曹舒興 宋永周 李 明 馬 維 周 楠

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000)

女性絕經(jīng)后由于卵巢功能衰退，雌激素分泌減少，從而使骨吸收大于骨形成，最終導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1-2]。隨著對PMOP發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入,氧化應(yīng)激被認(rèn)為是PMOP發(fā)生的最重要的始動因素之一[3-4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主骨生髓，腎精充足則骨髓充養(yǎng)，腎精虧則骨髓失養(yǎng)，骨骼無力，易致骨質(zhì)疏松癥。中醫(yī)學(xué)對骨質(zhì)疏松癥特別是PMOP的治療多以補(bǔ)腎為原則，獲得較好療效[5-6]。本研究通過摘除雙側(cè)卵巢建立PMOP模型，觀察抗骨增生膠囊對骨組織代謝、氧化應(yīng)激等相關(guān)指標(biāo)的影響，探討其防治PMOP的可能機(jī)制，為PMOP提供新的防治思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠40只，6月齡，體質(zhì)量(320±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003]，實驗大鼠自由攝食、飲水，房間保持恒定溫度(25 ℃)和濕度(40%)。

1.1.2 藥品 抗骨增生膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10980006)；雌二醇(美國Sigma公司)；注射用青霉素(華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020657)。

1.1.3 試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(上海歌凡生物科技有限公司)、骨保護(hù)素(OPG)試劑盒、血清Ⅰ型前膠原N端前肽(PⅠNP)試劑盒、核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體(RANKL)試劑盒、骨鈣素(BGP)試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗鼠多克隆抗體血紅素加氧酶-1(HO-1)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國Bioworld公司)；HO-1免疫組化試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.4 儀器 DEXA雙能X線骨密度測定儀(美國GE公司)、Bond-Max全自動免疫組化染色機(jī)(德國Leica公司)、DM750顯微鏡(德國Leica公司)、SIGMA300掃描電鏡(德國蔡司公司)、TDL-50B低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、DNM-9602全自動酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)、EXAKT 300CP微距切片機(jī)(德國Exakt公司)、Image-Pro Plus(MEDIA CYBERNETICS圖像技術(shù)公司)。

1.2 分組、造模及給藥

1.2.1 分級及造模 將40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、雌激素組、抗骨增生膠囊組，每組10只。各組大鼠分別以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，除空白對照組外均施行雙側(cè)卵巢摘除法[8]；空白對照組不切除卵巢，僅切除卵巢周圍等量的脂肪組織。術(shù)后各組常規(guī)肌肉注射青霉素5萬U/d，持續(xù)抗感染治療3 d。

1.2.2 給藥 術(shù)后7 d對大鼠進(jìn)行灌胃。給藥劑量按人與大鼠體表面積比值計算[7-8]，抗骨增生膠囊組將抗骨增生膠囊藥粉0.48 g/kg溶于0.9%氯化鈉注射液1 mL制成懸濁液灌胃；雌激素組予雌二醇10 μg/kg溶于0.9%氯化鈉注射液1 mL灌胃；空白對照組、模型組均予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠每周稱體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量。灌胃均每日1次，持續(xù)12周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 骨密度(BMD) 灌胃結(jié)束后當(dāng)日，各組大鼠予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，仰臥位，采用DEXA雙能X線骨密度儀，測量腰椎及雙側(cè)股骨BMD，測量3次取平均值。

1.3.2 血清學(xué)檢測 灌胃結(jié)束后第2 d，各組禁食水8 h，腹主動脈取血8 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清，-20 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清骨代謝指標(biāo)，包括BGP、PⅠNP、OPG、RANKL,比色法檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)，包括MDA、CAT、SOD。

1.3.3 骨組織形態(tài)學(xué)觀察 采血后以頸椎脫臼法處死大鼠，處死后取各組左側(cè)股骨中段1 cm，4%多聚甲醛固定、脫蠟、包埋，沿股骨長軸切片，HE染色后，40倍光鏡下觀察骨組織形態(tài)變化。

1.3.4 免疫組化法檢測HO-1蛋白表達(dá) 取左側(cè)股骨標(biāo)本，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性后，滴加HO-1抗體，濕箱內(nèi)4 ℃過夜。滴加二抗，DAB顯色后復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以細(xì)胞漿有棕褐色顆粒沉著為陽性，采用圖像分析系統(tǒng)檢測平均光密度值(MOD)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較 見表1。

表1 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較

表1 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較

組 別n腰椎股骨空白對照組100.191 1±0.003 20.215 2±0.005 8模型組100.160 4±0.005 8*0.180 3±0.004 9*雌激素組100.188 9±0.005 6△0.208 0±0.007 0△抗骨增生膠囊組100.180 1±0.004 7△0.201 0±0.003 4*△

與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

由表1可見，與空白對照組比較，模型組腰椎、股骨BMD均降低(P<0.05)，抗骨增生膠囊組股骨BMD降低(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組腰椎、股骨BMD均升高(P<0.05)；抗骨增生膠囊組、雌激素組腰椎、股骨BMD組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 骨形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察，空白對照組骨小梁豐富密集，排列規(guī)則；模型組骨小梁數(shù)目減少，排列稀疏，寬度變窄，骨髓腔增大，脂肪細(xì)胞增多，部分骨小梁斷裂，說明造模成功；與模型組相比，雌激素組和抗骨增生膠囊組骨組織形態(tài)明顯改善，骨小梁數(shù)目增多，寬度增大。見封2，圖1。

2.3 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較 見表2。

表2 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較

由表2可見，與空白對照組比較，模型組血清BGP、PⅠNP均升高(P<0.05)，OPG降低(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組BGP、PⅠNP均降低(P<0.05)，OPG升高(P<0.05)；抗骨增生膠囊組、雌激素組BGP、PⅠNP、OPG組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組RANKL組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表3。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

由表3可見，與空白對照組比較，模型組CAT降低(P<0.05)，MDA升高(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組CAT升高(P<0.05)，MDA降低(P<0.05)；抗骨增生膠囊組、雌激素組CAT、MDA組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組SOD組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠HO-1表達(dá)及HO-1 MOD比較 見表4，圖2。

表4 各組大鼠HO-1 MOD比較

由表4可見，與空白對照組比較，模型組HO-1 MOD升高(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組HO-1 MOD均降低(P<0.05)；雌激素組、抗骨增生膠囊組HO-1 MOD組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

HO-1蛋白主要表達(dá)于骨小梁周邊的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨髓。與空白對照組相比，模型組可見大量HO-1蛋白表達(dá)，雌激素組和抗骨增生膠囊組僅可見少量的HO-1蛋白表達(dá)(見封2，圖2)。

3 討 論

PMOP是指婦女絕經(jīng)后因雌激素水平下降、卵巢功能逐漸衰退而導(dǎo)致人體內(nèi)骨的吸收大于骨的形成,進(jìn)而出現(xiàn)以骨顯微結(jié)構(gòu)破壞和全身骨量減少為基本特征的一種代謝性疾病。雌激素缺乏一直被認(rèn)為是PMOP的核心機(jī)制，但最近的研究表明，氧化應(yīng)激才是最根本機(jī)制[9]。氧化應(yīng)激可抑制成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，刺激破骨細(xì)胞生長分化和骨吸收，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，臨床主要表現(xiàn)為骨痛和骨折率增加。本課題組前期研究結(jié)果顯示，抗骨增生膠囊含藥血清可促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化[10]。本研究旨在通過活體實驗觀察抗骨增生膠囊對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的治療作用，并探究其中可能涉及的機(jī)制。

PMOP屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”范疇。腎藏精、主骨，絕經(jīng)后女性“天癸竭，地道不通”，腎陰精虧虛，日久遷延則耗損精髓，髓?？仗?，故足不任身，發(fā)為骨痿。年老體弱，體虛氣弱，氣機(jī)不利，日久氣虛無力推動血行脈中，必致血瘀；腎之陽氣不足，則血行無力，血脈不溫，脈寒流緩也可成瘀；腎之陰精不足，則精津虧少，血少而稠，血流黏滯而瘀。故PMOP病機(jī)多為腎虛血瘀，腎虛為本，血瘀為標(biāo)。治宜補(bǔ)腎填精，兼活血化瘀。抗骨增生膠囊中熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰，益精填髓；女貞予補(bǔ)益肝腎，清虛熱；肉蓯蓉補(bǔ)腎陽，益精血；狗脊補(bǔ)肝腎，強(qiáng)腰膝，祛風(fēng)濕；骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎強(qiáng)骨，續(xù)傷止痛；淫羊藿補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕；雞血藤、牛膝活血通絡(luò)止痛；萊菔子行氣消脹，補(bǔ)而不滯。諸藥合用，共奏補(bǔ)腰腎、強(qiáng)筋骨、活血止痛之功。

雙側(cè)性腺(卵巢)摘除來建立PMOP大鼠模型是世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國食品與藥物管理局(FDA)推薦的最佳模型。本研究選取6月齡大鼠建立模型，觀察各組大鼠腰椎、股骨BMD和骨組織形態(tài)，BMD表示骨強(qiáng)度，可用于診斷骨質(zhì)疏松、評價藥物療效[11]，而觀察骨組織微形態(tài)可以直觀評價骨質(zhì)的疏松狀況[12]。與空白對照組比較，模型組腰椎、股骨BMD明顯降低(P<0.05)，骨組織稀疏，骨小梁數(shù)量減少，提示本研究造模成功。與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組BMD明顯增高(P<0.05)，骨組織形態(tài)明顯改善，骨小梁數(shù)目增多，寬度增大，說明抗骨增生膠囊可增加骨量和骨密度，改善大鼠骨質(zhì)疏松；雌激素組、抗骨增生膠囊組BMD組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明抗骨增生膠囊效果與雌激素相似。

骨代謝指標(biāo)可反映骨的轉(zhuǎn)換狀況。BGP特異反映成骨細(xì)胞活動度[13]，研究發(fā)現(xiàn)PMOP患者體內(nèi)BGP明顯升高[14]。PⅠNP是反映骨形成的指標(biāo)之一，其升高表示Ⅰ型膠原合成速率增快，代表骨轉(zhuǎn)換活躍，研究發(fā)現(xiàn)PMOP女性PⅠNP水平明顯升高[15]。RANKL是由破骨細(xì)胞產(chǎn)生，與核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子(RANK)結(jié)合而增加骨質(zhì)吸收，OPG是RANKL的抑制劑，由雌激素刺激生成，故OPG/RANK/RANKL通路是雌激素參與調(diào)節(jié)骨生成和骨吸收的途徑之一，也是絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制之一[16]。絕經(jīng)后女性O(shè)PG水平下降，提示骨吸收增加而骨形成減少。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組血清BGP、PⅠNP升高(P<0.05)，OPG降低(P<0.05)，提示骨代謝呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換水平；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊組BGP、PⅠNP均降低(P<0.05)，OPG升高(P<0.05)，說明抗骨增生膠囊可顯著提高OPG水平，促進(jìn)骨形成，減少骨吸收，拮抗骨質(zhì)疏松。雌激素組、抗骨增生膠囊組BGP、PⅠNP、OPG組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可見抗骨增生膠囊與雌激素療效相當(dāng)。

MDA是氧化應(yīng)激后脂質(zhì)過氧化損傷的標(biāo)志物，而SOD、CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，是評估氧化應(yīng)激狀態(tài)的可靠指標(biāo)。PMOP女性體內(nèi)性激素水平變化會改變大部分代謝活動，抗氧化應(yīng)激水平顯著下降，氧自由基水平升高[17]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組CAT降低(P<0.05)，MDA升高(P<0.05)，說明氧化應(yīng)激可能在PMOP的發(fā)病中起著重要作用。而抗骨增生膠囊組和雌激素組血清CAT較模型組升高(P<0.05)，MDA降低(P<0.05)，且2組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明抗骨增生膠囊改善了去卵巢大鼠氧化應(yīng)激損傷。

HO-1是一種細(xì)胞誘導(dǎo)型Ⅱ型酶，也是血紅素分解代謝過程中的限速酶，能夠促進(jìn)一氧化碳、鐵和膽紅素的釋放，其反應(yīng)產(chǎn)物涉及各種氧化誘導(dǎo)劑的防御，包括脂多糖、過氧化氫、缺氧等,其表達(dá)在鐵穩(wěn)態(tài)、抗氧化、骨吸收反應(yīng)中起著重要的作用，是目前發(fā)現(xiàn)的最易被誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激的酶[18]。HO-1在正常狀態(tài)下呈低水平表達(dá)，而當(dāng)某些刺激出現(xiàn)如細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡，會誘使其表達(dá)上升，發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激能力，所以HO-1可反映氧化應(yīng)激水平強(qiáng)弱。本研究結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組可見大量HO-1蛋白表達(dá)，HO-1 MOD升高(P<0.05)；與模型組比較，雌激素組、抗骨增生膠囊HO-1 MOD均降低(P<0.05)，僅可見少量的HO-1蛋白表達(dá)，且2組HO-1 MOD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這說明抗骨增生膠囊和雌激素效果相同，可以改善去卵巢大鼠氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)。

綜上，本研究通過觀察抗骨增生膠囊對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠一系列指標(biāo)的改善，證實其能顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，修復(fù)骨結(jié)構(gòu)，降低骨組織的高轉(zhuǎn)換水平代謝，增加骨形成，減少骨吸收，從而改善骨質(zhì)疏松。其可能有與雌激素相似的機(jī)制，包括降低破骨細(xì)胞活性，拮抗氧化應(yīng)激，改善氧化應(yīng)激損傷，抑制破骨細(xì)胞分化并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。但究其更細(xì)化的機(jī)制，如究竟涉及何種具體信號通路而改善抗氧化因子的表達(dá)尚不清楚，本課題組將針對抗骨增生膠囊對深層具體通路的影響機(jī)制進(jìn)一步探討。