劉桂英，田 金，肖 瑤，吳金浩，宋 倫，高 穎，王志松

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023 )

皮質(zhì)醇含量是反映腎上腺皮質(zhì)功能的重要指標(biāo)之一，海洋動(dòng)物血清中的皮質(zhì)醇激素含量隨應(yīng)激強(qiáng)度呈現(xiàn)規(guī)律性變化，是可以用來(lái)衡量應(yīng)激水平的重要生理指標(biāo)[1]。皮質(zhì)醇分泌過(guò)多或者不足，均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，增加動(dòng)物發(fā)生病害的幾率[2]。機(jī)體分泌皮質(zhì)醇受外部環(huán)境影響，如擁擠和劇烈振蕩脅迫造成草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)血液內(nèi)皮質(zhì)醇含量大幅度升高[3-4]；船舶噪聲影響有機(jī)體中的皮質(zhì)醇水平，破壞有機(jī)體的繁殖發(fā)育和生長(zhǎng)[5]；環(huán)境壓力促使魚(yú)類生成皮質(zhì)醇激素，影響機(jī)體的新陳代謝等功能[6]。關(guān)于皮質(zhì)醇的研究主要集中在海洋脊椎動(dòng)物[7-13]，而海洋棘皮動(dòng)物皮質(zhì)醇的相關(guān)研究報(bào)道較少。仿刺參的體腔液類似于血液，研究仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇的含量來(lái)評(píng)價(jià)仿刺參(Apostichopusjaponicus)的應(yīng)激水平，對(duì)于了解仿刺參的應(yīng)激能力和免疫水平等生理功能具有重要意義。

目前測(cè)定血清皮質(zhì)醇有化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法、蛋白競(jìng)爭(zhēng)法和高分辨質(zhì)譜法等[14-18]，常用的是化學(xué)發(fā)光法，它具有檢測(cè)迅速、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但受血清蛋白結(jié)合的影響，不能反映實(shí)際發(fā)揮功能的皮質(zhì)醇的情況；若基質(zhì)不同，結(jié)合蛋白不同，會(huì)導(dǎo)致皮質(zhì)醇的測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確[19-20]。因此，研究仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇的測(cè)定方法，對(duì)進(jìn)一步探索皮質(zhì)醇對(duì)仿刺參生理行為的影響，具有科學(xué)指導(dǎo)意義。

筆者基于超高效液質(zhì)聯(lián)用的檢測(cè)方法，結(jié)合固相萃取的前處理技術(shù)，建立仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇的檢測(cè)方法。通過(guò)優(yōu)化前處理技術(shù)，采用梯度洗脫的分離方式，以建立快速、靈敏、穩(wěn)定的仿刺參體腔液皮質(zhì)醇檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)仿刺參

仿刺參取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)基地，分別為3齡仿刺參和幼參若干，自基地運(yùn)回后，于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)10 d，暫養(yǎng)期間水溫保持在(25.0±0.5) ℃，鹽度約30，光照周期為14L∶10D。每日16:00過(guò)量投喂幼參1次，3齡參此溫度下進(jìn)入夏眠不攝食。飼料為遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院自研飼料，主要由魚(yú)粉、鼠尾藻(Sargassumthunbergii)粉、馬尾藻(Sargassumsp.)粉、海帶(Saccharinajaponica)粉和酒糟等組成。每日清污換水1次，24 h連續(xù)充氣。

1.2 儀器與試劑

Xevo TQD型超高效液相色譜質(zhì)譜儀(美國(guó) Waters公司)、氮吹濃縮儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)、Milli-Q超純水儀(美國(guó) Milliopore公司)、離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、固相萃取柱(美國(guó)安捷倫公司，300 mg，3 mL)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量(精確至1.0 mg)皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃保存，臨用時(shí)稀釋成所需用量。

1.4 樣品前處理

取樣時(shí)，將仿刺參置于冰盤(pán)中，自腹面剖開(kāi)約1 cm，用1 mL無(wú)菌注射器吸取體腔液, 3齡參每頭吸取5 mL體腔液組成一個(gè)樣品; 因幼參體腔液含量少， 為保證樣品充足，每頭吸取1 mL， 5頭幼參的體腔液共5 mL合為一個(gè)樣品。將抽取的體腔液置于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL甲酸乙腈混合溶液(在10 mL乙腈中加入20 μL的甲酸)，充分搖勻，渦旋，加入1 g的氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鈉，充分渦旋混勻1 min，超聲10 min，靜置，以5000 r/min，4 ℃離心15 min，取乙腈相上清液4 mL，放入空的聚丙烯塑料離心管中，加入1 mL水，混勻，將待測(cè)溶液全部轉(zhuǎn)入，過(guò)固相萃取柱，重力自流，抽干小柱，收集全部流出液，45 ℃水浴濃縮，氮吹儀氮吹至液面高度恒定，用去離子水定容至1 mL，上清液經(jīng)水相濾膜0.22 μm過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，供超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：BEH C-18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫程序見(jiàn)表1，進(jìn)樣體積10 μL。

表1 二元梯度洗脫順序

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI+)源，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；離子源溫度：650 ℃；毛細(xì)管電壓：3.20 kV；錐孔電壓：45 V；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h，錐孔氣流量：50 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

采用樣品基質(zhì)提取液配制質(zhì)量濃度為0、5、10、20、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到目標(biāo)化合物的線性回歸方程y=197.8x-1192和相關(guān)系數(shù)r=0.9920，結(jié)果表明，皮質(zhì)醇在質(zhì)量濃度0～100 μg/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，以3倍和10倍信噪比確定該化合物的儀器檢出限和定量限，分別為0.11 μg/L和0.35 μg/L。

2.2 回收率和精密度

取空白樣品，分別添加20、40、100 μg/L質(zhì)量濃度水平的皮質(zhì)醇，每個(gè)質(zhì)量濃度水平測(cè)定5份平行樣品，考察方法的回收率和精密度，平均回收率分別為77%、96%和105%，精密度分別達(dá)到5.6%、3.2%和2.8%，試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度，適合實(shí)際樣品的測(cè)定。

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

用本試驗(yàn)所建立的方法，對(duì)幼參和3齡參體腔液進(jìn)行檢測(cè)，幼參體腔液中未檢出皮質(zhì)醇，3齡參混合體腔液中皮質(zhì)醇的含量為6.91 μg/L，雌3齡參體腔液中皮質(zhì)醇含量為6.28 μg/L，雄3齡參體腔液中皮質(zhì)醇含量為6.21 μg/L，實(shí)際樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖1。本試驗(yàn)的樣品檢測(cè)結(jié)果與周曉夢(mèng)等[21]結(jié)果不同，周曉夢(mèng)等[21]是用平均體質(zhì)量(31.68±3.29) g的仿刺參，而本試驗(yàn)用的是平均體質(zhì)量(15±2.59) g的仿刺參，分析可能是由于個(gè)體差異所致。

圖1 實(shí)際樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

因皮質(zhì)醇為極性化合物，常用的色譜柱為C-18柱，本試驗(yàn)采用BEH C-18柱和BEH HILIC柱在同一條件下進(jìn)行分離，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，BEH C-18柱的分離效果好于BEH HILIC柱，目標(biāo)化合物的峰型尖銳，且相同質(zhì)量濃度信號(hào)響應(yīng)值高。乙腈和水、甲醇和水是液質(zhì)分析常用的流動(dòng)相，用這兩種流動(dòng)相組成進(jìn)行分析可知，乙腈和水的效果優(yōu)于甲醇和水，在水中加入了0.1%的甲酸后，增強(qiáng)了目標(biāo)物的離子化效率，減小了基質(zhì)效應(yīng)，在相同濃度峰響應(yīng)值增高(圖1)。

流速和柱溫對(duì)保留時(shí)間和峰型均有影響。流速增加、柱溫升高均會(huì)使皮質(zhì)醇的保留時(shí)間減小，峰寬變窄，峰型對(duì)稱尖銳，但若流速太大，柱溫太高，對(duì)色譜柱有損傷，減少色譜柱的壽命。選取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min的流速進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，在流速0.2 mL/min和柱溫30 ℃時(shí)效果最佳。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI+模式下對(duì)0.5 mg/L的皮質(zhì)醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜掃描分析，得到該化合物的分子離子峰[M+H]+，以分子離子為母離子，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 皮質(zhì)醇的質(zhì)譜參數(shù)

3.3 提取試劑的優(yōu)化

有機(jī)提取常用試劑有乙腈、甲醇、氯仿等，根據(jù)文獻(xiàn)[18]，先用氯仿提取皮質(zhì)醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯仿的提取率較低，改用100%甲醇、80%甲醇、100%乙腈及80%乙腈對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行提取，通過(guò)回收率比較提取效率，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，80%乙腈的提取效率高，為90%，由于添加甲酸能促進(jìn)皮質(zhì)醇提取，故在80%乙腈中，加入不同含量的甲酸進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80%乙腈中加入0.2%甲酸提取效率高，達(dá)到95%。為除去仿刺參體腔液的水分，加入無(wú)水硫酸鈉和氯化鈉，促使待測(cè)物由水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相。經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化試驗(yàn)，得到最佳的提取條件為10 mL 80%乙腈+0.2%甲酸、4 g無(wú)水硫酸鈉、1 g氯化鈉。

圖2 不同提取溶劑對(duì)皮質(zhì)醇提取效率

3.4 凈化條件的優(yōu)化

由于樣品基質(zhì)中蛋白質(zhì)和脂類含量較為豐富，干擾組分多，對(duì)凈化方法要求較高，液—液凈化法及基質(zhì)固相分散法難以達(dá)到凈化要求，其提取液仍需進(jìn)一步凈化方可用于儀器檢測(cè)。因此本研究通過(guò)試驗(yàn)考察對(duì)比了Oasis HLB固相萃取柱、OasisPrime固相萃取柱、Captiva EMR-Lipid固相萃取柱和Bond Elut Plexa固相萃取柱的純化效果(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Oasis HLB固相萃取柱雖有一定的凈化效率，但比較費(fèi)時(shí)，需要經(jīng)過(guò)活化、平衡和淋洗3個(gè)步驟。OasisPrime固相萃取柱和Bond Elut Plexa固相萃取柱提取效率較低。只有Captiva EMR-Lipid固相萃取柱提取效率高，操作時(shí)間短，只需將提取溶液直接過(guò)柱，保持一定的速度，就能快速去除脂肪、磷脂等雜質(zhì)，減小基質(zhì)效應(yīng)，節(jié)省時(shí)間和溶劑。因此，選擇使用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱作為凈化小柱。

圖3 不同類型固相萃取柱提取皮質(zhì)醇的回收率

3.5 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)主要是由于樣品在離子化時(shí)基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物相互競(jìng)爭(zhēng)電離所致，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。在液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜定性定量分析中，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對(duì)儀器的靈敏度和重復(fù)性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。體腔液的組織成分復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、磷脂、氨基酸等大分子化合物，可能會(huì)抑制或增強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。本試驗(yàn)采用(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)的計(jì)算方法對(duì)皮質(zhì)醇的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)[22]。當(dāng)結(jié)果為正值時(shí)表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，結(jié)果為負(fù)值時(shí)表示基質(zhì)抑制效應(yīng)，絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。通常認(rèn)為，基質(zhì)效應(yīng)在±20%內(nèi)為不顯著[23]。根據(jù)計(jì)算得知，仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇的基質(zhì)效應(yīng)為-15.3%，說(shuō)明皮質(zhì)醇存在基質(zhì)效應(yīng)，但影響不顯著，因此，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇相應(yīng)空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制校正曲線來(lái)進(jìn)行定量分析。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)合固相萃取前處理技術(shù)，建立了仿刺參體腔液中皮質(zhì)醇超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，靈敏度和精密度較高，符合仿刺參體腔液皮質(zhì)醇低含量檢測(cè)的要求，為進(jìn)一步研究仿刺參的應(yīng)激能力和減少仿刺參病害提供技術(shù)支持。