管維康，王小云，陸 溫，張志林，鄭霞林

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧530004；2.特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北孝感432000；3.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北孝感432000)

植物揮發(fā)物是植物釋放的揮發(fā)性次生物質(zhì)，包括烴類、醇、醛、酮、酯、有機(jī)酸和萜烯類化合物，且不同植物含有的揮發(fā)物成分和含量及其比例均不相同。植食性昆蟲(chóng)在寄主選擇[1]、覓偶[2]和產(chǎn)卵[3]等過(guò)程中對(duì)植物揮發(fā)物有明顯的觸角電位和行為反應(yīng)。對(duì)于植食性昆蟲(chóng)而言(尤其是寡食性昆蟲(chóng))，能否成功定位寄主將影響其種群的生存和繁衍。例如，小菜蛾(Plutella xylostella L.)是一種寡食性害蟲(chóng)，其成蟲(chóng)對(duì)十字花科植物揮發(fā)物中的異硫氰酸酯類化合物有明顯的觸角電位反應(yīng)和趨向行為[4]，且成蟲(chóng)觸角上的異硫氰酸酯感受細(xì)胞在其寄主定位過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[5]。

朱紅毛斑蛾[Phauda flammans(Walker)]屬鱗翅目(Lepidoptera)毛斑蛾科(Phaudidae)，是榕樹(shù)上的一種重要食葉害蟲(chóng)。該蟲(chóng)在中國(guó)南方省份1 a發(fā)生2～3代，發(fā)育起點(diǎn)溫度低[6]，抗寒力強(qiáng)[7]，以第2代預(yù)蛹期幼蟲(chóng)及蛹和第3代低齡幼蟲(chóng)越冬，越冬幼蟲(chóng)喜在位于地表突出的根系附近或雜草叢下化蛹[8]。該蟲(chóng)成蟲(chóng)為日行性蛾類，在光期羽化、求偶、交配和產(chǎn)卵[9]，且卵多聚產(chǎn)于榕樹(shù)頂梢當(dāng)年生嫩葉上。成蟲(chóng)壽命4～5 d，一生僅交配1次且延遲交配會(huì)降低其繁殖力[10]。幼蟲(chóng)寡食性，僅以小葉榕(Ficus concinna Miq.)和垂葉榕(F.benjamina L.)葉片為食[11]，低齡幼蟲(chóng)啃食葉肉，留下白色膜狀的上表皮，而高齡幼蟲(chóng)取食后造成葉片缺刻或孔洞，甚至將整株葉片全部食光，食物短缺時(shí)還會(huì)取食嫩枝韌皮部，造成枝干枯死，連續(xù)多年危害可導(dǎo)致整株榕樹(shù)枯死，嚴(yán)重影響景觀效果和生態(tài)效益[8]。然而，尚不清楚這些寄主植物吸引該蟲(chóng)的植物揮發(fā)物活性成分，弄清該問(wèn)題可為篩選朱紅毛斑蛾植物源引誘劑提供基礎(chǔ)資料。鑒于此，本研究采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集榕樹(shù)葉片釋放的揮發(fā)物，并通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrum，GC-MS)、氣相色譜-觸角電位聯(lián)用(gas chromatography-electroantennographic detection，GC-EAD)和 “Y”型嗅覺(jué)儀技術(shù)，研究小葉榕和垂葉榕的植物揮發(fā)物中能吸引朱紅毛斑蛾成蟲(chóng)的活性成分。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與試劑 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890B-5975C，安捷倫科技有限公司，美國(guó))、氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀(7890B-IDAC4，安捷倫科技有限公司，美國(guó)；Syntech公司，德國(guó))、 “Y”型嗅覺(jué)儀(自制)、聚四氟乙烯管(上海匯荊機(jī)電設(shè)備有限公司，中國(guó))、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯塑料袋、流量計(jì)(LZB-3WB，常州愛(ài)德克斯儀器儀表有限公司，中國(guó))、孟氏洗氣瓶(BZ29/32，福建閩玻鋼化玻璃有限公司，中國(guó))、吸附管、氣泵(45W，森森集團(tuán)股份有限公司，中國(guó))、D-檸檬烯(純度90%，百靈威科技有限公司，中國(guó))、β-月桂烯(純度98%，成都埃法生物科技有限公司，中國(guó))、β-石竹烯(純度98%，成都埃法生物科技有限公司，中國(guó))、(-)-α-蒎烯(純度95%，成都埃法生物科技有限公司，中國(guó))、β-羅勒烯(純度90%，南寧國(guó)拓生物科技有限公司，中國(guó))、正己烷(純度98%，南寧國(guó)拓生物科技有限公司，中國(guó))。

1.1.2 供試蟲(chóng)源 2019年5月，在廣西壯族自治區(qū)南寧市東葛路(22°49′N，108°20′E)垂葉榕上采集朱紅毛斑蛾幼蟲(chóng)，帶回室內(nèi)置于塑料盒(直徑10 cm，高15 cm；10頭·盒-1)內(nèi)，在室溫條件下飼養(yǎng)，每日更換新鮮的垂葉榕葉片直至化蛹。根據(jù)茅裕婷等[12]提供的方法鑒別雌雄蛹，并分開(kāi)保存在不同的塑料盒內(nèi)，置于室溫下。待成蟲(chóng)羽化后，隨機(jī)選取1日齡健康的處女雌雄成蟲(chóng)作為供試蟲(chóng)源。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小葉榕和垂葉榕葉片揮發(fā)物的收集與鑒定 選取廣西大學(xué)校園(22°50′N，108°17′E)內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)良好、未噴灑化學(xué)藥劑且未受朱紅毛斑蛾為害的小葉榕和垂葉榕植株作為供試植物，采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集健康葉片揮發(fā)物。使用聚對(duì)苯二甲酸乙二酯無(wú)味透明塑料袋套住榕樹(shù)頂端葉片，袋的兩端留進(jìn)氣口和出氣口，使用聚四氟乙烯管連接，進(jìn)氣流量為300 mL·min-1，采氣流量為250 mL·min-1。進(jìn)氣端連接1.0 g吸附劑(PoraPak QS 80-100)過(guò)濾空氣，采氣端裝同等型號(hào)的吸附劑吸附植物揮發(fā)物。采集時(shí)間為9∶30—15∶30，同時(shí)采集3組，3個(gè)重復(fù)，采集結(jié)束后用2.5 mL的色譜純正己烷洗脫吸附管，并將洗脫液保存于-18℃低溫冰箱，檢測(cè)前在通風(fēng)櫥中揮發(fā)濃縮至100μL，待用。

GC-MS檢測(cè)條件:色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)，載氣為氦氣，進(jìn)樣量為2μL，恒流不分流模式，流速為1 mL·min-1；柱箱升溫程序:起始溫度50℃，保持1 min，5℃·min-1升溫至95℃，1℃·min-1升溫至99℃，5℃·min-1升溫至115℃，1℃·min-1升溫至119℃，5℃·min-1升溫至170℃，15℃·min-1升溫至250℃結(jié)束；EI離子源，電子能量70 eV，質(zhì)子掃描范圍50～550 amu，四級(jí)桿溫度為150℃，離子源溫度為230℃。各成分通過(guò)核對(duì)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(NIST 11.0)標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜圖進(jìn)行校對(duì)，參考夏尚文等[13]報(bào)道的榕樹(shù)揮發(fā)物成分，確定各色譜峰所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)，根據(jù)峰面積歸一法進(jìn)行定量。

1.2.2 朱紅毛斑蛾成蟲(chóng)對(duì)榕樹(shù)揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng) 測(cè)試樣品為小葉榕和垂葉榕植株健康葉片釋放的揮發(fā)物洗脫液。參照馬艷等[14]的研究方法，用手術(shù)剪將待測(cè)試蟲(chóng)的觸角于基部剪下，用昆蟲(chóng)針挑起觸角，將其兩端連接在涂有導(dǎo)電膠的電極上，將觸角放置在距離氣味管出口約1 cm處，持續(xù)氣流為300 mL·min-1。氣相色譜的條件同1.2.1。色譜柱出口接分流器，分流比為1∶1，分流的化合物一部分進(jìn)入氫焰離子化檢測(cè)器(FID)，另一部分經(jīng)過(guò)恒溫加熱套管吹向觸角，利用GC-EAD軟件，同步記錄氣相色譜和觸角電位圖，通過(guò)化合物的峰形和保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，從而鑒定出朱紅毛斑蛾雌雄蟲(chóng)觸角產(chǎn)生電位反應(yīng)的物質(zhì)。每頭雌雄成蟲(chóng)僅使用1根觸角，每根觸角僅測(cè)試1次，重復(fù)10次。

1.2.3 朱紅毛斑蛾成蟲(chóng)對(duì)榕樹(shù)揮發(fā)物的定向行為反應(yīng) 根據(jù)夏尚文等[13]研究，對(duì)揮發(fā)物進(jìn)行初步篩選，選取小葉榕和垂葉榕特有的揮發(fā)物進(jìn)行 “Y”型嗅覺(jué)儀試驗(yàn)，參照林方輝等[15]方法，研究朱紅毛斑蛾雌雄蟲(chóng)對(duì)這些揮發(fā)物活性成分的定向行為反應(yīng)?！癥”型嗅覺(jué)儀主臂長(zhǎng)30 cm，兩側(cè)臂長(zhǎng)20 cm，主臂和側(cè)臂內(nèi)徑均為4 cm，側(cè)臂間夾角為70°，側(cè)臂兩端分別與球形陷阱相連，氣流經(jīng)活性炭過(guò)濾器和蒸餾水瓶后，再經(jīng)球形陷阱進(jìn)入側(cè)臂，從主臂出來(lái)。測(cè)試時(shí)，用10μL移液槍吸取5μL揮發(fā)物樣品和液體石蠟分別滴在1 cm×2 cm的定性濾紙上，并分別置于兩臂連接球形陷阱中，以液體石蠟為對(duì)照。氣體流速控制在300 mL·min-1。每次僅釋放1頭朱紅毛斑蛾成蟲(chóng)，試驗(yàn)時(shí)先于引蟲(chóng)口適應(yīng)30 s后釋放，每頭成蟲(chóng)觀察5 min，進(jìn)入側(cè)臂一半以上則計(jì)為選擇，否則記為不選擇并更換成蟲(chóng)重新測(cè)試。每10頭為1組，重復(fù)5組。每測(cè)試5頭，調(diào)換兩側(cè)管壁位置，以消除環(huán)境影響。每測(cè)試1組，用酒精清洗裝置。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。雌雄成蟲(chóng)對(duì)不同化合物的定向行為反應(yīng)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)檢驗(yàn)(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小葉榕和垂葉榕葉片揮發(fā)物成分及相對(duì)含量

經(jīng)GC-MS鑒定，從小葉榕和垂葉榕健康葉中共分離出53種揮發(fā)物成分(表1)。小葉榕葉片揮發(fā)物中，相對(duì)含量較高的是3-乙基苯乙酮和4-乙基苯乙酮，分別占揮發(fā)物總量的(15.62±0.28)%和(10.33±0.22)%；垂葉榕葉片揮發(fā)物中，相對(duì)含量較高的是β-石竹烯和β-羅勒烯，分別占揮發(fā)物總量的(24.05±0.52)%和(21.30±0.62)%。

表1 小葉榕和垂葉榕葉片揮發(fā)物成分及相對(duì)含量Table 1 The composition and relative quantities of F.concinna and F.benjamina blade volatiles

續(xù)表1

2.2 朱紅毛斑蛾成蟲(chóng)對(duì)榕樹(shù)揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)

研究發(fā)現(xiàn)，朱紅毛斑蛾雌雄蟲(chóng)對(duì)小葉榕和垂葉榕葉片揮發(fā)物有觸角電位反應(yīng)的物質(zhì)共31種(表2)。其中，在小葉榕和垂葉榕葉片揮發(fā)物中同時(shí)存在的有9種，分別為甲苯、β-月桂烯、D-檸檬烯、β-羅勒烯、4-異丙基苯甲醇、3-乙基苯乙酮、4-乙基苯乙酮、(-)-α-蒎烯和β-石竹烯。

表2 朱紅毛斑蛾成蟲(chóng)對(duì)榕樹(shù)揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)Table 2 The GC-EAD responses of Phauda flammans adults to blade volatiles isolated from two Ficus species

2.3 朱紅毛斑蛾成蟲(chóng)對(duì)榕樹(shù)揮發(fā)物的定向行為反應(yīng)

選取小葉榕和垂葉榕特有的 β-月桂烯、 D-檸檬烯、 β-羅勒烯、 (-)-α-蒎烯和 β-石竹烯共5種揮發(fā)物進(jìn)行定向行為反應(yīng)的研究(表3)。結(jié)果表明，朱紅毛斑蛾雌雄蟲(chóng)對(duì)D-檸檬烯(雌:t＝4.438，df＝ 8，P＜0.01；雄:t＝3.162，df＝ 8，P＜0.05)、β-羅勒烯 (雌:t＝ 13.856，df＝8，P＜0.001； 雄:t＝ 3.336，df＝ 8，P＜0.05) 和 β-石竹烯(雌:t＝3.889，df＝8，P＜0.01；雄:t＝3.883，df＝8，P＜0.01)的反應(yīng)率均顯著高于對(duì)照。然而， 朱紅毛斑蛾雌雄蟲(chóng)對(duì)(-)-α-蒎烯(雌:t＝0.943， df＝8， P＝0.373； 雄:t＝0.385， df＝8， P＝0.710)和 β-月桂烯(雌:t＝2.000， df＝8， P＝0.081； 雄:t＝ 2.000， df＝8， P＝0.081)的反應(yīng)率與對(duì)照間均無(wú)顯著差異。

表3 朱紅毛斑蛾成蟲(chóng)對(duì)榕樹(shù)揮發(fā)物的定向行為反應(yīng)Table 3 Orientated behavioral responses of Phauda flammans adults to blade volatiles isolated from F.concinna and F.benjamina

3 討論與結(jié)論

植食性昆蟲(chóng)對(duì)寄主植物的選擇至關(guān)重要，因?yàn)檫@與其種群繁衍密切相關(guān)。對(duì)于全變態(tài)昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，除了一些活動(dòng)能力較強(qiáng)的鱗翅目昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，子代寄主的選擇通常由雌蟲(chóng)決定。母親最知情(mother knows best)假說(shuō)認(rèn)為，雌蟲(chóng)會(huì)選擇在子代較喜歡且適合的寄主上產(chǎn)卵，以最大限度地提高其種群存活率[16]。而雌蟲(chóng)在寄主定位過(guò)程中，植物釋放的揮發(fā)物活性成分起著關(guān)鍵作用。例如，羅勒烯對(duì)星天牛(Anoplophora chinensis Forster)雌成蟲(chóng)具有顯著的引誘作用[14]；3-蒈烯和水芹烯對(duì)松癭小卷蛾(Cydia zebeana Ratzeburg)雌成蟲(chóng)具有引誘作用[17]；壬醛和葵醛對(duì)馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaea operculella Zeller)雌成蟲(chóng)有引誘作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，選取的小葉榕和垂葉榕特有的5種揮發(fā)物中的β-羅勒烯、β-石竹烯和D-檸檬烯均對(duì)朱紅毛斑蛾雌蟲(chóng)具有顯著的引誘作用(表3)，認(rèn)為這3種物質(zhì)是吸引朱紅毛斑蛾雌蟲(chóng)寄主定位的主要物質(zhì)。

植食性昆蟲(chóng)雄蟲(chóng)對(duì)寄主植物揮發(fā)物的趨向行為反應(yīng)也具有非常重要的生態(tài)學(xué)意義。通常情況下，雌蟲(chóng)利用寄主植物揮發(fā)物定位寄主作為產(chǎn)卵或交配場(chǎng)所，雄蟲(chóng)利用寄主植物揮發(fā)物定位寄主以尋求更高的覓偶機(jī)率[2，19]。本研究結(jié)果表明，β-羅勒烯、β-石竹烯和D-檸檬烯對(duì)朱紅毛斑蛾雄蟲(chóng)也有顯著的吸引作用(表3)，說(shuō)明朱紅毛斑蛾雄蟲(chóng)在無(wú)性信息素的介導(dǎo)下，也可依靠寄主植物揮發(fā)物定位寄主。通常條件下，性信息素和寄主植物揮發(fā)物在植食性昆蟲(chóng)雄蟲(chóng)的覓偶過(guò)程中會(huì)協(xié)同作用[20-21]。前期研究表明，朱紅毛斑蛾雌蟲(chóng)釋放的性信息素對(duì)雄蟲(chóng)具有顯著的引誘作用[9]?；谶@些結(jié)果，推測(cè)朱紅毛斑蛾雄蟲(chóng)在自然條件下的覓偶可能基于寄主植物揮發(fā)物和性信息素的協(xié)同作用，但其協(xié)同作用機(jī)制尚需深入研究。

本研究中的(-)-α-蒎烯和 β-月桂烯對(duì)朱紅毛斑蛾雌雄蟲(chóng)無(wú)吸引或趨避作用，但(R)-α-蒎烯、(S)-α-蒎烯和β-月桂烯對(duì)松癭小卷蛾 (Cydia zebeana Ratzeburg)雌雄蟲(chóng)均具有驅(qū)避作用[17]；也有研究發(fā)現(xiàn)α-蒎烯對(duì)煙夜蛾(Helicoverpa assulta Guenée)和棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera Hübner)有顯著的吸引作用[22]。推測(cè)不同昆蟲(chóng)對(duì)同種植物揮發(fā)物活性成分定向行為的差異可能與活性成分的濃度、昆蟲(chóng)感覺(jué)信息的編碼和感受器結(jié)構(gòu)差異有關(guān)[1，23-24]；朱紅毛斑蛾雌雄蟲(chóng)在寄主定位過(guò)程中可能無(wú)需(-)-α-蒎烯和β-月桂烯的參與，因?yàn)樵诤芏嗬ハx(chóng)種類對(duì)寄主植物揮發(fā)物的行為反應(yīng)中，部分具有觸角電位活性成分的參與與否均不影響其定向行為反應(yīng)[25]，例如葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)[26]、葡萄漿果蛾(Paralobesia viteana Clemens)[27]和煙芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)[28]。

總之，小葉榕和垂葉榕相同的5種植物揮發(fā)物中的D-檸檬烯、β-羅勒烯和β-石竹烯對(duì)朱紅毛斑蛾雌雄蟲(chóng)均有顯著的吸引作用，朱紅毛斑蛾植物源引誘劑的研發(fā)可以這3種物質(zhì)為核心成分，但其具體的配比、野外誘捕效果等還需進(jìn)一步研究。