張鴻晨 陳杰民 沈紅璋 楊建鋒 張?bào)泺P

近年來，炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)病率在我國及其他亞洲國家呈逐年上升趨勢。我國IBD中潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的比例顯著高于克羅恩?。?］。炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌（CAC）是導(dǎo)致IBD患者死亡的主要原因之一［2］。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境中含量最多的免疫細(xì)胞，通過分泌大量炎性因子、生長因子等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及血管生長，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲［4］。研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)TAM的干預(yù)治療能有效改善結(jié)直腸癌預(yù)后［5］。巖白菜素（Bergenin）是從巖白菜屬植物中提取的異香豆素類化合物，既往發(fā)現(xiàn)巖白菜素具有一定的抗炎、抗腫瘤作用，但其具體機(jī)制目前尚不清楚［6］。本研究通過對(duì)CAC模型小鼠預(yù)防性給予巖白菜素，探討巖白菜素對(duì)CAC的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（SPF）級(jí)雄性C57BL/6小鼠32只（6～8周齡，體質(zhì)量19～25g）采購自維通利華公司［SCXK（浙）2019-0001］，在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前清潔環(huán)境飼養(yǎng)1周，室溫22～24℃，相對(duì)濕度40%～55%，光照12h/d。自由飲水、進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)時(shí)間2018年10月至2019年11月。

1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉（dextransodiumsulfate，DSS）分子量36000～50000，購買自MP Biomedicals公司。巖白菜素（Bergenin，BG）購買自南京景竹生物科技有限公司。氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM）購買自Sigma-Aldrich公司。Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購買自Lifetechnology公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液試劑盒購買自美國Applied Biosystems公司。BrdU，CD8和CD68抗體均購買自美國Abcam公司。HE染色液，即用型免疫組化染色試劑盒和二抗均購買于上海碧云天科技有限公司。STAT3和pSTAT3抗體購買自Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器 Nanodrop 2000分光光度計(jì)購自美國Thermo公司。7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購買自美國Applied Biosystems公司。光學(xué)顯微鏡（CX31型）購買自日本Olympus公司。Western-blotting檢測顯色成像儀購自美國Bio-Rad公司。LEICA DFC300 FX圖像采集系統(tǒng)購買自德國LEICA公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 （1）模型建立：將小鼠隨機(jī)分為3組，即空白組、AOM/DSS組和巖白菜素+AOM/DSS組（BG+AOM/DSS）。CAC造模方法：給腹腔注射AOM（劑量10mg/kg）1周后開始，給予小鼠自由飲用含2%DSS的純凈水1周，繼而飲用1周正常純凈飲用水，反復(fù)3個(gè)循環(huán)。巖白菜素給藥組小鼠從第1周至第13周，用巖白菜素50mg/（kg·d）灌胃，空白組和模型組每日灌服純凈水作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過程中每3d記錄小鼠體質(zhì)量和死亡情況，13周結(jié)束后處死小鼠，打開腹腔，從盲腸末端至肛門處取下整段結(jié)直腸。沿結(jié)腸端縱向剖開腸管，記錄腫瘤數(shù)目和腫瘤大小和腫瘤負(fù)荷（每條結(jié)直腸中腫瘤直徑之和）。造模方法見圖1。（2）結(jié)腸成瘤判斷和病理檢查：計(jì)算結(jié)腸肉眼可見的成瘤數(shù)，實(shí)驗(yàn)中使用游標(biāo)卡尺測定腫瘤平均直徑，進(jìn)而計(jì)算腫瘤負(fù)荷（即所有腫瘤的直徑之和），記錄各組小鼠直徑≥2mm的腫瘤比例。結(jié)腸組織樣本用 10%甲醛固定后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，采用H&E染色，并在光鏡下觀察組織染色情況，結(jié)腸切片請(qǐng)病理科醫(yī)生判斷是否形成腫瘤和評(píng)估。（3）RT-qPCR檢測：將結(jié)腸組織放置在Trizol中研磨提取總RNA，然后使用Nanodrop分光光度計(jì)測定提取RNA的濃度與純度。使用Applied Biosystems反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增試劑盒進(jìn)一步合成cDNA，進(jìn)而進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增（引物見表1）。設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃ 5min，（95℃ 15s，56℃15s，72℃ 5s）40個(gè)循環(huán)。選擇18S mRNA 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算分析目的基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。（4）Western blotting檢測：液氮冷凍后研磨結(jié)腸組織，加入RIPA蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞。離心后收集上清液，采用BCA試劑盒定量總蛋白濃度。加樣，使用SDS-PAGE電泳分離蛋白，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到甲醇活化的PVDF膜上。然后使用5%脫脂牛奶浸泡PVDF膜室溫封閉，洗滌，再與特異性一抗（STAT3，pSTAT3，GAPDH抗體）室溫孵育4℃過夜，洗滌，然后將PVDF膜放入使用辣根過氧化物酶的二抗中室溫孵育1h。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑與PVDF 膜作用后進(jìn)行顯影和定影，檢測STAT3，pSTAT3，GAPDH蛋白表達(dá)量。（5）免疫組化和免疫熒光染色：首先將石蠟切片進(jìn)行二甲苯，酒精，蒸餾水梯度浸泡脫蠟后復(fù)水。使用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液置于水浴槽中100℃水浴修復(fù)20min，置于室溫中進(jìn)行自然冷卻。去離子水清洗后浸泡于含有3%的H2O2溶液中置于4℃冰箱中10min封閉組織中的內(nèi)源性過氧化物酶。使用5%的BSA溶液室溫封閉30min。使用一抗孵育4℃冰箱中過夜。復(fù)溫清洗后使用辣根過氧化物酶或熒光標(biāo)記的二抗置于室溫中孵育1h后清洗。免疫組化染色使用DAB顯色后，蘇木素染色后封片；免疫熒光染色使用DAPI然后封片。

圖1 動(dòng)物模型的造模和給藥方法

表1 RT-qPCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巖白菜素對(duì)CAC小鼠模型體重、死亡率和成瘤率影響 CAC小鼠模型體重與小鼠的病情發(fā)展程度相關(guān)，因此在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)小鼠體重進(jìn)行記錄以監(jiān)測小鼠狀況及巖白菜素的療效?？瞻捉M小鼠體重逐漸上升，生長狀態(tài)良好。給予AOM/DSS的造模組小鼠，在給予DSS后開始出現(xiàn)便軟、便血及脫肛等癥狀，逐漸出現(xiàn)毛發(fā)不順、精神萎靡不振等表現(xiàn)。而給予巖白菜素+AOM/DSS（BG+AOM/DSS）組小鼠，在給予DSS后體重下降減少。與AOM/DSS組比較，巖白菜素能夠明顯改善AOM/DSS造模對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（見圖2A）。對(duì)照組小鼠結(jié)直腸中未見異常增生組織；AOM/DSS組小鼠結(jié)直腸中可見大小不等的腫瘤，數(shù)量為（7.6±2.3），腫瘤負(fù)荷為（15±2.9）；巖白菜素治療組小鼠結(jié)直腸中存在少量增生和腫瘤，數(shù)量為（4.8±1.3），腫瘤負(fù)荷為（7.4±2.5），較AOM/DSS造模組顯著下降（P<0.01）（見圖2B、C）。比較結(jié)腸腫瘤大小組成比例發(fā)現(xiàn)，BG+AOM/DSS組小鼠直徑≥2mm的腫瘤比例顯著低于AOM/DSS組（P<0.001）（見圖2D）。給予AOM/DSS造模之后，結(jié)腸癌模型組小鼠在第4周開始出現(xiàn)死亡，93d時(shí)整體死亡率為41.7%，給予巖白菜素組小鼠第9周才開始出現(xiàn)死亡，93d時(shí)整體死亡率為8.3%，巖白菜素治療組能夠提高CAC模型小鼠的存活時(shí)間，改善生存率（見圖2E）。

圖2 巖白菜素對(duì)CAC模型小鼠結(jié)腸腫瘤的影響

2.2 巖白菜素對(duì)CAC小鼠模型組織病理學(xué)的影響 空白組小鼠結(jié)腸隱窩結(jié)果排列整齊，且結(jié)腸黏膜層及黏膜肌層結(jié)構(gòu)完整；AOM/DSS組小鼠黏膜層部分破壞，隱窩分支呈樹狀生長，且背靠背腺體生成，腫瘤惡性程度較高，巖白菜素治療組病理表現(xiàn)明顯較模型組減輕，上皮細(xì)胞損傷較輕，黏膜層和肌層結(jié)構(gòu)完整。進(jìn)一步使用BrDU評(píng)估結(jié)腸上皮細(xì)胞異常增殖情況，與AOM/DSS組比較，巖白菜素治療能使腫瘤區(qū)域增殖細(xì)胞數(shù)量降低51.4%［（35.5±6.9） vs. （17.3±4.3），P<0.001］，而非腫瘤區(qū)域隱窩增殖細(xì)胞數(shù)量無顯著差別（見圖3）。

圖3 巖白菜素對(duì)CAC模型小鼠結(jié)直腸組織病理與細(xì)胞增殖的影響

2.3 巖白菜素對(duì)CAC小鼠結(jié)腸炎癥因子和pSTAT3表達(dá)的影響 BG+AOM/DSS組小鼠結(jié)腸中促炎因子IL-6，IL-17和IL-23 mRNA表達(dá)顯著低于AOM/DSS組（見表2）。在CAC炎癥腫瘤進(jìn)程中，多種炎性因子通過激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3參與促癌進(jìn)程。BG+AOM/DSS組結(jié)腸中pSTAT3表達(dá)量顯著降低（P<0.001）（見表3、圖 4）。

2.4 巖白菜素對(duì)CAC小鼠腫瘤微環(huán)境中TAM和CD8+T細(xì)胞的影響 BG+AOM/DSS組結(jié)腸腫瘤中TAM細(xì)胞數(shù)量較AOM/DSS組降低［（77.2±11.1） vs.（33.2±6.1），P<0.001］，具有抗腫瘤免疫功能的CD8+T細(xì)胞數(shù)量增多［（20.5±7.1） vs. （50.7±18），P<0.01］（見圖 5）。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6，IL-17和IL-23 mRNA表達(dá)水平

表3 各組大鼠結(jié)腸組織STAT3和pSTAT3表達(dá)水平

圖4 AOM/DSS組與BG+AOM/DSS組小鼠結(jié)腸STAT3和pSTAT3蛋白表達(dá)的電泳圖

圖5 巖白菜素對(duì)CAC模型小鼠腫瘤微環(huán)境中TAM和CD8+T細(xì)胞的影響

3 討論

巖白菜素是從從巖白菜屬植物中提取的異香豆素類化合物，臨床上目前應(yīng)用于治療慢性支氣管炎患者，既往發(fā)現(xiàn)巖白菜素具有一定的抗炎、抗腫瘤作用，但其具體機(jī)制目前尚不清楚［6］。本研究顯示，巖白菜素能有效緩解AOM/DSS模型小鼠體重減低，減少小鼠結(jié)直腸內(nèi)腫瘤的發(fā)生，降低腫瘤細(xì)胞增殖，增加小鼠生存率。同時(shí)，巖白菜素能夠降低AOM/DSS模型小鼠腫瘤微環(huán)境中炎性促癌因子及pSTAT3轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，增加CD8+T細(xì)胞比例，其機(jī)制可能與降低TAM浸潤相關(guān)。

目前研究共識(shí)認(rèn)為慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，參與腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移及治療耐受作用［7］。CAC是導(dǎo)致IBD患者死亡的主要原因之一。與散發(fā)性結(jié)直腸癌不同，CAC的發(fā)病機(jī)制中更多依賴腫瘤微環(huán)境中的大量炎性因子和免疫細(xì)胞。既往研究發(fā)現(xiàn)，巖白菜素具有多種抗炎功能，并且通過激活PPAR-γ緩解結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，但尚無其對(duì)于炎癥相關(guān)性結(jié)腸癌作用的研究［8］。AOM/DSS誘導(dǎo)CAC小鼠模型是目前最常用的腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌動(dòng)物模型之一，其具有成瘤率高、周期短的優(yōu)點(diǎn)［9］。本研究使用AOM/DSS誘導(dǎo)CAC小鼠模型，在第13周留取小鼠組織，模型成瘤率100%。本研究顯示，與AOM/DSS組比較，巖白菜素治療組小鼠生存率明顯增高，結(jié)腸腫瘤數(shù)量和負(fù)荷明顯下降，提示巖白菜素在CAC中具有顯著的抑制腫瘤的作用。

當(dāng)下共識(shí)認(rèn)為，局部促炎微環(huán)境通過激活促癌基因在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位。既往研究發(fā)現(xiàn)多種促炎因子包括IL-6，IL-17和IL-23的高表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)［10］。以IL-6為主的多種促炎因子通過激活致癌轉(zhuǎn)錄因子STAT3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活。研究證實(shí)，阻斷IL-6-STAT3通路能夠有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，包括結(jié)直腸腫瘤、皮膚腫瘤等［11］。本研究結(jié)果顯示，巖白菜素治療能夠顯著降低結(jié)腸中IL-6，IL-17和IL-23等促炎因子mRNA表達(dá)，同時(shí)能夠抑制STAT3磷酸化，提示巖白菜素在CAC模型中可能通過拮抗IL-6-STAT3信號(hào)通路抑制腫瘤生長。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存和發(fā)展的內(nèi)環(huán)境，近年來腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞或因子的相互作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。其中，CD8+T細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中公認(rèn)的抗腫瘤免疫細(xì)胞，其能夠通過釋放γ-干擾素、穿孔素和顆粒酶B等腫瘤毒性細(xì)胞因子達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的作用［12］。本研究顯示，巖白菜素治療后CAC模型小鼠結(jié)腸中CD8+T細(xì)胞升高，表明巖白菜素的抗癌作用依賴其對(duì)于腫瘤微環(huán)境的影響。TAM是腫瘤微環(huán)境中含量最多的免疫細(xì)胞，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)血管生成起重要作用［13］。同時(shí)，TAM的浸潤能夠降低抗腫瘤藥物敏感性。本研究顯示，巖白菜素能夠顯著降低CAC模型結(jié)腸腫瘤中的TAM細(xì)胞，對(duì)癌旁組織無顯著影響，提示巖白菜素可能通過抑制TAM調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境抑制腫瘤生長。