臧小豪，劉起發(fā)，胡蒙蒙，常媛媛，肖清煒，周 渭

（廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院，廣州 廣東 510006）

目前隨著社會進(jìn)步以及老年人口比例和數(shù)量不斷增多，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病已成為影響人類人口健康水平和生活質(zhì)量的重大社會問題。中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是指一組由慢性進(jìn)行性的中樞神經(jīng)組織退行性變性而產(chǎn)生的疾病的總稱。在病理上有腦或脊髓發(fā)生神經(jīng)元退行變性、丟失。主要疾病包括帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)、亨廷頓病(Huntington Disease，HD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)等[1]。研究表明，神經(jīng)炎癥貫穿神經(jīng)退行性疾病的整個(gè)發(fā)病過程。在正常的生理狀態(tài)下，神經(jīng)炎癥會有助于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)，而當(dāng)炎癥反應(yīng)過度時(shí)，反而會造成細(xì)胞的損傷。細(xì)胞損傷時(shí)又會誘發(fā)炎癥因子的釋放，形成惡性循環(huán)，加速神經(jīng)退行性疾病的惡化[2]。神經(jīng)炎癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關(guān)，因此神經(jīng)炎癥的成像對認(rèn)知、治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病具有重要意義。

神經(jīng)炎癥的檢測離不開活體成像技術(shù)，活體成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學(xué)方法，對活體生物進(jìn)行組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究?；铙w成像技術(shù)主要分為可見光成像(Optical Imaging)、核素成像、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)、計(jì)算機(jī)斷層攝影(Computed Tomography，CT)成像和超聲(ultrasound)成像5大類[3]。

可見光成像有低能量、無輻射、對信號檢測靈敏度高，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測標(biāo)記活體生物的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用到監(jiān)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)、感染的進(jìn)展、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、病毒感染和藥學(xué)研究中[4]。幾種熒光顯微鏡技術(shù)已用于體外、體內(nèi)細(xì)胞的觀察，如多光子顯微技術(shù)、激光顯微共聚焦技術(shù)等。正電子發(fā)射斷層成像技術(shù)(Positron Emission Tomography，PET)和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù) (Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT)是核醫(yī)學(xué)常用的2種顯像技術(shù)[5]。PET除了具有無創(chuàng)傷、可持續(xù)觀察的優(yōu)點(diǎn)外，還具有下列顯著的優(yōu)勢：(1)標(biāo)記的廣泛性，有關(guān)生命活動的小分子、小分子藥物、配體、抗體等都可以被標(biāo)記；(2)絕對定量；(3)具有很高的靈敏度；(4)可獲得斷層及三維信息，實(shí)現(xiàn)較精確的定位；(5)小動物PET、SPECT可以動態(tài)地獲得秒數(shù)量級的動力學(xué)資料；(6)可推廣到人體[6]。其他的成像技術(shù)，如CT、MRI和超聲等，雖然有較高的空間分辨率，但它們的缺點(diǎn)是直到組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了變化才能檢測到疾病，對疾病的敏感性較低，疾病通常到了中晚期才能發(fā)現(xiàn)；可見光成像、核素成像則能通過分子和細(xì)胞的變化來檢測到疾病，在疾病組織結(jié)構(gòu)變化之前就可以通過核素成像被檢測到，但這些技術(shù)也存在一些不足，如空間分辨率較低，結(jié)構(gòu)信息不足等問題[7]。

1 神經(jīng)炎癥的標(biāo)志物

當(dāng)神經(jīng)炎癥發(fā)生的時(shí)候，小膠質(zhì)細(xì)胞會出現(xiàn)異?；罨Ｑ芯勘砻?，18KDa轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Translocator Protein ，TSPO）、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase ，MMPs）、大麻素2受體（Cannabinoid Receptor Type2，CB2）等在靜息小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)很低，而在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中卻呈現(xiàn)高表達(dá)，這使得它們成為反映小膠質(zhì)細(xì)胞活化的一種敏感而特異的定量指標(biāo)[8]。在神經(jīng)炎癥的分子影像學(xué)研究中，以TSPO的研究最為廣泛和深入。TSPO即外周苯二氮卓受體(PBR)第一亞單位，是一種18kDa疏水蛋白，主要定位于線粒體外膜，它的一個(gè)重要作用是促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝[9]。TSPO在正常腦組織中表達(dá)水平很低，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活時(shí)，TSPO表達(dá)明顯增加，是反映小膠質(zhì)細(xì)胞活化的敏感的生物指標(biāo)[10]。這一特性決定了其可作為檢測神經(jīng)炎癥的靶點(diǎn)。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)CB2、MMPs等也可以作為核素顯像的靶點(diǎn)，但針對這些靶點(diǎn)的分子成像技術(shù)還有待進(jìn)一步開發(fā)[11]。

2 TSPO特異性配體

TSPO特異性配體主要有以下幾類：異喹啉類(PK11195)、吲哚草酰胺類(IND-18)、苯氧苯基乙酰胺類(PBR28)、咪啶并吡啶類(CLINDE)、吡唑并吡啶類(VUIIS1008)、2-芳基-8-氧化嘌啉類(AC-5216)，其中PK11195被公認(rèn)為TSPO配體的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但它仍存在腦滲透能力低和動力學(xué)行為高度可變等不足[12]。出于這些原因，人們后續(xù)不斷開發(fā)了具有更高的親和力、適宜的親脂性，以及更為合適的動力學(xué)行為的TSPO配體及探針。

2.1 異喹啉類

[1-(2-氯苯)-N-甲基-N-異丙基-3-異奎寧羰酰](PK11195)，是第一個(gè)被證實(shí)對TSPO有高親和性的非苯并二氮卓類化合物。鼠腎膜和(3H)PK11195的親和性研究顯示，PK11195對(3H)PK11195的Ki值為9.3 nmol/L[13]。11C-PK11195是TPSO的第一代放射性配體，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。在20世紀(jì)80年代，11CPK11195被用作正電子發(fā)射斷層掃描(PET)示蹤劑以標(biāo)記人和小鼠模型中的神經(jīng)炎癥。研究表明，雖然11C-PK11195成像提供了大量小膠質(zhì)細(xì)胞活化的信息，但由于11C-PK11195的信噪比和特異性較低，且半衰期較短(20 min)，11C-PK1195并不是很理想的PET示蹤劑[14]。接下來，Bornhop的研究小組通過己二胺間隔物將PK11195的類似物與Lissamine-Rhodamine B染料綴合得到熒光探針(Liss-ConPK11195)[15]。乳腺癌細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的結(jié)合研究顯示Liss-ConPK11195能特異性結(jié)合TSPO。雖然在MS，AD和PD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中，血腦屏障受損，但至少還有部分能起作用，由于熒光探針的高分子量和高氫鍵電位，仍不能穿過血腦屏障。為了開發(fā)動力學(xué)行為更為合適的TSPO配體，許多構(gòu)象限制的PK11195衍生物被合成出來。初步的研究顯示化合物VC195與PK11195相比有更高的腦滲透性和專一性[16]。但活體評價(jià)后發(fā)現(xiàn)，這些衍生物并沒有改進(jìn)親和性和動力學(xué)行為，因此很快被淘汰。為了獲得更好的特異性結(jié)合，CiroMilite等[17]又報(bào)告了一系列喹唑啉-2-甲酰胺衍生物的研究?；衔顴R176(N，N-二正己基-4-苯基喹唑啉-2-甲酰胺)是該系列中最有效的配體，其Ki值為0.7 nmol/L。盡管在結(jié)構(gòu)上與異喹啉甲酰胺PK11195相似，但這些喹唑啉衍生物具有更好的藥效性，與異喹啉甲酰胺有相當(dāng)?shù)挠H脂性，但有更高的親水性及水溶性。隨后該課題組又開發(fā)評估了具有高特異性和有吸引力的光譜性質(zhì)的新型熒光探針(化合物2，見圖1)標(biāo)記TSPO配體的可行性，與核素標(biāo)記相比，摻入熒光探針的配體更安全、快速且更便宜地實(shí)現(xiàn)對TSPO成像。對生物靶標(biāo)高的結(jié)合親和力不是開發(fā)有效藥理學(xué)工具和藥物的唯一要求，新的證據(jù)表明，表征配體結(jié)合性能的關(guān)鍵因素之一是停留時(shí)間(Residence Time，RT)，即配體與其靶標(biāo)相互作用的時(shí)間。ER176的熒光探針的RT值為(53±7)min，表明其具有良好的藥物代謝動力學(xué)特征[18]。隨后評估探針在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U343中特異性標(biāo)記TSPO的能力，探針在3 μmol/L的時(shí)候能被清晰檢測到，因此，ER176探針能在U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞中特異性標(biāo)記線粒體水平的TSPO。

圖 1 異喹啉類配體及探針Fig.1 Isoquinoline ligands and probes

2.2 吲哚草酰胺類

有一類采用Fischer吲哚合成法的TSPO配體，命名為2-芳基-3-吲哚乙酰胺(FGIN-1)。這些衍生物能增強(qiáng)類固醇的生成，而且對TSPO有極高的選擇性，對甘氨酸、谷氨酸、5-羥色胺和γ-氨基丁酸等相關(guān)受體親和性很低[19]。這類先導(dǎo)化合物是N,N-二正己基-2-(4-氟苯基)吲哚-3-酰胺(FGIN-1-27，見圖2)，對TSPO有極高的親和性(Ki=5.0 nmol/L，用(3H)PK11195取代研究)。這類化合物的配體都比PK11195的親脂性要高，因此，這也會影響體內(nèi)代謝。Kozikowski等[20]完成了與TSPO配體連接的TSPO熒光探針的第一個(gè)實(shí)例，合成了熒光探針(化合物3，見圖2)，其中吲哚乙酰胺部分(即TSPO配體FGIN-1-27)通過己二胺間隔物與7-硝基苯并呋咱(NBD)染料連接。所得探針在納摩爾水平顯示出結(jié)合親和力，并且非常接近于表征的C6-2B大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的PK11195的結(jié)合親和力。已證實(shí)化合物3在受檢細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)上產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光斑，與TSPO的線粒體定位一致。但由于探針3的高分子量，應(yīng)該不能穿過血腦屏障。在FGIN-1衍生物成功開發(fā)成為高親和性TSPO配體之后，一系列類似物被合成出來，包括吲哚草酰胺衍生物。這類新配體大多數(shù)對TSPO顯示高親和性，其Ki值在納摩爾和亞納摩爾范圍。這類配體中親和性最高的是IND-18，其Ki值是0.37 nmol/L(同樣條件下PK11195是9.3 nmol/L)[21]，Sabrina Taliani等[22]開發(fā)了新的熒光分子探針(化合物4，見圖2)，能有效地區(qū)分中樞苯甲二氮卓受體，是TSPO的特異性熒光探針，有著不錯(cuò)的親和力(Ki=(12±1) nmol/L)。熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示，探針在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中特異性標(biāo)記了線粒體水平的TSPO。

圖 2 吲哚草酰胺類配體及探針Fig.2 Valeric acid amide ligands and probes

2.3 苯氧苯基乙酰胺衍生物

兩種苯氧苯基-乙酰胺衍生物，N-(4-氯-2-苯氧苯基)-N-(2-異丙氧芐基)乙酰胺(DAA1097，見圖3)和N-(2,5-二甲氧芐基)-N-(5-氟-2-苯氧苯基)乙酰胺(DAA1106，見圖3)，通過打開Ro5-4864安定環(huán)產(chǎn)生[23]。這些配體對TSPO都有極高的選擇性和親和性，對其他神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體和第二信使等類型配體只有微弱的親和性。DAA1097和DAA1106顯示出抑制(3H)PK11195結(jié)合到鼠腦的線粒體IC50值分別為0.92和0.28 nmol/L(同樣條件下，PK11195的IC50=1.12 nmol/L。在一項(xiàng)獨(dú)立研究中，DAA1106在猴腦和鼠腦線粒體中評價(jià)，結(jié)果表明該配體無種屬依賴性，對猴腦和鼠腦均有高的親和性，Ki值分別為0.188和0.043 nmol/L[24]。使用3種不同的神經(jīng)炎癥模型直接比較脂多糖(LPS)和6-羥基多巴胺的內(nèi)部紋理損傷以及創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型，阻塞研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異，這表明與DAA1106相比，PK11195并未完全取代[11C]DAA1106[25]。 在隨后的工作中，同一研究小組通過不同的二胺間隔物(3～9個(gè)碳連接子)將DAA1106的類似物與IRDye800CW(NIR熒光染料)和Lissamine-Rhodamine B綴合，評估了間隔物長度對TSPO親和力的影響，并且發(fā)現(xiàn)NIR6T和Liss6T(化合物5和6，見圖3)以己二胺為間隔物有著最佳的親和力。NIR6T和Liss6T在納摩爾范圍內(nèi)顯示對TSPO的結(jié)合親和力(IC50為0.24和0.0051 μmol/L)，并用于C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的FM成像研究。與NIR6T和Liss6T一起溫育的這些細(xì)胞通過FM研究顯示在線粒體水平上兩種藥物的積累，而與游離染料(IRDye800CW酸和Lissamine-Rhodamine B磺酰氯)溫育時(shí)，沒有顯示明顯的熒光[26]。因此NIR6T和Liss6T可以被認(rèn)為是FM用于TSPO成像的有前途的藥物。在人類受試者研究中，[11C]DAA1106的動力學(xué)性質(zhì)并不理想，隨后有人嘗試從芳氧基苯胺類中開發(fā)出更適宜的腦滲透性TSPO配體，合成并評估了N-(2-甲氧基芐基)-N-(4-苯氧基吡啶-3-基)乙酰胺(PBR28)。在猴腦研究中表明，[11C]PBR28有著更低的親脂性、更有利的體內(nèi)動力學(xué)，以及更高的特異性結(jié)合[27]。隨后在人類受試者研究中，用[11C]PBR28驗(yàn)證阿爾茨海默病患者TSPO結(jié)合是否升高，TSPO結(jié)合是否與神經(jīng)心理測量、灰質(zhì)體積等相關(guān)。結(jié)果顯示，通過增加[11C]PBR28與TSPO的結(jié)合表明神經(jīng)炎癥發(fā)生在輕度認(rèn)知障礙轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ『螅㈦S著疾病進(jìn)展而惡化[28]。

圖 3 苯氧苯基乙酰胺類配體及探針Fig.3 Phenoxyphenylacetamide ligands and probes

2.4 咪唑并吡啶類

咪唑并吡啶類的阿吡坦(Alpidem，見圖4)，其對PBR和CBR都有納摩爾親和性，Ki分別為0.5～7 nmol/L和1～28 nmol/L[29]。這一系列的先導(dǎo)化合物，N,N-二-正-丙基-2-(4-氯苯基)-6,8-二氯咪唑并吡啶-3-乙酰胺(CB34，見圖4)同(3H)PK11195一起競爭結(jié)合小鼠大腦皮層的膜蛋白，顯示的IC50值為1.05 nmol/L(同樣的評價(jià)中PK11195為IC50=1.43 nmol/L)[30]。通過碘苯基團(tuán)取代一系列6-氯的咪唑并吡啶進(jìn)行放射性標(biāo)記，其中一種化合物[123I]CLINDE(見圖4)用于實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠的脊髓切片的離體放射自顯影[31]。[123I]CLINDE在脊髓中的攝取隨著疾病的嚴(yán)重程度增大而增加。放射性的空間分布與使用免疫組織化學(xué)檢測的浸潤巨噬細(xì)胞的水平一致，并且PK11195預(yù)處理可以抑制攝取的增加。后續(xù)研究結(jié)果表明，[123I]CLINDE評估GL26小鼠膠質(zhì)瘤的SPECT成像的可行性，并強(qiáng)調(diào)了其臨床膠質(zhì)瘤SPECT成像的潛力[32]。

圖 4 咪唑并吡啶類配體及探針Fig.4 Imidazopyridine ligands and probes

2.5 吡唑并吡啶類

吡唑并吡啶源于咪唑并吡啶，因此結(jié)構(gòu)上和阿吡坦相似，然而吡唑并吡啶類比阿吡坦對TSPO顯示出高的親和性和選擇性[33]。這類中有潛力的配體為(N,N-二乙基-I-(2-(4-甲氧苯基)-5,7-二甲基-吡唑并吡啶乙酰胺(DPA-713，見圖5)，對TSPO的親和力Ki達(dá)到4.7 nmol/L。DPA-713被合成出來后，緊接著在狒狒腦中進(jìn)行核素標(biāo)記，結(jié)果表明，狒狒中[11C]DPA-713的積累代表了與PBR的選擇性結(jié)合[34]。這些特殊的體內(nèi)結(jié)合特性表明[11C]DPA-713可用于在疾病狀態(tài)下對TSPO成像。在此基礎(chǔ)上開發(fā)了新的TSPO配體[18F]DPA-714(見圖5)，與[11C]DPA-713相比，小鼠體內(nèi)代謝更慢一些，小鼠癌癥和炎癥的外周病變的PET成像未顯示顯著的病變?背景信號比率[35]。另一個(gè)課題組，在改進(jìn)工作中合成另一個(gè)高效的TSPO配體(VUIIS1008，見圖5)，親和力與DPA-714相比提高了36倍[36]。為了使其可視化、更經(jīng)濟(jì)和方便，開發(fā)了一系列具有附加FITC的新TSPO探針，通過常規(guī)光學(xué)測量和顯微鏡可以直接檢測。最佳候選探針(化合物7，見圖5)具有優(yōu)異的TSPO親和力(Ki=0.31 nmol/L)和可忽略的中心苯并二氮雜受體(CBR)活性，表現(xiàn)出合適的體外成像和高的靶標(biāo)特異性。這是目前已報(bào)告的TSPO熒光探針的最高親和力。在細(xì)胞成像中，進(jìn)一步證實(shí)化合物7與TSPO配體PK11195結(jié)合相同的結(jié)合位點(diǎn)[37]。然而它們在人類體內(nèi)的量化還會受到多個(gè)復(fù)雜的因素影響[38]。

圖 5 吡唑并吡啶類配體及探針Fig.5 Pyrazolopyridine ligands and probes

2.6 2-芳基-8-氧化嘌啉衍生物

2-芳基-8-氧化嘌啉衍生物(AOP，見圖6)，其典型代表是AC-5216(見圖6)[39]，在體外結(jié)合試驗(yàn)中，大鼠全腦的Ki=0.297 nmol/L、大鼠膠質(zhì)細(xì)胞的IC50=3.04 nmol/L、人類膠質(zhì)細(xì)胞IC50=2.73 nmol/L，對不同來源的TSPO結(jié)合能力雖有不同，但無物種依賴性[40]。進(jìn)一步研究表明，AC-5216可通過刺激TSPO，增加神經(jīng)甾體孕酮的合成而產(chǎn)生抗焦慮作用，同時(shí)沒有催眠、健忘等副作用。更令人興奮的是，AC-5216沒有明顯停藥反彈癥狀，因此，AC-5216在治療焦慮和抑郁方面是最有前景的化合物[41]。

圖 6 2-芳基-8-氧化嘌啉類配體Fig.6 2-aryl-8-oxo porphyrin ligand

3 總結(jié)與展望

中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是當(dāng)前世界上最難攻克的疾病之一，它的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，伴隨著神經(jīng)炎癥的發(fā)生。因此，神經(jīng)炎癥的可視化就顯得尤為重要。在神經(jīng)炎癥的眾多靶點(diǎn)中，TSPO的研究最為廣泛與深入。本文介紹了TSPO的一些重要配體與分子探針，其中PK11195不僅作為TSPO配體的金標(biāo)準(zhǔn)，而且在抗炎癥和增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)甾體方面也有一定作用。當(dāng)然，由于其活體內(nèi)高親脂性和非專一性親和性等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制限了PK11195的用途。吲哚草酰胺、咪唑并吡啶、苯氧苯基乙酰胺、2-芳基-8-氧化嘌啉衍生物和吡唑并吡啶類是有希望的配體，這5類配體顯示出血腦屏障可滲透性、體內(nèi)高的親和性、專一性，符合活體動物腦部TSPO成像的先提條件。目前已有不少關(guān)于TSPO核素成像的文獻(xiàn)報(bào)道，為神經(jīng)炎癥活體成像提供了一定的理論依據(jù)，但是基于TSPO的近紅外熒光探針卻未見報(bào)道，近紅外探針有更好的穿透性，還具有避免體內(nèi)自發(fā)熒光的干擾，更好的成像效果、更低的成本等優(yōu)勢，因此基于TSPO靶點(diǎn)的近紅外熒光探針是我們?nèi)蘸笱芯康闹攸c(diǎn)。TSPO作為公認(rèn)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的指標(biāo)，是檢測神經(jīng)炎癥的重要靶點(diǎn)之一，然而TSPO也并非檢測神經(jīng)炎癥的唯一指標(biāo)，除此之外還有MMPs[42]、CB2[43]、ROS[44]、COX2[45]、MPO[46]等靶點(diǎn)，在小膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí)呈現(xiàn)高表達(dá)。也有研究者開發(fā)了基于這些靶點(diǎn)的核素探針，為神經(jīng)炎癥的檢測擴(kuò)寬了思路，對后人開發(fā)新穎的分子探針有重要的借鑒意義。