孫云川 何新穎 胡秀茹 梁 偉 畢建強 胡婷婷 黃如敬 賈大鵬 趙建勇

(河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院放化療科，河北 滄州 061001)

放射性腸炎是下腹、盆腔等惡性腫瘤放療后的主要并發(fā)癥，病變可累及直腸、大腸、小腸。研究表明，電離輻射導致腸組織內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(ROS)可調(diào)節(jié)相關凋亡蛋白表達，包括B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)等，從而誘導腸黏膜細胞凋亡，是放射性腸炎形成的重要機制[1-2]。此外，ROS可誘發(fā)促炎因子的表達和釋放，其中核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)被認為是核心因子，是黏膜炎產(chǎn)生的“開關”[3-4]。目前，西醫(yī)治療主要采用手術、營養(yǎng)支持及對癥處理，遠期療效尚不滿意[5]。前期研究顯示，安腸組方可明顯改善放射性腸炎患者臨床癥狀[6-7]。本研究通過觀察安腸組方高、中、低劑量藥液對X線直線加速器誘導的急性放射性腸炎大鼠的一般情況、腸組織ROS水平、NF-κB、大腸黏膜上皮細胞Bcl-2和Bax的影響，探討安腸組方改善急性放射性腸炎癥狀的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級SD大鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量220～240 g，由天津腫瘤醫(yī)院實驗動物中心提供[許可證號：SYXK(津)2017-0005]。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，大鼠自由活動，自由飲水，喂以普通鼠食。

1.2 藥物制備 安腸組方藥物組成：生地榆30 g，白頭翁15 g，黃連5 g，白術15 g，茯苓15 g，仙鶴草30 g，木香9 g，炒白芍12 g，甘草6 g。中藥飲片均由河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥房提供，參照文獻[8]制備分別含生藥3.285、6.569、13.138 g/mL的安腸組方藥液。

1.3 試劑及儀器 試劑：兔單克隆抗體Bcl-2(批號ab59348)、Bax(批號ab77566)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(批號ab8245)，購自英國Abcam公司；ROS、NF-κB酶聯(lián)免疫分析試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司。儀器：Precise直線加速器(瑞典醫(yī)科達公司)；721可見光分光光度計(上海精密儀器儀表公司)；Nikon-176074光學顯微鏡(日本Nikon公司)；5417D臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)；TP1020自動組織脫水處理機、RM2135石蠟切片機、HI1220烘片機、EG1160組織包埋機(德國Leica公司) 、DYY-7C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組 采用隨機數(shù)字表法將48只大鼠分為正常對照組8只，模型對照組、安腸組方高劑量組、安腸組方中劑量組、安腸組方低劑量組各10只。

1.4.2 造模 全部大鼠經(jīng)適應性飼養(yǎng)7 d后，禁食12～14 h，除正常對照組外，其余均予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，以仰臥位固定至手術板上，以直線加速器給予全腹部X線照射(從劍突至恥骨聯(lián)合)，照射面積8.5 cm×7.5 cm，其余部位用5 cm厚鉛板遮擋，源皮距100 cm，總照射劑量為9 Gy，放射劑量率為300 cGy/min，照射時間約3 min。造模成功標準：受照射大鼠出現(xiàn)進食減少，出現(xiàn)大便性狀改變(如黏液便、便血)等放射性損傷癥狀[9]。

1.4.3 給藥 照射后第2 d，根據(jù)人與動物體表面積換算法[10]確定每只大鼠灌胃的原藥劑量。各組灌胃容積均為10 mL/kg，安腸組方低、中、高劑量組分別予32.85、65.69、131.38 g/kg的安腸組方藥液灌胃，其中低劑量為臨床等效劑量；模型對照組、正常對照組均以等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。每日1次，連續(xù)灌胃30 d。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 大鼠一般情況及體質(zhì)量變化 灌胃期間，每日觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、進食水情況、排便情況；各組大鼠每4 d稱取1次體質(zhì)量。

1.5.2 大鼠結腸病理組織學變化 灌胃結束后禁水食1 d后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，剪取全結腸，解剖顯微鏡下觀察結腸大體形態(tài)，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，冰0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈后平展于過濾紙上，濾紙吸干水分，稱其濕質(zhì)量。將結腸組織分為2部分，第1部分，用0.9%氯化鈉注射液迅速沖凈后，經(jīng)10%的中性甲醛溶液[以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配制]固定后，常規(guī)脫水、浸蠟、透明、包埋，4 μm厚度切片，進行HE染色。光鏡下觀察其病理學變化。第2部分，將剩余的結腸組織再分為3部分裝入錫箔紙后，迅速置于液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測結腸組織ROS、NF-κB含量 取部分腸組織，經(jīng)PBS清洗后，剪碎并稱取破碎結腸100 mg，加入液氮碾磨成粉末狀，置于玻璃勻漿管中，加入1 mL PBS混勻，玻璃勻漿器冰點勻漿。將勻漿液移入2 mL離心管中，-20 ℃過夜后，反復凍融2次使其充分裂解，4 ℃，5 000 r/min離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測ROS含量及NF-κB蛋白表達水平。

1.5.4 Western Blot法檢測大鼠結腸黏膜上皮細胞Bcl-2、Bax表達水平 按照BCA蛋白濃度試劑盒說明提取結腸組織總蛋白質(zhì)，每孔配制含30 μg總蛋白做SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后予5% BSA封閉液封閉2 h，依次孵育一抗、二抗，Bax、Bcl-2和GAPDH的一抗稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500、1∶4 000，二抗稀釋比例為1∶3 000，化學發(fā)光(ECL)反應曝光、顯色后用Quantity-one圖像處理系統(tǒng)分析目標蛋白條帶的灰度值，對以GADPH作內(nèi)參照對比得到的相對灰度進行分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠造模結果、一般情況及體質(zhì)量變化 模型對照組造模過程中因麻醉過量死亡1只，安腸組方中劑量組因灌胃不當死亡1只。在X線照射后第2 d，各組大鼠開始出現(xiàn)不同程度腹瀉；第4～7 d，各組大鼠大部分表現(xiàn)為黏液便或稀爛便，飲食、活動量減少，精神較差；第8～10 d，各組大鼠的飲食、活動情況、精神狀態(tài)逐漸恢復。各組大鼠體質(zhì)量比較見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較

由表1可見，照射后第8 d模型對照組大鼠體質(zhì)量低于正常對照組(P<0.05)，安腸組方中劑量組大鼠體質(zhì)量高于模型對照組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠結腸病理組織學改變 光鏡下進行病理組織學觀察，與正常對照組相比，模型對照組可見結腸黏膜下水腫，腺體萎縮或結構消失，并可見黏膜下血管擴張充血及炎癥細胞浸潤等。與模型對照組相比，安腸組方高、中、低劑量組隱窩、腺體結構基本完整，僅可見黏膜組織輕微水腫或少量炎癥細胞浸潤。見封3，圖1。

2.3 各組大鼠結腸組織ROS含量比較 見表2。

表2 各組大鼠結腸組織ROS含量比較

由表2可見，與正常組對照比較，模型對照組大鼠腸組織ROS含量升高(P<0.05)；與模型對照組比較，安腸組方高、中、低劑量組大鼠腸組織ROS含量均降低(P<0.05)。安腸組方高、中、低劑量大鼠腸組織ROS兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠結腸黏膜上皮細胞Bax、Bcl-2蛋白表達比較 見圖2、表3。

圖2 各組大鼠結腸黏膜上皮細胞Bax、Bcl-2蛋白的表達

表3 各組大鼠結腸黏膜上皮細胞Bax、Bcl-2蛋白表達比較

由表3可見，與正常對照組比較，模型對照組結腸黏膜上皮細胞Bax蛋白相對表達水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達水平降低(P<0.05)。與模型對照組比較，安腸組方高、中、低劑量組結腸黏膜上皮細胞Bax蛋白相對表達水平均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達水平均升高(P<0.05)。安腸組方高、中、低劑量大鼠結腸黏膜上皮細胞Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠結腸組織NF-κB蛋白表達水平比較 見表4。

表4 各組大鼠結腸組織NF-κB蛋白表達水平比較

由表4可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠腸組織NF-κB蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型對照組比較，安腸組方高、中劑量組大鼠腸組織NF-κB蛋白表達水平降低(P<0.05)。安腸組方高、中、低劑量大鼠腸組織NF-κB蛋白表達水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

放射性腸炎是腹腔局部放療、盆腔放療的常見副作用之一，其臨床表現(xiàn)為腹瀉，里急后重，甚至便血，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，甚至部分患者會因此中斷治療，極大地影響了放療的效果。放射性腸炎的主要發(fā)生機制是放射線與組織細胞內(nèi)水分子相互作用產(chǎn)生ROS。而ROS可以破壞DNA的螺旋結構,阻斷DNA的轉(zhuǎn)錄和復制過程,導致細胞凋亡[11]，其中與放射性腸炎密切相關的凋亡基因有Bax、Bcl-2等。除了直接損傷細胞外，ROS還可以激活多種信號通路，其中NF-κB信號通路最為核心[12]。NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子，進一步激活下游炎癥信號通路，釋放促炎因子、促血管生長因子、生長因子、免疫球蛋白等，進一步放大炎性反應[13]。

中醫(yī)學認為，放射線屬于“火熱毒邪”，熱毒蘊結、腸道受損是放射性腸炎的主要病機。由于癌瘤內(nèi)伏，消耗人體之氣、血、陰、陽，臟腑功能失司，五臟不能藏精，六腑不能傳化，氣機阻滯，痰濕內(nèi)生，痹阻經(jīng)絡，氣虛血瘀，加之射線照射，外感熱毒，引動內(nèi)生癌毒，邪熱入于血分，虛實夾雜，痰濕瘀毒阻于腸腑絡脈，故致本病，日久損及腎陰腎陽而纏綿難愈。病機為本虛標實，虛實夾雜，可兼夾濕熱下注、氣滯血瘀等，治療原則為祛濕解毒涼血，兼以健脾益氣[14]。本研究中安腸組方中生地榆清熱涼血止血，活血生肌，治便血療效頗佳；白頭翁清熱解毒，涼血消腫，二者共為君藥。白術、茯苓健脾除濕止瀉；黃連善除脾胃大腸濕熱；木香健脾理氣消滯，共為臣藥。炒白芍緩急止痛，兼有養(yǎng)血之功；仙鶴草收斂澀血，共為佐藥。甘草緩急和中，調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏清熱解毒、健脾除濕、活血化瘀、收斂止血、消腫生肌之功效。

本實驗中我們建立放射性腸炎大鼠模型，進一步研究安腸組方防治放射性腸炎的作用機制。本研究結果顯示，X線照射后第8 d，安腸組方中劑量組大鼠體質(zhì)量明顯高于模型對照組(P<0.05)。可見，安腸組方可有效改善放射性腸炎模型大鼠相關癥狀。

有研究認為，氧自由基與腸道組織局部炎性反應密切相關[15]。高能X射線的照射下，機體處于應激狀態(tài)，ROS產(chǎn)生增多，氧化作用增強，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，腸黏膜的正常結構遭到破壞，形成炎癥、穿孔等應激性損傷[1-2]。本研究結果表明，與模型對照組比較，安腸組方高、中、低劑量組腸組織ROS含量明顯降低(P<0.05)，且隨著安腸組方劑量的增加，大鼠腸組織ROS含量降低更明顯，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明安腸組方能改善放射性腸炎模型大鼠腸組織氧化損傷。

在正常情況下，NF-κB并不表達，但電離輻射產(chǎn)生的ROS可激活NF-κB信號通路，使其表達增強，促使大量炎性介質(zhì)釋放，引起黏膜炎[3-4]。前期臨床研究已證實，安腸組方可有效調(diào)節(jié)放射性腸炎患者血清中相關炎癥因子水平[7]。本研究結果表明，經(jīng)安腸組方干預后，NF-κB蛋白表達水平下調(diào)(P<0.05)，與前期研究相一致。因此，推測安腸組方可通過降低大鼠結腸組織NF-κB蛋白表達水平，從而減少血清促炎因子的釋放，最終達到減輕炎性反應的目的。

細胞凋亡是細胞受到放射線照射后的主要死亡方式。放射線會導致腸道黏膜上皮細胞凋亡，進而引起腸道屏障的破壞，導致放射性腸炎，其中與放射性腸炎密切相關的凋亡基因主要有Bax、Bcl-2[16]。本研究結果表明，安腸組方可下調(diào)促凋亡基因Bax蛋白、上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(P<0.05)，且隨著安腸組方用藥劑量的增加，Bax蛋白表達呈遞減趨勢，Bcl-2蛋白表達呈遞增趨勢，呈現(xiàn)了一定的量效關系，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明安腸組方可抑制結腸黏膜上皮細胞凋亡，維持細胞間緊密完整性，穩(wěn)定腸黏膜機械屏障。

綜上所述，我們推測安腸組方治療放射性腸炎的機制可能為通過抑制腸黏膜炎前體物質(zhì)ROS的產(chǎn)生，一方面抑制促凋亡基因Bax蛋白表達，上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2蛋白表達，進而抑制細胞凋亡，維持細胞間緊密完整性，穩(wěn)定腸黏膜機械屏障；另一方面抑制核因子NF-κB表達，減輕炎癥，從而減輕腸道的輻射毒性。