杜超群， 許業(yè)洲， 孫曉梅

(1.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，湖北武漢430075；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實驗室，北京100091)

種子園的建立是針葉樹育種最有效的方法之一。種子園通過有性過程生產(chǎn)改良種子，既要獲得較高的遺傳增益，又必需保持較寬的遺傳基礎(chǔ)[1]，保證所生產(chǎn)的種子具有一定的遺傳多樣性，這對確保種子育苗所營造的林分具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，尤其對避免極端氣候等環(huán)境因子造成林分損失至關(guān)重要[2]。

日本落葉松[Larix kaempferi(Lamb.)Carr.]在我國已有一百多年的引種栽培歷史，是我國北方重要的用材樹種之一，目前已成為鄂西亞高山地區(qū)的主要造林樹種。湖北省建始縣長嶺崗林場是我國南方唯一的日本落葉松國家良種基地，該基地營建的日本落葉松種子園是當(dāng)?shù)丶爸苓叺貐^(qū)主要的種子來源地，近20 a累計供應(yīng)良種超過3 000 kg，大大提高了該區(qū)域日本落葉松人工林的良種化水平[3]。針對日本落葉松種子園的早期研究大多是基于表型數(shù)據(jù)的評估和選擇[3-5]。由于建園的材料來源于多個省份，可推測其遺傳多樣性十分豐富，但其遺傳多樣性的現(xiàn)狀及特點(diǎn)目前尚未有研究報道。目前日本落葉松種子園仍然同時具有生產(chǎn)群體和育種群體的功能，只有清楚地掌握種子園群體的遺傳基礎(chǔ)和遺傳結(jié)構(gòu)，才能確保大規(guī)模人工造林的生態(tài)安全，才能有效地開展具有發(fā)展?jié)摿Φ男缕贩N創(chuàng)制[6]。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記已成為生物信息學(xué)最重要的研究手段之一。利用分子標(biāo)記技術(shù)可以實現(xiàn)物種各群體遺傳學(xué)參數(shù)及親緣關(guān)系的快速分析[6]，已被普遍應(yīng)用于群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)等研究中[7]，其中簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記由于具有操作簡單、多態(tài)性高、信息量大和共顯性等優(yōu)越性，且在種間的通用性高，能夠很好地滿足遺傳多樣性等研究要求[8-9]。目前，雖然SSR標(biāo)記已被用于日本落葉松遺傳多樣性的研究中[10-12]，但報道不多，而且以往的研究所涉及的SSR標(biāo)記數(shù)量較少。本研究以湖北省建始縣長嶺崗林場日本落葉松改良種子園無性系為對象，利用本課題組開發(fā)出來的、多態(tài)性較好的16個表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(expressed sequence tag-SSR，EST-SSR)標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析和評價，旨在明確種子園的遺傳基礎(chǔ)，為后期育種策略的制定和遺傳改良的可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

日本落葉松改良種子園位于湖北省建始縣長嶺崗林場日本落葉松國家良種基地，北緯30°48′，東經(jīng)110°03′，海拔1 600～1 720 m，屬內(nèi)陸性冷涼氣候帶高山多雨潮濕區(qū)，年平均氣溫7～8℃，平均最低氣溫-9.4℃，年降水量1 600～1 800 mm，土壤為山地黃棕壤。該種子園的建園時間為1989—1997年，面積49.5 hm2，是在初級種子園的基礎(chǔ)上通過去劣留優(yōu)改建而成的，建園的材料為來自遼寧、山東、內(nèi)蒙古、甘肅及本場母樹林的優(yōu)樹穗條，以2年生實生苗為砧木嫁接成無性系，初植密度為416～625株·hm-2。2008年，根據(jù)生長和結(jié)實情況對種子園進(jìn)行去劣疏伐，保留密度為250～318株·hm-2，保存無性系145個，不同來源的群體分別標(biāo)記為湖北(Hubei，HB)、遼寧(Liaoning，LN)、內(nèi)蒙古(Inner Mongolia，IM)、山東(Shandong，SD)、甘肅(Gansu，GS)，具體情況如表1所示。

表1 種子園材料來源Table 1 Seed orchard material source

1.2 試驗方法

采集種子園145個無性系(每系號1株)的嫩葉，硅膠干燥后置于超低溫冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆?。采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB)法提取基因組DNA[10]。試驗所用的16個SSR標(biāo)記見表2，引物信息與CHENetal[12]相同，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。標(biāo)記擴(kuò)增和數(shù)據(jù)讀取整理等參照CHENetal[12]的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GenAlex 6.41軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括遺傳參數(shù)的估算、各位點(diǎn)哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)卡方檢驗、分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)、群體間遺傳距離和遺傳相似性以及主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)。估算的遺傳參數(shù)有:觀測等位基因數(shù)(number of observed alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(number of effective alleles，Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、Shannon多樣性指數(shù)、群體內(nèi)近交系數(shù)(inbreeding coefficient in population，F(xiàn)is)、群體總近交系數(shù)(total inbreeding coefficient of population，F(xiàn)it)、基因分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient，F(xiàn)st)、基因流(gene flow，Nm)。利用Power Marker version 3.25軟件計算群體多態(tài)性信息含量指數(shù)(polymorphism information content index，PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 簡單重復(fù)序列位點(diǎn)多態(tài)性分析

16對引物的多態(tài)性表現(xiàn)見表2。145份材料共檢測到82個等位基因，每個位點(diǎn)的Na為2～12個不等，平均Ne為2.542，平均Ho為0.578，平均He為0.528，平均Shannon多樣性指數(shù)為0.972。其中QL397位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)最多，Ne和He最大(分別為5.831和0.828)，Shannon多樣性指數(shù)最高(1.966)；HL391位點(diǎn)的Ne和He最小(分別為1.192和0.158)，Shannon多樣性指數(shù)最低(0.315)，說明各個位點(diǎn)對研究群體遺傳多樣性的檢測能力和效果不同。16個位點(diǎn)的PIC在0.156～0.818之間，平均值為0.485，其中PIC大于0.500的位點(diǎn)有9個，為高度多態(tài)性位點(diǎn)，表明所選SSR引物能有效揭示群體遺傳多樣性。

表2 SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析Table 2 Polymorphism analysis of SSR primers

2.2 位點(diǎn)哈迪-溫伯格平衡卡方檢驗

16個SSR位點(diǎn)的F統(tǒng)計量檢測結(jié)果顯示(表3)，日本落葉松改良種子園的Fst平均值為0.023，說明群體間遺傳分化程度較?。籉is、Fit均為負(fù)值，群體表現(xiàn)為輕微雜合子過量，不存在近交衰退；Nm平均值為13.932，遠(yuǎn)高于自然群體，也說明遺傳分化較小[2]。

表3 F統(tǒng)計量和基因流Table 3 Summary of F-statistics and gene flow

分別對不同來源的5個群體進(jìn)行HWE卡方檢驗(表4)，整體來看，5個群體中大部分位點(diǎn)均符合HWE(P≥0.05)，其中GS群體所有位點(diǎn)均符合，HB和IM群體均有1個位點(diǎn)偏離平衡，LN群體中偏離平衡的位點(diǎn)最多(4個)。另外分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)H52位點(diǎn)在4個群體中均顯著偏離HWE。

表4 不同群體各位點(diǎn)哈迪-溫伯格平衡卡方檢驗Table 4 HWE chi-square test for each locus of different populations

2.3 群體遺傳多樣性參數(shù)比較

5個群體的遺傳多樣性參數(shù)見表5。群體之間各參數(shù)值相差不大，Ne在2.363～2.675之間，Ho為0.559～0.600，He為0.507～0.545，平均Shannon多樣性指數(shù)為0.933～1.007。在遺傳多樣性評價中，多用Shannon多樣性指數(shù)、He和Ne這3個指標(biāo)來衡量群體遺傳多樣性的大小[2，6，9]。相對來說，LN群體的Ne和Shannon多樣性指數(shù)最高，IM群體最低；HB和LN群體的He相等，在5個群體中最高，IM群體仍為最低。按照Shannon多樣性指數(shù)值進(jìn)行排序，5個群體遺傳多樣性從高到低的順序為:LN＞HB＞SD＞GS＞IM。

表5 不同群體遺傳多樣性參數(shù)Table 5 Genetic diversity parameters of different populations

2.4 群體間遺傳分化

通過計算群體間遺傳距離和遺傳相似性可知(表6):5個群體遺傳距離較小，在0.002～0.015之間，遺傳相似性的平均值為0.992。其中遺傳距離最小的群體為SD和GS、HB和LN，遺傳距離最大的為HB和IM之間。AMOVA分析結(jié)果表明，群體間的變異僅占1.71%，98.29%的變異存在于群體內(nèi)，說明群體間的遺傳分化非常小?；赟SR遺傳距離的PCoA分析結(jié)果如圖1所示。5個群體的分布區(qū)域相互交叉重疊，群體之間沒有明顯的聚集，甚至可以觀察到來自不同群體的個體有重合現(xiàn)象，說明遺傳基礎(chǔ)比較相似。

3 討論與結(jié)論

日本落葉松原產(chǎn)地位于日本本州島中部山區(qū)，歐洲和北美均有引種，我國是最早引種的國家之一，山東省是我國有歷史記載引種最早的省份，遼寧、吉林、甘肅、內(nèi)蒙古、黑龍江、河南、四川、湖北、湖南等地均有大規(guī)模引種栽培[13]。目前國內(nèi)所有的資源均為20世紀(jì)引種資源，雖然日本落葉松育種已進(jìn)入第二代，但是二代育種群體主要來源于種子園子代測定林[14]，二代生產(chǎn)群體(二代種子園)還未進(jìn)入生產(chǎn)階段，因此，目前改良代種子園仍然是我國日本落葉松人工林良種的主要來源，也是國內(nèi)種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)的重要保障。

表6 群體間遺傳距離(左下角)與遺傳相似性(右上角)Table 6 Genetic distance between populations(lower left)and genetic similarity(upper right)

圖1 基于遺傳距離的主坐標(biāo)分析Figure 1 PCoA analysis based on genetic distance

松屬樹種的遺傳多樣性研究已獲得較大的進(jìn)展，馬尾松(PinusmassonianaLamb.)種子園Shannon多樣性指數(shù)為0.468～0.477[15]，濕加松(Pinuselliottii×P.oaribaea)親本群體平均雜合度為0.144～0.884[16]，白皮松(PinusbungeanaZucc.)天然群體 He和 Shannon多樣性指數(shù)分別為 0.118～0.333和0.195～0.495[17]，紅松(PinuskoraiensisSieb.et Zucc.)天然群體及種子園Shannon多樣性指數(shù)分別為0.262和0.267[18]，華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtiiMayr.)1～3代種子園的He和Shannon多樣性指數(shù)分別為0.418～0.479和0.705～0.791[2]。本研究對日本落葉松種子園145個無性系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)每個標(biāo)記檢測到的等位基因數(shù)目為2～12個，平均Ne為2.542，平均Ho為0.578，平均He為0.528，平均Shannon多樣性指數(shù)為0.972，平均PIC為0.485。與其他松屬樹種相比，日本落葉松種子園遺傳多樣性相對較高。

一般來說，地理環(huán)境比如海拔、經(jīng)緯度等的差異容易使同一物種不同居群之間產(chǎn)生明顯的遺傳分化[9]，如萬愛華等[15]對來自8個省份的馬尾松種子園無性系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與緯度和地理距離的相關(guān)性均比較明顯；王小平等[19]、趙罕等[17]分析了白皮松群體的地理變異規(guī)律，無論是表型性狀(球果、種子)還是遺傳結(jié)構(gòu)均存在明顯的差異。日本落葉松種子園不同來源的群體按照Shannon多樣性指數(shù)進(jìn)行排序，從高到低的順序為:LN＞HB＞SD＞GS＞IM，但是群體間遺傳多樣性各參數(shù)值差異不大；計算群體間的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，5個群體之間遺傳距離較小(0.002～0.015之間)。分子方差分析結(jié)果表明，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，僅有1.71%存在于群體間，說明群體間的遺傳分化非常小；PCoA分析結(jié)果更為直觀地反映出5個群體遺傳基礎(chǔ)相似，沒有明顯的聚類。種子園中的材料雖然引自5個不同省份，但是日本落葉松作為外來樹種，直接從原產(chǎn)地引種的機(jī)會較少，國內(nèi)種植材料引種交流非常頻繁，因此遺傳背景逐漸趨于類似，檢測不到明顯的分化。

在多世代育種進(jìn)程中，維持育種群體較寬的遺傳基礎(chǔ)對于提升育種效果至關(guān)重要[10]。雖然國內(nèi)日本落葉松種子園群體遺傳多樣性較高，但是與原產(chǎn)地相比(He為0.717～0.795，PIC為0.720)[11]，還有很大的提升空間，從育種區(qū)外或者說原產(chǎn)地引進(jìn)優(yōu)良資源補(bǔ)充進(jìn)入育種群體，可以有效提高遺傳多樣性，拓寬遺傳基礎(chǔ)。另外，遺傳多樣性隨著遺傳改良進(jìn)程的變化狀況也是育種者和生產(chǎn)者十分關(guān)注的問題，下一步可開展相關(guān)研究和探討。