h(huán)境中有利于hBMSCs 的成骨分化作用是比較確切的。

而在本實(shí)驗(yàn)中，堿性磷酸酶活性被細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化，所以隨著細(xì)胞增殖率上升，堿性磷酸酶總量隨之上升。細(xì)胞外鎂離子濃度為4～6 mmol/L時(shí)，總的堿性磷酸酶表達(dá)達(dá)到高峰。

3.4 2～10 mmol/L 細(xì)胞外鎂離子濃度抑制hBMSCs細(xì)胞外基質(zhì)礦化

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2～10 mmol/L 的細(xì)胞外鎂離子濃度阻止了細(xì)胞外基質(zhì)礦化的過(guò)程，且作用十分顯著，下降幅度超過(guò)50%，且各組間無(wú)顯著差異。這與Leidi等[25]發(fā)現(xiàn)的5 mmol/L以上鎂離子不利于SaOS-2細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)礦化的結(jié)果一致。這無(wú)疑非常不利于鎂合金/含鎂復(fù)合材料的研發(fā)，那么在研發(fā)中如何解決這一問(wèn)題呢？

在開(kāi)發(fā)鎂基材料時(shí)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[26]，單純鎂支架在含有巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基中降低了BMSCs細(xì)胞外基質(zhì)礦化的能力，但鎂支架表面復(fù)合β-TCP 后，BMSCs 細(xì)胞外基質(zhì)礦化的能力有所回升。將鎂元素加入磷酸鈣骨水泥中，在表面形成磷酸鎂或MgHA，顯著增強(qiáng)了BMSCs 在其表面的貼附能力和增殖能力，這可能與局部的高鎂離子環(huán)境相關(guān)。含鎂的磷酸鈣骨水泥顯著提高了BMSCs成骨分化的能力和細(xì)胞外基質(zhì)礦化的能力，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其促進(jìn)了成骨效應(yīng)，這說(shuō)明兩者間的協(xié)同作用[27]。Chen等[28]將鎂合金制作成篩網(wǎng)狀加入到PLGA/DBM（脫鈣骨基質(zhì)）支架中，發(fā)現(xiàn)hBMSCs 的成骨分化和細(xì)胞外基質(zhì)礦化能力均明顯提升，且通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其有效地修復(fù)了動(dòng)物顱骨缺損。以上多個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明類(lèi)似于羥基磷灰石、脫鈣骨基質(zhì)等具有成骨誘導(dǎo)活性的材料與鎂的結(jié)合可能可以協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化，是改善鎂對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)礦化阻擋作用的選擇之一。Tian 等[29]已經(jīng)成功利用羥基磷灰石納米顆粒對(duì)鎂金屬表面進(jìn)行表面涂層處理，發(fā)現(xiàn)hBMSCs可直接在其表面增殖，這說(shuō)明以上想法是可以實(shí)現(xiàn)的。Cipriano 等[30]利用陽(yáng)極氧化技術(shù)對(duì)鎂表面進(jìn)行處理，在類(lèi)體液環(huán)境中降解表面更容易生成富含磷和鈣的鈍化層，在未來(lái)這可能是上述理論應(yīng)用于鎂金屬材料的方法之一。

對(duì)鎂的研究中，我們最期望鎂合金能夠作為一種可降解金屬內(nèi)固定物的原材料來(lái)應(yīng)用，因?yàn)槠錂C(jī)械強(qiáng)度和抗拉強(qiáng)度更適合骨折/矯形手術(shù)的內(nèi)固定。研究也發(fā)現(xiàn)純鎂/Mg-2Ca/Mg-5Al鎂合金浸提液有利于hBMSCs 成骨分化，純鎂/Mg-2Ca/Mg-1Y 有利于細(xì)胞外基質(zhì)礦化，兩者之間作用并不平行[31]，但實(shí)驗(yàn)組并沒(méi)有發(fā)生鎂離子“鈣化阻擋”效應(yīng)。這可能與輕度提高的pH 值有利于細(xì)胞外基質(zhì)礦化有關(guān)，但是這種效應(yīng)在體內(nèi)緩沖系統(tǒng)的作用下會(huì)減弱。同時(shí)已有研究證實(shí)[32]，在鋅表面和含有鋅的鎂合金AZ31 表面，hBMSCs 的成骨分化和細(xì)胞外基質(zhì)礦化能力明顯增強(qiáng)。Wang 等[33]合成了含有少量β-TCP 的鎂鋅合金，發(fā)現(xiàn)其明顯提高了hBMSCs 的成骨分化和細(xì)胞外礦化能力。本研究包括上述體外實(shí)驗(yàn)均排除了真正發(fā)生骨折/截骨時(shí)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)對(duì)hBMSCs 的成骨分化與細(xì)胞外基質(zhì)礦化的激活效應(yīng)[34]，這也造成了體外實(shí)驗(yàn)的局限性。但也已有報(bào)道[35]發(fā)現(xiàn)鎂鋅鍶合金所制成的骨髓內(nèi)針在動(dòng)物體內(nèi)固定骨折時(shí)，相對(duì)于純鎂的骨針和對(duì)照組，明顯促進(jìn)周?chē)鹿切纬桑诹姿徕}材料中加入少量的鋅也在體內(nèi)促進(jìn)了新骨生成[36]。很多研究證實(shí)鋅離子能夠通過(guò)上調(diào)成骨細(xì)胞的活力促進(jìn)成骨，并能夠抑制破骨細(xì)胞活性減少骨的吸收[37,38]。其中機(jī)制可能是鋅上調(diào)堿性磷酸酶活性[39]，以及成骨細(xì)胞Runx-2、OPG和OC的表達(dá)[40]。但將鋅作為原料的鎂合金在降解過(guò)程中兩者產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制還亟待進(jìn)一步研究。上述研究結(jié)果意味著部分合金成分（例如鋅）也具有改善鎂離子“鈣化阻擋”的作用，這或許也是設(shè)計(jì)和篩選適宜的鎂基材料的另一思路。

綜上所述，適當(dāng)?shù)母哝V離子濃度環(huán)境有利于hBMSCs 增殖及成骨分化，但高鎂離子濃度不利于細(xì)胞外基質(zhì)礦化。在未來(lái)骨科用鎂、鎂合金、含鎂復(fù)合材料研發(fā)中，需要通過(guò)進(jìn)一步研究干預(yù)和解決高鎂環(huán)境的“鈣化阻擋”效應(yīng)，揚(yáng)長(zhǎng)避短，發(fā)揮鎂基材料的優(yōu)勢(shì)。從既往的研究來(lái)看，在鎂材料上復(fù)合其他具有活性的無(wú)機(jī)材料（如羥基磷灰石），或者在鎂合金成分中加入其他有協(xié)同作用的元素（如鋅），可能是解決這一問(wèn)題的未來(lái)方向。