王金林，王且魯，王萬良，曾本和，潘瑛子，周建設

( 西藏自治區(qū)農牧科學院 水產(chǎn)科學研究所，西藏 拉薩 850002 )

魚類腸道是消化吸收的重要器官，也是魚類與外界環(huán)境接觸面積最大的器官，而腸道菌群是腸道的重要組成部分，且對動物的免疫調節(jié)、代謝吸收也有重要影響[1-3]。脊椎動物腸道菌群以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門為主[4]。腸道菌群通過長期自然選擇，與宿主間形成了一個相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，從而增強宿主對有害環(huán)境的自我調節(jié)能力。目前已有研究表明，魚類腸道菌群的定殖主要與養(yǎng)殖水環(huán)境、飼喂餌料及魚卵表面中的細菌有關，其中養(yǎng)殖水環(huán)境和飼喂的餌料為主要因素[5]。腸道菌群分泌的酶可以幫助宿主分解食物增強營養(yǎng)的消化吸收，其分泌的抗生素類物質則可阻止病原微生物的侵入。通過對腸道菌群結構特點的研究，可為減少魚類病害的發(fā)生提供一定的理論參考數(shù)據(jù)。

傳統(tǒng)腸道菌群結構的分析研究方法包括傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、隨機擴增引物多態(tài)性分析(RAPD)[6]，這些方法的局限性在于無法鑒定豐度極小的微生物，從而導致研究結果與樣品中真正的菌群結構出現(xiàn)較大偏差。近年來，MiSeq高通量測序技術應運而生，該技術基于細菌16S rRNA基因在功能上的高度保守型及對應序列不同位點的高變性，在保守區(qū)設計通用引物PCR擴增然后對高變區(qū)進行測序分析和菌種鑒定[7-8]。這種方法克服了傳統(tǒng)方法的局限性，對生物物種之間的親緣關系和差異有了較為準確的分析。該測序技術可同時定量分析多個樣本中的群落結構，從而真實全面地反映微生物群落結構的基本特征[9]。

異齒裂腹魚(Schizothoraxo′connori)隸屬鯉形目、鯉科、裂腹魚亞科、裂腹魚屬，別名異齒弓魚。其腹部肛門附近具有特化形成裂隙的成排鱗片，即“裂腹”由來[10]。異齒裂腹魚分布于雅魯藏布江上、中游的干支流及附屬水體，營底棲生活，在干支流水質清澈、礫石底質的河道處活動，為產(chǎn)區(qū)主要經(jīng)濟魚類之一。異齒裂腹魚生長緩慢、性成熟晚且繁殖力低，因此對過度捕撈和環(huán)境破壞較為敏感[10]。筆者以野生和人工養(yǎng)殖的異齒裂腹魚為試驗對象，研究兩種異齒裂腹魚腸道菌群結構的異同，以期為減少異齒裂腹魚養(yǎng)殖過程中病害的發(fā)生提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

試驗用異齒裂腹魚野生組采自雅魯藏布江日喀則江段，體質量(1.00±0.13) kg。人工養(yǎng)殖組為水泥池馴化養(yǎng)殖3年的異齒裂腹魚，體質量(1.00±0.20) kg。兩組魚體質健壯、體表完好，可用于試驗。

1.2 樣品采集方法

野生組和人工養(yǎng)殖組各取5尾異齒裂腹魚，于無菌環(huán)境下，用解剖剪剪開異齒裂腹魚體腔，取出腸道，用無菌的生理鹽水沖洗腸道外壁及內容物。樣品采集后進行分類編號保存，寄至上海美吉生物公司進行DNA提取和MiSeq高通量測序分析。兩組樣品DNA提取完成后，分別將兩組DNA樣品進行混合，然后分類編號，其中野生組異齒裂腹魚為Y1、Y2、Y3，人工養(yǎng)殖組異齒裂腹魚為C1、C2、C3。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析以每個樣品中的運算分類單元作為分類和計算的依據(jù)。根據(jù)不同的相似度水平，對所有的序列進行運算分類單元劃分，在97%的相似水平下的運算分類單元進行生物信息統(tǒng)計分析。16S細菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫使用Silva數(shù)據(jù)庫(Release128 http：∥www.arb-silva.de)。設置差異顯著水平為0.05，當P<0.05時表示差異顯著，P≥0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 樣品序列數(shù)目

人工養(yǎng)殖組C1、C2、C3和野生組Y1、Y2、Y3測得的序列條數(shù)分別為47 068、46 869、40 417、43 194、39 942和46 791(表1)，序列平均長度約為435 bp，符合高通量測序要求。

表1 樣品序列數(shù)統(tǒng)計表

2.2 菌群多樣性分析

2.2.1 稀釋性曲線

以97%相似性水平為標準劃分可操作分類單元運算分類單元，其中人工養(yǎng)殖組C1、 C2、C3和野生組Y1、Y2、Y3樣品運算分類單元數(shù)據(jù)分別可劃分為302、259、263、751、469、313?；陔S機選取一定數(shù)量的測序序列及其對應的運算分類單元種類得到的稀釋性曲線，當序列數(shù)達到10 000～40 000時曲線趨于平坦(圖1)，通過對樣品數(shù)據(jù)進行抽平分析，6組樣品的取樣條數(shù)為44 046，表明C1、C2、C3和Y1、Y2、Y3 6組樣品數(shù)據(jù)可靠，測序數(shù)量接近飽和，能夠真實有效地反映樣品中優(yōu)勢細菌的數(shù)量關系。

圖1 稀釋性曲線

2.2.2 菌群結構多樣性指數(shù)分析

通過測序序列計算出6個異齒裂腹魚中細菌多樣性指數(shù)(表2)，6組樣品的覆蓋率均超99%，表明數(shù)據(jù)測序完整；其中Y1樣品的香農指數(shù)最大為5.46，辛普森指數(shù)最小為0.01，說明在野生組異齒裂腹魚Y1樣品魚中腸道的細菌多樣性最高。對野生組和人工養(yǎng)殖組組間多樣性指數(shù)差異進行t檢驗(表3)，得到豐富度指數(shù)Chao(用來估計樣品中所含運算分類單元數(shù)目)和Ace(用來估計群落中運算分類單元數(shù)目)，多樣性指數(shù)香農指數(shù)(用來估算樣品中微生物多樣性)和辛普森指數(shù)(用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性)的P>0.05，即野生和人工養(yǎng)殖兩種模式下異齒裂腹魚腸道菌群的豐富度和多樣性差異不顯著。

表3 野生組和人工養(yǎng)殖組組間差異檢驗數(shù)據(jù)

表2 基于16S rRNA基因序列的細菌多樣性指數(shù)

2.3 菌群結構組成

根據(jù)分類結果，在6個異齒裂腹魚腸道樣品中檢測到的細菌歸屬于25個門、54個綱、111個目、219個科、393個屬，主要門類有變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、藍細菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門、衣原體門和軟壁菌門。異齒裂腹魚野生組中Y1樣品中含有10個門類細菌，其中優(yōu)勢菌群為放線菌門(53.89%)，次優(yōu)勢菌群為厚壁菌門(14.87%)；Y2樣品中含有8個門類細菌，其中優(yōu)勢菌群為變形菌門(70%)，次優(yōu)勢菌群為梭桿菌門(15.61%)，未發(fā)現(xiàn)擬桿菌門和軟壁菌門；Y3樣品中含有6個門類細菌，其中優(yōu)勢菌群為變形菌門(94.82%)，次優(yōu)勢菌群為厚壁菌門(1.93%)，未發(fā)現(xiàn)綠彎菌門、疣微菌門、衣原體門和軟壁菌門；C1樣品中含有9個門類細菌，其中優(yōu)勢菌群為藍細菌門(61.19%)，次優(yōu)勢菌群為變形菌門(28.57%)；C2樣品中含有9個門類細菌，其中優(yōu)勢菌群為變形菌門(52.78%)，次優(yōu)勢菌群為藍細菌門(37.26%)；C3樣品中含有9個門類細菌，其中優(yōu)勢菌群為藍細菌門(69.97%)，次優(yōu)勢菌群為變形菌門(24.31%)(表4)，在人工養(yǎng)殖組的3個樣品中均未發(fā)現(xiàn)軟壁菌門。

表4 樣品優(yōu)勢細菌門類及相對豐度 %

通過對不同樣品中所含菌群豐度最高的10個運算分類單元進行分析，有助于了解樣品中所含的主要細菌類型，因此依據(jù)每個樣品中相對豐度最高的前10種運算分類單元在屬水平上對每個樣品的菌群結構及分布進行統(tǒng)計分析(圖2)。其中，Y1中可分類的細菌主要是微球菌屬(Micrococcaceae)(4.9%)、暗黃類諾卡氏菌(Nocardioidesfulvus)(3.7%)、微桿菌屬(Microbacterium)(3.7%)、藍細菌(2.1%)、鯨桿菌屬(Cetobacterum)(1.3%)、氣單胞菌屬(Aeromonas)(1.1%)、紅桿菌科(0.6%)和希瓦氏菌屬(Shewatiella)(0.6%)；Y2中可分類的細菌主要是氣單胞菌屬(49%)、鯨桿菌屬(14.8%)、希瓦氏菌屬(9%)、紅桿菌科(0.8%)、FukuN57(0.8%)、α-變形細菌綱(0.15%)、微球菌屬(0.6%)和暗黃類諾卡氏菌(0.3%)；Y3中可分類的細菌主要是氣單胞菌屬(92%)、希瓦氏菌屬(0.3%)和微球菌屬(0.1%)；C1中可分類的細菌主要是藍細菌(59%)、紅桿菌科(12.2%)、FukuN57(8%)、瘦鞘絲藻屬(Leptolyngbya)(1.2%)、α-變形細菌綱(1.2%)、鯨桿菌屬(0.7%)、玫瑰球菌屬(Roseococcus)(0.7%)和Subsection Ⅲ(0.5%)；C2中可分類的細菌主要是FukuN57(19%)、藍細菌(16%)、瘦鞘絲藻屬(15%)、紅桿菌科(12.1%)、Subsection Ⅲ(5.2%)、玫瑰球菌屬(4.2%)、α-變形細菌綱(4.2%)和希瓦氏菌屬(0.8%)；C3中可分類的細菌主要是藍細菌(70%)、紅桿菌科(10%)、FukuN57(5.9%)、玫瑰球菌屬(1.1%)、α-變形細菌綱(1%)、單胞菌屬(0.8%)、瘦鞘絲藻屬(0.5%)、鯨桿菌屬(0.4%)和Subsection Ⅲ(0.1%)。

圖2 樣品種屬水平細菌種群結構分布

2.4 基于運算分類單元數(shù)量的腸道菌群結構組成和系統(tǒng)進化樹

通過在門、屬的分類水平上對異齒裂腹魚腸道內菌群結構進行分析，結果表明，在野生和人工養(yǎng)殖條件下，異齒裂腹魚的優(yōu)勢菌種有所不同?；谝吧M和人工養(yǎng)殖組中全部運算分類單元作韋恩圖(圖3)，比較兩種養(yǎng)殖條件下樣品間的差異。異齒裂腹魚腸道樣品有效運算分類單元總數(shù)為930，兩種養(yǎng)殖模式下異齒裂腹魚腸道共有運算分類單元數(shù)為258個，人工養(yǎng)殖組特有的運算分類單元數(shù)為98個，野生組特有的運算分類單元數(shù)為574個。可見在野生和人工養(yǎng)殖兩種條件下，異齒裂腹魚的腸道內均具有一定比例的特有菌群。

圖3 兩種養(yǎng)殖模式下異齒裂腹魚腸道共有運算分類單元分析

由樣品聚類樹(圖4)可以看出，野生組和人工養(yǎng)殖組的異齒裂腹魚的腸道菌群進化關系較遠，說明野生和人工養(yǎng)殖條件下異齒裂腹魚腸道菌群結構相似度較低，存在一定的差異。

圖4 樣品聚類樹

3 討 論

3.1 野生與養(yǎng)殖異齒裂腹魚腸道菌群的豐富度和多樣性差異

腸道是營養(yǎng)物質消化吸收的場所，魚類不同的生理狀態(tài)會形成不同的菌群結構，而不同的菌群結構會影響異齒裂腹魚的生理狀態(tài)。本次研究的6個樣品基于Illumina MiSeq平臺高通量測序分析，比較了異齒裂腹魚在野生和人工養(yǎng)殖兩種模式下的腸道菌群結構。通過對樣品序列數(shù)目分析，可得6個樣品的有效序列數(shù)為39 942～47 068，可歸為259～751個運算分類單元；通過對樣品菌群多樣性分析，可知本次試驗數(shù)據(jù)可靠，能夠真實有效地反映出樣品中優(yōu)勢細菌的數(shù)量關系，野生和人工養(yǎng)殖異齒裂腹魚腸道菌群的豐富度和多樣性差異不顯著。關于淡水魚類腸道菌群結構已有諸多報道[11-13]，李學梅等[14]發(fā)現(xiàn)，在相同飼料和水環(huán)境條件下，銀鯽(Carassiusauratusgibelio)和異育銀鯽的腸道微生物群落結構無顯著差異，二者腸道微生物群落結構與斑點叉尾(Ictaluruspunctaus)差別較大；王琴等[15]發(fā)現(xiàn)，鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙魚(Aristichthysnobilis)腸道菌群結構相似性較高，匙吻鱘(Polyodonspathala)與鰱魚、鳙魚的腸道菌群相似性低。

3.2 野生與養(yǎng)殖異齒裂腹魚腸道菌群的組成結構分析

本研究結果顯示，MiSeq高通量測序技術準確分析了異齒裂腹魚在兩種養(yǎng)殖模式下腸道菌群結構的不同，克服了常規(guī)分離細菌培養(yǎng)的限制。對高通量測序結果進行分析，本研究結果顯示，野生組異齒裂腹魚腸道的優(yōu)勢菌群是氣單胞菌屬、微球菌屬和微桿菌屬；人工養(yǎng)殖組腸道優(yōu)勢菌群是藍細菌和紅桿菌。有研究表明魚類腸道細菌群落的形成受水中細菌、餌料等影響[16]，而有關魚類腸道細菌與養(yǎng)殖環(huán)境中細菌之間的關系尚未明確。Cahill[17]認為，腸道菌群是環(huán)境或餌料中存在并且能在腸道內繁殖的細菌群落。Munro等[18]認為，魚類腸道菌群的主要來源是所攝取的活餌料而不是養(yǎng)殖水體。相反，部分研究結果表明，魚類腸道菌群與飼料和水中的細菌并不相同[19]。異齒裂腹魚為雜食性偏植食性魚類[20]，人工馴化后異齒裂腹魚能夠形成一定的攝食習性。陳孝煊等[21]指出，水體的鹽度、水溫、微生物種類、魚類攝食的餌料及魚類不同的生理狀態(tài)和不同發(fā)育階段都會影響魚類消化道菌群結構的形成，水體中的菌群也會對魚類的消化道菌群結構造成直接影響[22-23]；王建建等[24]在對野生和養(yǎng)殖銀鯧(Pampusargenteus)消化道菌群結構分析發(fā)現(xiàn)，兩者菌群結構存在明顯差異；Holben等[25]也發(fā)現(xiàn)，由于不同的生長環(huán)境，養(yǎng)殖型和野生型鮭魚腸道菌群結構存在明顯差異；李可俊等[26]對長江河口8種野生魚類的腸道內菌群多樣性分析比較后發(fā)現(xiàn)，生活在不同水層及同水層但食性不同的魚類其腸道菌群結構存在較大差異。由此可推測，異齒裂腹魚的腸道菌群結構隨養(yǎng)殖環(huán)境的差異而發(fā)生改變。

本研究通過對兩種養(yǎng)殖模式下異齒裂腹魚腸道菌群結構的深入分析，對異齒裂腹魚腸道菌群的結構、優(yōu)勢菌群及多樣性有了一定認識，研究結果可為異齒裂腹魚的健康養(yǎng)殖及人工養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)調控技術構建提供理論依據(jù)。